宏基因組二代測(cè)序在肺部感染患者病原體檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值*

陳婷婷，江文潔，華曉蘭，謝正福

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

臨床上的肺部感染主要是由多種病原體引起的肺實(shí)質(zhì)炎癥反應(yīng)。臨床上針對(duì)肺部感染，通常是根據(jù)痰、支氣管肺泡灌洗液和支刷物的涂片及培養(yǎng)（傳統(tǒng)方法）結(jié)果，并結(jié)合血清學(xué)檢測(cè)和胸部CT 來(lái)治療。肺部感染常見(jiàn)的病原體包括肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、衣原體、支原體等[1]。在抗生素尚未出現(xiàn)時(shí)，肺炎鏈球菌是肺部感染的第一大“殺手”，然而目前的情況已不是如此，即使有新的檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)，許多患者的病原體診斷仍不明確[2]。由于傳統(tǒng)方法和血清學(xué)方法檢出病原體的陽(yáng)性率不高，因此通常使用經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療。但有些患者合并基礎(chǔ)疾病或免疫功能低下，其肺部往往有混合感染，導(dǎo)致療效欠佳，因此快速、簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確地檢出病原體是治療肺部感染的第一要?jiǎng)?wù)。

宏基因組二代測(cè)序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）是通過(guò)對(duì)生物樣本中提取的核酸進(jìn)行高通量測(cè)序，獲取樣本中包含的微生物種類和豐度信息。據(jù)報(bào)道，mNGS 診斷感染性疾病的靈敏度和特異度分別為50.7%和85.7%，在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌、真菌、病毒和厭氧菌方面的靈敏度較高，且抗生素暴露對(duì)mNGS 的影響較小[3]。在肺部混合感染中，人類巨細(xì)胞病毒和日本肺孢子蟲(chóng)的混合感染最為常見(jiàn)，其次為銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌的混合感染，mNGS 的靈敏度明顯高于培養(yǎng)法[4]。此外，mNGS 檢測(cè)可用于鑒定培養(yǎng)為陰性或生長(zhǎng)緩慢的病原體，以及診斷罕見(jiàn)或不尋常的感染[5]。目前關(guān)于mNGS在肺部感染合并其他疾病中的研究較少，且大多集中在單一病種的研究。本研究回顧性分析了本院58 例肺部感染患者的mNGS結(jié)果，初步了解病原體的分布情況，評(píng)估在合并肺部基礎(chǔ)疾病時(shí)mNGS的表現(xiàn)，并與傳統(tǒng)方法和血清學(xué)檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比，為臨床抗感染治療提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2020 年11 月1 日至2021 年8月31日在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年呼吸內(nèi)科住院治療的58例肺部感染患者，符合社區(qū)獲得性肺炎（CAP）和醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）的診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）有受涼或被傳染的病史；（2）有咳嗽、咳痰、發(fā)熱、呼吸急促、呼吸困難等癥狀；（3）肺部有呼吸音粗、啰音、痰鳴音等體征；（4）胸片或胸部CT有浸潤(rùn)影等炎癥改變；（5）抽血化驗(yàn)提示血象升高或降低。排除能夠引起發(fā)熱、咳嗽、咳痰等癥狀的疾?。ㄈ缂毙灾夤苎?、慢性阻塞性肺病急性發(fā)作等）以及合并肺部腫瘤或自身免疫性疾病的患者。所有患者均行傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)及支氣管肺泡灌洗液mNGS。

58 例肺部感染患者中，男31 例，女27 例；年齡16～82 歲，平均（52.71±14.39）歲，40 歲以上患者占77.6%；根據(jù)既往病史、臨床癥狀、肺部體征、實(shí)驗(yàn)室檢查和胸部CT結(jié)果診斷出合并肺部基礎(chǔ)疾病患者43 例，包括肺結(jié)核19 例，支氣管擴(kuò)張14 例，胸腔積液8例，支氣管哮喘2例；臨床癥狀：咳嗽47例，發(fā)熱9 例，咯血2 例；炎癥指標(biāo)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高8 例，超敏C反應(yīng)蛋白升高18例，降鈣素原升高9例。

1.2 血清學(xué)檢測(cè) 治療前，留取患者清晨第一口痰液，進(jìn)行菌落培養(yǎng)、涂片檢查和抗酸染色，并完善早期血清學(xué)檢測(cè)，即通過(guò)抽血檢測(cè)病原體，包括GM實(shí)驗(yàn)、G試驗(yàn)、抗酸桿菌DNA定量、新型隱球菌乳膠凝集試驗(yàn)、九項(xiàng)呼吸道病原體IgM 抗體檢測(cè)（嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、呼吸道合胞病毒、腺病毒、Q 熱立克次體、甲型流感病毒、乙型流感病毒及副流感病毒抗體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型）。

1.3 傳統(tǒng)病原學(xué)檢查和mNGS 對(duì)所有患者進(jìn)行支氣管鏡檢查，行肺泡灌洗術(shù)，同時(shí)留取支刷物（BB）和2 份支氣管肺泡灌洗液（BALF），其中一份BALF 送本院檢驗(yàn)科進(jìn)行傳統(tǒng)病原學(xué)檢查（菌落培養(yǎng)、涂片、抗酸染色、GM實(shí)驗(yàn)、G試驗(yàn)），另一份外送杰毅生物公司或康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行病原體mNGS。所有mNGS 標(biāo)本的采集、運(yùn)輸和保存嚴(yán)格按照公司或檢驗(yàn)所的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范執(zhí)行。本研究mNGS僅對(duì)DNA 進(jìn)行測(cè)序，因此未將RNA 病毒納入分析范圍。

1.4 臨床解讀 由老年呼吸內(nèi)科兩位主治醫(yī)生和1 位影像科主治醫(yī)生組成的3 人小組，共同根據(jù)患者臨床癥狀、傳統(tǒng)和血清病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果、mNGS報(bào)告、胸部CT表現(xiàn)、抗生素療效及以往的臨床診療經(jīng)驗(yàn)等綜合判斷致患者肺部感染的相關(guān)病原體。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原體陽(yáng)性結(jié)果分布情況 通過(guò)3 種檢測(cè)方法共檢測(cè)出34種病原體，其中檢出細(xì)菌24種，真菌4 種，病毒5 種，非典型病原體1 種。58 例患者中，mNGS檢出符合肺部感染診斷的病例數(shù)為42例，檢出率72.41%；傳統(tǒng)方法檢出符合肺部感染診斷的病例數(shù)為14 例，檢出率24.14%；血清學(xué)檢出符合肺部感染診斷的病例數(shù)為15例，檢出率25.86%。

3種檢測(cè)方法檢出同一種病原體僅有3例，檢出率為5.17%，檢出病原體為曲霉菌（2例）和結(jié)核分枝桿菌（1 例）。3 種方法共檢出152 株病原體，mNGS共檢出86 株病原體，檢出率為56.58%，以細(xì)菌最為常見(jiàn)，其中分枝桿菌占19.82%，緩癥鏈球菌占9.39%，銅綠假單胞菌和肺炎鏈球菌均占5.86%，口腔鏈球菌占3.54%，肺炎克雷伯菌占2.32%；其次為真菌，最后為病毒。分枝桿菌中，結(jié)核分枝桿菌占58.82%，非結(jié)核分枝桿菌占41.18%；非結(jié)核分枝桿菌中又以膿腫分枝桿菌最為常見(jiàn)，占42.86%，龜分枝桿菌、副偶然分枝桿菌、鳥(niǎo)型分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌各占14.29%；真菌中最常見(jiàn)為曲霉菌；病毒中最常見(jiàn)為EB病毒，見(jiàn)圖1。

圖1 mNGS檢出病原體的分布圖

傳統(tǒng)方法共檢出28株病原體，檢出率為18.42%，以真菌最為常見(jiàn)，其中曲霉菌占46.4%，白色假絲酵母10.71%，馬爾尼菲籃狀菌3.57%；其次為細(xì)菌，其中分枝桿菌占25.2%，肺炎克雷伯菌、鼻疽諾卡式菌、嗜麥芽窄食單胞菌、白喉棒狀桿菌各占3.57%，見(jiàn)圖2。

圖2 傳統(tǒng)方法檢出病原體的分布圖

血清學(xué)檢測(cè)共檢出38 株病原體，檢出率為25%，以真菌最為常見(jiàn)，其中曲霉菌占71.06%，新型隱球菌5.27%；其次為細(xì)菌，其中分枝桿菌占7.90%，最后為病毒和非典型病原體，各占7.90%，見(jiàn)圖3。

圖3 血清學(xué)檢出病原體的分布圖

2.2 3種檢測(cè)方法針對(duì)不同病原體的檢出率比較 與傳統(tǒng)方法和血清學(xué)檢測(cè)比較，mNGS 細(xì)菌檢出率升高，真菌檢出率降低（均P＜0.05）；3 種方法病毒檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與血清學(xué)檢測(cè)比較，mNGS 非典型病原體檢出率降低（P＜0.05），傳統(tǒng)方法分別與mNGS、血清學(xué)檢測(cè)的非典型病原體檢出率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 3種檢測(cè)方法針對(duì)不同病原體的檢出率比較n（%）

2.3 3種方法在3種合并肺部基礎(chǔ)疾病中病原體檢出率的比較 合并肺結(jié)核或胸腔積液的患者中，3 種方法病原體檢出率兩兩之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；合并支氣管擴(kuò)張的14 例患者中，mNGS 檢出率較血清學(xué)檢測(cè)升高（P＜0.05），而與傳統(tǒng)方法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 3 種方法在3 種合并肺部基礎(chǔ)疾病中病原體檢出率的比較n（%）

3 討論

肺部感染是呼吸系統(tǒng)最常見(jiàn)、病死率最高的疾病之一。mNGS 在2014 年因成功檢出鉤端螺旋體而被廣泛關(guān)注[6]，此后也逐漸被應(yīng)用到病原體檢測(cè)中。mNGS 可用于痰液、支氣管肺泡灌洗液、血液、胸腹水、腦脊液等[7-11]。mNGS在肺部感染中的優(yōu)勢(shì)巨大，尤其在病重、反復(fù)培養(yǎng)病原體陰性的患者上發(fā)揮更大的優(yōu)勢(shì)。

本研究中，mNGS 檢測(cè)肺部感染患者的病原體常見(jiàn)有結(jié)核分枝桿菌、曲霉菌、緩癥鏈球菌、銅綠假單胞菌等，其檢出率高于傳統(tǒng)方法和血清學(xué)方法。本研究還發(fā)現(xiàn)，3種方法中，mNGS在細(xì)菌中的檢出率較高，在真菌和非典型病原體中的檢出率較低（均P＜0.05），病毒檢出率則和其他兩種方法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在肺部感染的病原體中，因細(xì)菌占主要地位，所以mNGS 可以提高患者的病原體檢出率，在診治中可以提供一定的應(yīng)用價(jià)值。然而，mNGS 在真菌和非典型病原體的檢出率較低，并且在病毒的檢出率不高，這與林明珍等[12]在初治失敗的CAP 患者中發(fā)現(xiàn)的“mNGS 在真菌、病毒的檢出率高”不一致，可能與本研究的樣本量較少有關(guān)。因此，當(dāng)考慮肺部感染患者可能為真菌、病毒或非典型病原體感染時(shí)，可以結(jié)合患者病史、經(jīng)濟(jì)等實(shí)際情況酌情考慮是否增加mNGS 檢測(cè)。

mNGS 在合并肺部基礎(chǔ)疾病的患者中凸顯優(yōu)勢(shì)，在合并支氣管擴(kuò)張的患者中mNGS的檢出率顯著升高，而無(wú)論是合并肺結(jié)核還是胸腔積液，3種方法的檢出率無(wú)明顯差異。對(duì)肺部感染患者的診治過(guò)程中，需結(jié)合3 種方法的檢測(cè)結(jié)果及時(shí)調(diào)整抗菌藥物。mNGS 能一次性對(duì)上百萬(wàn)條DNA 分子進(jìn)行測(cè)序，甚至能測(cè)出不可培養(yǎng)的微生物基因序列，比傳統(tǒng)培養(yǎng)更快，檢出率、敏感度更高，并且不受宿主因素、抗生素或激素使用的影響[13-14]。mNGS亦存在一定的局限性，例如檢測(cè)費(fèi)用高，容易受呼吸道定植菌、機(jī)會(huì)致病菌的影響，對(duì)RNA病毒的敏感度弱，缺乏統(tǒng)一的檢測(cè)和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[15]。

綜上所述，mNGS 比傳統(tǒng)方法和血清學(xué)檢測(cè)具有更高的病原體檢出率，為肺部感染患者提供了更準(zhǔn)確的病原體檢測(cè)方法，為指導(dǎo)治療方案提供了新的診斷依據(jù)，有助于提高臨床診療水平。針對(duì)病重、合并支氣管擴(kuò)張、反復(fù)培養(yǎng)病原體陰性、考慮細(xì)菌感染的肺部感染患者，建議入院時(shí)盡快完善mNGS檢測(cè)，針對(duì)個(gè)體差異進(jìn)行精確治療，以降低抗生素使用不當(dāng)?shù)母怕省１狙芯可写嬖谝恍┎蛔阒帲海?）樣本量少，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析；（2）本研究為回顧性分析研究，未能進(jìn)行mNGS的特異度分析，對(duì)于mNGS的結(jié)果判斷可能存在一定的差錯(cuò)；（3）mNGS 送檢標(biāo)本并不在本院檢驗(yàn)科檢測(cè)，在運(yùn)輸過(guò)程中可能因?yàn)楸４娌簧苹蜻\(yùn)輸時(shí)間長(zhǎng)而導(dǎo)致敏感度下降。