泰州地區(qū)雞白痢血清學(xué)調(diào)查及中藥體外抑菌效果研究

劉玉華，林建鵬，劉濱華

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

雞白痢是由雞白痢沙門(mén)氏菌感染所引起的一類雞細(xì)菌性傳染病，各品種雞均易感染，是對(duì)我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)危害較大的疾病之一。

雛雞感染后主要表現(xiàn)排灰白色糞便，腸道充血、腫脹，發(fā)病率和死亡率較高，給養(yǎng)雞場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。成年雞多為隱性感染，不表現(xiàn)臨床癥狀，但長(zhǎng)期攜帶病菌，并通過(guò)糞便向環(huán)境中排出病菌，通過(guò)糞便、墊料、空氣、飲水、飼料等水平傳播，成年雞主要是生殖器官感染，可導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋率下降，也可經(jīng)種蛋垂直傳播本病，出現(xiàn)死胚、死雛和弱雛。因此一旦雞群發(fā)生本病，將給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害。準(zhǔn)確的了解雞白痢流行情況，有利于及時(shí)采取有效的防控和凈化措施，減少雞白痢對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成的危害。由于目前國(guó)內(nèi)雞場(chǎng)還未使用疫苗預(yù)防雞白痢，因此可通過(guò)血清學(xué)調(diào)查了解雞白痢的流行情況。中藥防治雞白痢與抗生素相比，具有不易產(chǎn)生耐藥性，毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)血清學(xué)方法調(diào)查泰州地區(qū)雞白痢流行情況，分離出本地雞白痢沙門(mén)氏菌流行株，并選取中藥對(duì)所分離的雞白痢沙門(mén)氏菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，為中藥防治泰州本地雞白痢沙門(mén)氏菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病 料 疑似雞白痢病死雞病變的心臟、肝臟等。

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑 麥康凱瓊脂來(lái)自?shī)W博星生物技術(shù)有限公司、生化反應(yīng)管來(lái)自杭州天和微生物試劑有限公司。雞白痢沙門(mén)菌多價(jià)血清型陽(yáng)性血清來(lái)自北京中海動(dòng)?？萍加邢薰?。

1.1.3 中草藥 黃芩、黃連、金銀花、魚(yú)腥草等購(gòu)自本地藥店。

1.1.4 儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、生物顯微鏡、高壓蒸汽滅菌器、酒精燈、超凈工作臺(tái)等。

1.2 方 法

1.2.1 雞白痢血清學(xué)調(diào)查 泰州地區(qū)5個(gè)雞場(chǎng)，每個(gè)雞場(chǎng)隨機(jī)選取30只雞，共150只雞，每只雞翅靜脈采血1～2mL。3000 r/min離心10min，吸取上層血清作為待檢血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)。吸取50μL雞白痢凝集反應(yīng)抗原垂直滴在玻璃板上，然后吸取50μL待檢血清與雞白痢凝集反應(yīng)抗原充分混勻，2min內(nèi)判定結(jié)果。出現(xiàn)50%以上凝集者判為陽(yáng)性，不發(fā)生凝集者判為陰性，介于兩者之間的判為可疑。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 取病料劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基表面，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h，挑取疑似沙門(mén)氏菌的菌落（露滴狀、灰白色菌落）接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，觀察長(zhǎng)出的菌落特征。

1.2.3 革蘭氏染色、鏡檢 接種環(huán)挑取純化的疑似沙門(mén)氏菌落進(jìn)行細(xì)菌涂片，革蘭氏染色、鏡檢。革蘭氏染色方法如下:（1）在已干燥、固定好的細(xì)菌涂片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液覆蓋涂面，1min后水洗。（2）滴加革蘭氏碘液覆蓋涂面，1min后水洗。（3）滴加95%酒精覆蓋涂面，0.5min后水洗。（4）滴加石炭酸復(fù)紅覆蓋涂面，0.5min后水洗。（5）用吸水紙吸干標(biāo)本片，油鏡鏡檢。

1.2.4 生化試驗(yàn) 挑取麥康凱瓊脂上純化的疑似單菌落接種到M-肉湯里37℃培養(yǎng)12h。吸取純化菌落的培養(yǎng)物分別接種到葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、硫化氫、MR、VP、吲哚、枸櫞酸鹽等生化反應(yīng)管內(nèi)，放入37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24h，觀察判斷結(jié)果。

1.2.5 血清學(xué)鑒定 吸取50μL純化菌落的培養(yǎng)物滴到玻璃板上，再吸取50μL雞白痢沙門(mén)菌陽(yáng)性血清與之充分混勻，在2min以內(nèi)觀察反應(yīng)結(jié)果。出現(xiàn)明顯的顆粒凝集者判為陽(yáng)性。同時(shí)設(shè)置生理鹽水陰性對(duì)照組。

1.2.6 體外抑菌試驗(yàn) 采用煎煮法分別提取黃連、黃芩、連翹、夏枯草、金銀花、馬齒莧中的有效成分，采用平板瓊脂打孔法測(cè)定這6種中藥對(duì)雞白痢沙門(mén)菌的抑菌圈直徑，比較這6種中藥對(duì)雞白痢沙門(mén)菌的體外抑菌效果。首先制備中藥煎煮液，方法如下：6種中藥分別稱取50g，加入500mL蒸餾水，在室溫下浸泡30min，然后煮沸，再文火煎煮，1h后煎煮液通過(guò)無(wú)菌紗布過(guò)濾，向?yàn)V渣中加入250mL水，加熱至沸騰，煮沸30min，無(wú)菌紗布過(guò)濾，2次濾液合并在一起，在70℃水浴鍋內(nèi)濃縮到50mL，即可獲得濃度為1g/mL的藥液。藥液裝入容器內(nèi)，流通蒸汽滅菌法滅菌30min,放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?。接著進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，即選用平板瓊脂打孔法，測(cè)定中藥抑菌圈的直徑大小，方法如下：將菌液濃度調(diào)整到107～108CFU/mL，取0.1mL涂布于瓊脂平板表面，待菌液被完全吸收，用打孔器進(jìn)行打孔，每孔內(nèi)滴加中藥藥液。37℃恒溫箱培養(yǎng)12～16h，觀察并且測(cè)量中藥抑菌圈的直徑。

判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑在10mm以下者為不敏感；10～15mm者為中敏；15mm以上者為高敏。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞白痢血清學(xué)調(diào)查雞白痢血清學(xué)調(diào)查結(jié)果（見(jiàn)表1）顯示，共檢出陽(yáng)性樣品26份，雞白痢平均陽(yáng)性率為17.3%，表明泰州雞場(chǎng)存在一定程度的雞白痢沙門(mén)氏菌感染。

表1 雞白痢血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

統(tǒng)計(jì)不同養(yǎng)殖模式雞場(chǎng)的血清學(xué)調(diào)查情況，結(jié)果（見(jiàn)表2）發(fā)現(xiàn)，1家林下散養(yǎng)雞，30只雞中檢出陽(yáng)性樣品2份，雞白痢陽(yáng)性率為6.7%。2家平養(yǎng)雞，60只雞中檢出陽(yáng)性樣品19份，雞白痢陽(yáng)性率31.7%。2家籠養(yǎng)雞，60只雞中檢出陽(yáng)性樣品5份，雞白痢陽(yáng)性率為8.3%。表明平養(yǎng)雞雞白痢感染率較高，可能與平養(yǎng)雞飼養(yǎng)密度大，雞白痢沙門(mén)菌容易通過(guò)糞便、墊料等傳播有關(guān)，所以平養(yǎng)雞更要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，搞好環(huán)境衛(wèi)生，做到嚴(yán)格消毒，以減少病原的傳播，降低雞白痢的陽(yáng)性率。

表2 不同養(yǎng)殖模式下雞白痢血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果對(duì)泰州地區(qū)5家雞場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，從疑似雞白痢病死雞中采集病料9份。通過(guò)從采集的病料中分離培養(yǎng)細(xì)菌、對(duì)分離的菌株進(jìn)行革蘭氏染色與鏡檢、生化鑒定，血清學(xué)鑒定，共分離鑒定雞白痢沙門(mén)氏菌5株。為進(jìn)一步研究本地致病性雞白痢沙門(mén)氏菌株的特性，以采取更有針對(duì)性的措施防治本病奠定了基礎(chǔ)。

2.3 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果選用6種中藥對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雞白痢沙門(mén)氏菌對(duì)黃芩、連翹、黃連3種藥物高度敏感，抑菌圈直徑分別為20.24mm，19.33mm，18.15mm。對(duì)夏枯草中度敏感，抑菌圈直徑為13.73 mm。對(duì)金銀花、馬齒莧不敏感，抑菌圈直徑分別為8.20mm、6.55mm。表明黃芩、連翹、黃連3種中藥抑制雞白痢沙門(mén)氏菌的效果較好，提醒當(dāng)?shù)孬F醫(yī)人員在防治雞白痢時(shí)，可優(yōu)先選擇黃芩、連翹、黃連等抑菌效果好的中藥，不建議選用金銀花、馬齒莧等，為臨床用中藥防治雞白痢提供參考依據(jù)。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)前，雞白痢在許多雞場(chǎng)普遍存在，在部分雞場(chǎng)發(fā)病率較高，危害較大。如孫亮等對(duì)吉林省部分種雞場(chǎng)進(jìn)行血清流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示個(gè)體真實(shí)流行率為2.56%，董永毅等對(duì)江蘇省部分地區(qū)進(jìn)行雞白痢血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示平均陽(yáng)性率達(dá)25.5%，李照偉等對(duì)貴州省部分規(guī)?；u場(chǎng)進(jìn)行雞白痢血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示雞白痢平均陽(yáng)性率為83.87%。一些研究表明，用于防治雞白痢沙門(mén)氏菌的抗生素存在一定程度的耐藥現(xiàn)象，如王廣澤等測(cè)定96株雞白痢沙門(mén)菌分離株對(duì)9類21種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果顯示所有雞白痢沙門(mén)菌分離株均有不同程度的耐藥現(xiàn)象。但另一方面，一些中藥表現(xiàn)出了抑菌作用，如常超越等研究23種中藥對(duì)雞白痢沙門(mén)菌地方株S1、S2及標(biāo)準(zhǔn)株的體外抑菌試驗(yàn)效果，結(jié)果表明，雞白痢沙門(mén)菌地方株S1、S2對(duì)黃芩、連翹、五倍子等8種藥物極度敏感；對(duì)其他的中藥存在不同程度的敏感性。

本研究通過(guò)采用雞白痢平板凝集試驗(yàn)，對(duì)泰州地區(qū)雞白痢感染情況進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示雞白痢平均陽(yáng)性率為17.3%，統(tǒng)計(jì)不同養(yǎng)殖模式雞場(chǎng)的血清學(xué)調(diào)查情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平養(yǎng)雞場(chǎng)里雞白痢陽(yáng)性率最高為31.7%，為泰州地區(qū)防治雞白痢提供了流行病學(xué)依據(jù)。從5家雞場(chǎng)里疑似雞白痢病死雞病料中共分離鑒定雞白痢沙門(mén)氏菌5株，選用6種中藥對(duì)分離的雞白痢沙門(mén)氏菌株進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示，雞白痢沙門(mén)氏菌對(duì)黃芩、連翹、黃連3種藥物高度敏感，抑菌圈直徑分別為20.24mm、19.33mm、18.15mm。對(duì)夏枯草中度敏感，抑菌圈直徑為13.73mm。對(duì)金銀花、馬齒莧不敏感，抑菌圈直徑分別為8.20mm、6.55mm，根據(jù)體外抑菌結(jié)果指導(dǎo)臨床合理選用中藥防治雞白痢，可以提高治療效果，對(duì)提高養(yǎng)殖效益具有重要意義。

由于本病對(duì)幼雛致病強(qiáng)，死亡率高，又可垂直傳播，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失，為減少本病的發(fā)生，應(yīng)及時(shí)采取疫病凈化及綜合防治措施。如，定期調(diào)查本地雞白痢的流行情況；對(duì)種雞場(chǎng)加強(qiáng)檢疫，對(duì)陽(yáng)性雞，及時(shí)淘汰；加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，搞好環(huán)境衛(wèi)生、消毒工作；選用合適的中藥進(jìn)行防治等。