靶向CEA嵌合抗原受體表達(dá)載體的構(gòu)建與慢病毒制備

惡性腫瘤的診治一直是國內(nèi)外探索的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，盡管外科手術(shù)進(jìn)展迅速，新型化療藥物不斷被研發(fā)，放療技術(shù)手段有所進(jìn)步，惡性腫瘤治療不斷多樣化，但均難取得一個(gè)長(zhǎng)久的預(yù)后，使得抗腫瘤新方法的研究更加迫切。嵌合抗原受體修飾T淋巴細(xì)胞(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)技術(shù)是一種可以使改造后T淋巴細(xì)胞具備識(shí)別特定腫瘤抗原的能力、且不受主要組織相容性復(fù)合物(main histocompatibility complex,MHC)的限制直接殺傷腫瘤細(xì)胞的技術(shù)。該技術(shù)是利用基因工程方法，將特異性識(shí)別腫瘤抗原的單鏈抗體、T細(xì)胞鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)等結(jié)合為一體，修飾T淋巴細(xì)胞

，發(fā)揮靶向殺傷作用。靶向CD19 CAR-T在白血病治療中已取得可喜的治療效果，細(xì)胞治療產(chǎn)品已通過了美國FDA批準(zhǔn)，同時(shí)，針對(duì)實(shí)體瘤的CAR也在積極的研究之中

。

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是人類結(jié)直腸癌中表達(dá)率很高的腫瘤相關(guān)抗原，而且在其他類型的腫瘤中也表達(dá)增加，比如胰腺癌、胃癌等。CEA作為一個(gè)重要的腫瘤標(biāo)志物，其單克隆抗體(hMN-14、BW431/26、M5A、C2-45等)被廣泛應(yīng)用于腫瘤診斷及放射免疫治療之中

。本研究選取CEA單克隆抗體C2-45可變區(qū)(scFv)，構(gòu)建靶向CEA的CAR，為治療CEA陽性腫瘤提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

293T細(xì)胞及感受態(tài)DH5α細(xì)胞(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存)。DNA凝膠回收試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司 YT010)，質(zhì)粒小提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司 DP103-02)，限制性內(nèi)切酶(中國賽默飛世爾科技有限公司9015-85-4)，T4NDA ligase(大連寶生物工程有限公司TP302-56)，鼠抗人CD3ζ抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司65133-1-Ig)，DMEM培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司11995)，170-8170凝膠成像儀(美國Applied Biosyst公司ZF288)，PCR儀(美國BIO-RAD公司2720)，質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存)。

嗅聞試驗(yàn)結(jié)束后,立即將小鼠移入自主活動(dòng)測(cè)試箱,記錄5 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)總路程(TD)、平均速度(MS)、靜止時(shí)間(TRD)。

1.2.1 嵌合抗原受體基因序列設(shè)計(jì)：CAR中CEA scFv(750 bp)來自CEA 單克隆抗體C2-45的可變區(qū)

，含有Hinge-TM-CD137-CD3ζ表達(dá)框基因的質(zhì)粒為質(zhì)粒pCLK1，鉸鏈區(qū)及跨膜區(qū)來自CD8α(Genbank：BC025715.1)、CD137共刺激分子(Genbank：U03397.1)及CD3ζ(Genbank：J04132.1)。

1.2.5 病毒滴度測(cè)定：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化稀釋后定量加入96孔板，放入37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取4個(gè)干凈的微量離心管，每個(gè)微量離心管中均加入90 μl培養(yǎng)液，然后往第一個(gè)管中加入10 μl病毒原液，混勻后，吸取第一個(gè)混勻微量離心管中的液體10 μl加入第2個(gè)微量離心管中，以此類推，做4個(gè)稀釋度。然后吸取96孔板中原來的培養(yǎng)基，加入稀釋過的病毒原液，4 d后，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞情況并且計(jì)算滴度。

1.2.3 pCDH-C2-45/CAR的鑒定：轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性LB平板篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒DNA后進(jìn)行酶切和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與CEA scFv對(duì)比分析。

根據(jù)酶切位點(diǎn)特點(diǎn)，選擇限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI，對(duì)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro進(jìn)行雙酶切線性化處理，酶切后進(jìn)行凝膠電泳，其長(zhǎng)度為8 189 bp，凝膠成像系統(tǒng)成像顯示酶切產(chǎn)物與預(yù)計(jì)大小相符，凝膠成像如圖3所示。

1.2.4 慢病毒制備：用慢病毒包裝試劑盒對(duì)質(zhì)粒pCDH-C2-45/CAR和pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro(對(duì)照)進(jìn)行慢病毒包裝，制備包含嵌合抗原受體C2-45/CAR慢病毒和對(duì)照空載體慢病毒，分別命名為L(zhǎng)V-C2-45/CAR和LV-pCDH。制備成功后將慢病毒分裝，保存于-80 ℃。

1.2.2 pCDH-C2-45/CAR的構(gòu)建：Hinge-TM-CD137-CD3ζ和CEAscFv兩個(gè)基因片段通過重疊延伸PCR(SOE.PCR)進(jìn)行連接,然后克隆入載體pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro的XbaI和BamHI位點(diǎn)，完成嵌合抗原受體重組載體pCDH-C2-45/CAR構(gòu)建。上述每一步結(jié)束后需將電泳后凝膠放入全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中，采集圖像，并對(duì)凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)C2-45/CAR表達(dá)：收集慢病毒感染后的293T細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取，檢測(cè)嵌合抗原受體C2-45/CAR在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況，分別提取293T細(xì)胞蛋白組作為空白對(duì)照組，提取LV-pCDH感染293T細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，提取LV-C2-45/CAR感染293T細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。目的基因C2-45/CAR在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況，采用Western blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，一抗選用鼠抗人CD3ζ抗體。

2 結(jié)果

多年來，腫瘤治療一直是困擾人類的難題之一。常規(guī)治療手段如手術(shù)、化療、放療各有局限，隨著基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞免疫治療逐步引起人們的關(guān)注。近年來，CAR修飾T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞抗腫瘤技術(shù)得到迅速發(fā)展，其抗腫瘤原理是CAR胞外抗原結(jié)合區(qū)可以特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原及配體，CAR的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)將相對(duì)應(yīng)的信號(hào)傳遞至免疫細(xì)胞內(nèi)，CAR胞內(nèi)信號(hào)域?qū)⑿盘?hào)轉(zhuǎn)化為活化信號(hào)，從而起到激活T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的作用，使其能夠增殖、分泌細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞

。CAR修飾的T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞因?yàn)镃AR的結(jié)構(gòu)修飾，而使得T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞可以特異性識(shí)別特定腫瘤細(xì)胞，并以非MHC的方式殺傷腫瘤細(xì)胞

。與此同時(shí)，CAR修飾的免疫細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)可克服腫瘤微環(huán)境造成腫瘤的免疫逃逸。

將線性化載體pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro與C2-45/CAR拼接，并將重組后的質(zhì)粒命名為pCDH-C2-45/CAR。將pCDH-C2-45/CAR經(jīng)過轉(zhuǎn)化、進(jìn)行菌落PCR鑒定。從電泳凝膠成像可見單菌落1、3、7鑒定結(jié)果正確，電泳如圖4所示。

傳統(tǒng)分析儀表運(yùn)行時(shí)，操作人員通常會(huì)過量加藥來保證其正常運(yùn)行。例如鍋爐給水反滲透ORP值控制還原劑的加入量，循環(huán)汽水ORP值控制加氨量等。智能分析儀表信號(hào)穩(wěn)定可靠，藥劑的用量更為精準(zhǔn)和穩(wěn)定，避免了因人工操作而產(chǎn)生的加藥量不準(zhǔn)確、調(diào)控不穩(wěn)定和加藥時(shí)機(jī)不科學(xué)等問題，從而有效控制藥品消耗，使廢液排放指標(biāo)更為合理、環(huán)保。

質(zhì)粒pCLK1中Hinge-TM-CD137-CD3ζ基因序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物為Hinge-TM-CD137-CD3ζ基因片段(675 bp)，電泳后凝膠成像如圖2A所示；以質(zhì)粒pC2-45為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物為C2-45(750 bp)，電泳后凝膠成像如圖2B所示；以C2-45和CLK1為模板進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)征，產(chǎn)物為C2-45/CAR(1 420 bp)，電泳后凝膠成像如圖2C所示。上述所有電泳后凝膠成像系統(tǒng)可見獲得目的片段均與預(yù)期相符。

倒置熒光顯微鏡下觀察到293T細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，如圖5所示，其中圖5A為慢病毒LV-pCDH感染293T細(xì)胞后普通顯微鏡下圖像，圖5B為熒光顯微鏡下圖像，圖5C為慢病毒LV-C2-45/CAR感染293T細(xì)胞后普通顯微鏡下圖像，圖5D為熒光顯微鏡下圖像。慢病毒感染293T細(xì)胞后，用逐孔稀釋滴度測(cè)定法對(duì)兩種病毒進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，熒光顯微鏡下可見，隨著稀釋倍數(shù)的增加，熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)逐漸變少，根據(jù)公式計(jì)算出LV-C2-45/CAR和LV-pCDH慢病毒滴度約為1×10

TU/ml。計(jì)算公式：在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并數(shù)出最后兩個(gè)有熒光的熒光細(xì)胞克隆數(shù)。假設(shè)為X和Y，則滴度(TU/ml)=(X+Y×4)×1 000/2/X孔的病毒液的含量(μl)。

“具”字中間到底有幾橫？這個(gè)本不該存在分歧的問題，近期卻在網(wǎng)上吵翻了天?！皟蓹M派”力爭(zhēng)，稱小時(shí)候就這么學(xué)的；“三橫派”不甘示弱，堅(jiān)信自己的肌肉記憶不會(huì)錯(cuò)。亦不乏圍觀者心里嘀咕：“漢字是不是偷偷改革過”？甚至在一問答平臺(tái)上，這被劃歸為“有哪些讓人細(xì)思極恐的小故事”之列。令人啼笑皆非的討論，再次折射出提筆忘字、提筆錯(cuò)字的社會(huì)現(xiàn)象。

安全監(jiān)督管理平臺(tái)具有安全制度和實(shí)施規(guī)范管理、監(jiān)督檢查項(xiàng)與模板標(biāo)準(zhǔn)管理、監(jiān)督檢查計(jì)劃制定、實(shí)施、問題反饋、整改跟蹤、完成確認(rèn)功能，同時(shí)可對(duì)積累的問題和發(fā)現(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以整體改善和提高公司的隱患問題治理能力。由移動(dòng)終端、業(yè)務(wù)管理平臺(tái)、數(shù)據(jù)平臺(tái)三個(gè)組成部分組成，系統(tǒng)架構(gòu)如圖6。

Western blotting結(jié)果顯示：慢病毒LV-C2-45/CAR感染的293T細(xì)胞檢測(cè)到目的蛋白表達(dá)，陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組均無此蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖6。說明重組載體pCDH-C2-45/CAR中嵌合抗原受體C2-45/CAR表達(dá)成功，重組慢病毒表達(dá)載體pCDH-C2-45/CAR構(gòu)建成功。

測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)及NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，比對(duì)顯示一致，重組載體pCDH-C2-45/CAR構(gòu)建成功，部分測(cè)序結(jié)果如圖7所示。

對(duì)學(xué)生開展生活化教學(xué)的過程中，就可以為學(xué)生創(chuàng)設(shè)生活化情境，通過這種與學(xué)生有著十分緊密聯(lián)系的情境，就可以使課堂教學(xué)事半功倍。特別是在教學(xué)各種數(shù)學(xué)公式時(shí)，這些公式往往都比較抽象，只是講課難以有效的幫助學(xué)生理解其中的含義，通過創(chuàng)設(shè)相關(guān)的生活化情境，就可以更好的引導(dǎo)學(xué)生理解各種數(shù)學(xué)公式。例如，在教學(xué)“路程=速度×?xí)r間”的公式時(shí)，教師就可以提出一個(gè)生活化的問題，讓學(xué)生理解這個(gè)公式，如“小明的家到學(xué)校是300米，小明每天到學(xué)校需要10分鐘，那么小明走路的速度是多少？”教師通過引導(dǎo)學(xué)生解決這個(gè)問題的過程中，就可以更好的理解“路程=速度×?xí)r間”的公式，熟練應(yīng)用這個(gè)公式，從而有效的解決這類的問題。

3 討論

嵌合抗原受體由4部分組成，分別為胞外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)肽。本研究胞外抗原結(jié)合區(qū)選擇CEA單克隆抗體中的一個(gè)，即C2-45為本研究的胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)；跨膜區(qū)(TM)和鉸鏈區(qū)(Hinge)來自CD8α(aa135-205，Genbank：BC025715.1)；胞內(nèi)信號(hào)肽為共刺激分子CD137(aa214-255，Genbank：U03397.1)和免疫受體酪氨酸活化基序CD3ζ(aa52-163，Genbank：J04132.1)。C2-45與Hinge-TM-CD137-CD3ζ通過重疊延生PCR拼接成完整的C2-45/CAR，前段為信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，目的基因全長(zhǎng)為1 640 bp(見圖1)。

軟件工程專業(yè)的教育目標(biāo)是面向軟件與信息產(chǎn)業(yè)需求，培養(yǎng)學(xué)生能勝任軟件工程領(lǐng)域的科學(xué)研究、軟件開發(fā)和項(xiàng)目管理等崗位工作。面對(duì)大數(shù)據(jù)、人工智能、云計(jì)算、物聯(lián)網(wǎng)+、信息安全等新技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的行業(yè)背景，軟件設(shè)計(jì)與開發(fā)應(yīng)用的過程中，處理的對(duì)象呈現(xiàn)出大數(shù)據(jù)化、人工智能化和多媒體化需求的新特征，新的形勢(shì)對(duì)軟件工程專業(yè)人才培養(yǎng)的也提出了許多更新、更高的要求。

至今，CAR的發(fā)展已經(jīng)經(jīng)歷了四代。第一代CAR在人體內(nèi)增殖受限，可以誘導(dǎo)正常T淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡。第二代CAR在第一代的基礎(chǔ)上增加了一個(gè)共刺激信號(hào)(CD28或CD137)。使其在抗腫瘤方面具有更強(qiáng)的作用。第三代CAR可同時(shí)表達(dá)兩個(gè)共刺激信號(hào)，可分泌更多的細(xì)胞因子從而殺傷腫瘤細(xì)胞。但有研究結(jié)果顯示，只有第二代CAR能夠使CD3ζ激活，與第三代相比，具有更強(qiáng)勁的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用

。第四代CAR能夠在體內(nèi)產(chǎn)生特定細(xì)胞因子，使得腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境發(fā)生改變，從而誘導(dǎo)其他免疫反應(yīng)的發(fā)生。

2013年，美國費(fèi)城兒童醫(yī)院

報(bào)道，化療難治性急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)患兒經(jīng)過CAR-T治療后成功獲得了完全持久緩解狀態(tài)。自此，CAR-T細(xì)胞治療進(jìn)入公眾眼球。CAR-T細(xì)胞治療在許多血液系統(tǒng)腫瘤治療中取得了卓越的成績(jī)，例如，慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)和多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)

。大多數(shù)ALL、CLL、B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)中均有CD19表達(dá)

。因此，針對(duì)CD19的CAR-T療法可以通過將編碼腫瘤特異性受體的轉(zhuǎn)基因?qū)隩淋巴細(xì)胞來治療B淋巴細(xì)胞和特定靶向抗原的惡性腫瘤

。由于CAR-T細(xì)胞治療在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的顯著療效，使世界各地的研究者開始探索其能否在實(shí)體瘤的治療中具有較好的效果。目前，已有靶點(diǎn)為EGFRvⅢ的CAR修飾T細(xì)胞治療膠質(zhì)瘤臨床試驗(yàn)

，靶點(diǎn)為Her2的CAR修飾T細(xì)胞治療Her+肉瘤臨床試驗(yàn)

，靶點(diǎn)為MUC16的CAR修飾T細(xì)胞治療卵巢癌臨床試驗(yàn)

。

CEA作為經(jīng)典的腫瘤標(biāo)志物之一，廣泛地存在于胃腸道腫瘤之中，特別是結(jié)直腸癌和其他一些惡性腫瘤

。在正常組織中，只有消化道細(xì)胞中有少量CEA表達(dá)，但該CEA在生理?xiàng)l件表達(dá)方向朝向腔內(nèi)，從而避免了被靶向CEA的CAR-T細(xì)胞識(shí)別

。因此，CEA是CAR-T/NK治療CEA陽性實(shí)體瘤的理想靶點(diǎn)。針對(duì)CEA設(shè)計(jì)的CAR-T在國內(nèi)外已經(jīng)完成了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

及Ⅰ期臨床試驗(yàn)

，臨床試驗(yàn)顯示靶向CEA的CAR-T細(xì)胞對(duì)CEA陽性腫瘤有一定的治療效果，為腫瘤晚期患者提供了新的治療思路。

CAR修飾的免疫細(xì)胞識(shí)別腫瘤依賴于scFv與腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen，TAA)的識(shí)別，其避免了MHC的限制性，使得CAR修飾的免疫細(xì)胞可以攻擊免疫原性低的腫瘤，避免了腫瘤細(xì)胞通過下調(diào)MHC表達(dá)的免疫逃逸機(jī)制。選用合適的CEA scFv對(duì)于CAR-T細(xì)胞功能(識(shí)別、殺傷、免疫原性)至關(guān)重要，目前已有的人源化/人源的CEA scFv包括BW431/26

、hMN14

、T84.66

、M5A

、C2-45

。本研究選用scFv為C2-45，以此構(gòu)建CAR，旨在為靶向CEA的CAR修飾免疫細(xì)胞抗腫瘤研究提供新的方案。選擇CD8α相應(yīng)功能區(qū)、CD3ζ作為鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。為了使所設(shè)計(jì)CAR具有更好的抗腫瘤效果，選用CD137相關(guān)功能區(qū)作為共刺激分子可以激活T細(xì)胞和NK細(xì)胞，以期為今后的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

對(duì)于CAR-T治療實(shí)體瘤，面臨著治療效果不理想、細(xì)胞因子風(fēng)暴、移植物抗宿主病等挑戰(zhàn)，并且針對(duì)相同的靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)不同的CAR可能會(huì)出現(xiàn)不同的試驗(yàn)結(jié)果。CAR-T/NK治療實(shí)體瘤是非常有前景的治療方法，也為腫瘤晚期的患者帶來了新的希望。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成新的靶點(diǎn)為CEA的CAR，并獲得高滴度病毒顆粒，可為其后續(xù)針對(duì)CEA陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷研究提供基礎(chǔ)，為CEA陽性惡性腫瘤的治療提供新的選擇。

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