不明原因新生兒高膽紅素血癥與UGT1A1基因突變的關(guān)系*

談鈺培，鐘丹妮Δ，趙 科，謝湘芝

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，南寧 530021；2.環(huán)江毛南族自治縣人民醫(yī)院兒科，河池 547199）

新生兒高膽紅素血癥（新生兒高膽）是新生兒期常見癥狀，大約80% 早產(chǎn)兒和50% 足月兒出生后會發(fā)生高膽紅素血癥[1]，其發(fā)病與新生兒早期體內(nèi)膽紅素—尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1）表達(dá)水平低有關(guān)。UGT1A1基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)基因突變均可導(dǎo)致該酶活性降低或缺失，使游離膽紅素的葡萄糖醛酸化過程受阻，膽紅素代謝減少引起血清中游離膽紅素水平升高，導(dǎo)致新生兒高膽。UGT1A1基因最常見突變類型為啟動子區(qū)TATA盒插入突變和G71R錯(cuò)義突變，亞洲地區(qū)的黃種人常見為第1 外顯子區(qū)G71R 錯(cuò)義突變?yōu)橹鱗2-5]，歐美地區(qū)高加索人及Gilbert綜合征常見為啟動子區(qū)TATA盒插入突變?yōu)橹鱗6-9]。本研究旨在探討不明原因新生兒高膽與UGT1A1基因編碼啟動子區(qū)TATA盒和第1外顯子區(qū)基因突變類型的關(guān)系，以便為明確不明原因新生兒高膽的病因及診治提供遺傳學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2021 年1～12 月在廣西環(huán)江毛南族自治縣人民醫(yī)院新生兒科和產(chǎn)科住院的新生兒，足月（胎齡≥37 周）出生，出生體重2 500～4 000 g。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，獲得患兒家屬知情同意。

1.2 病例納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 病例組：（1）黃疸發(fā)病日齡在2周內(nèi)，血清膽紅素升高且以游離膽紅素升高為主，時(shí)齡血清總膽紅素值達(dá)到或超過2014年《新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識》[10]的新生兒小時(shí)膽紅素列線圖光療標(biāo)準(zhǔn)；（2）經(jīng)光療及藥物治療黃疸好轉(zhuǎn)出院。對照組：（1）出生后無明顯黃疸或血清總膽紅素值低于2014年《新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識》[10]的新生兒小時(shí)膽紅素列線圖光療標(biāo)準(zhǔn)；（2）均與高膽紅素血癥組同期、同地區(qū)出生，未經(jīng)特殊治療，臨床經(jīng)過良好。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 病例組和對照組均排除：（1）早產(chǎn)兒；（2）低出生體重兒；（3）足月小樣兒；（4）巨大兒；（5）先天畸形者；（6）母嬰血型不合導(dǎo)致的溶血者；（7）G6PD缺乏癥者；（8）消化道畸形者；（9）紅細(xì)胞增多癥者；（10）敗血癥等病因明確的影響黃疸程度的因素。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集及DNA 提取 采集靜脈血2 mL，EDTA 抗凝，應(yīng)用血液基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取DNA，于-20℃保存。

1.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物參照文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)。引物序列，上游引物：5’-GTC ACG TGA CAC AGT CAA AC-3’，下游引物：5’-GTC CCA CTC CAA TAC ACA C-3’，擴(kuò)增片段為啟動子區(qū)TATA盒及全部第1外顯子，片段長度987 bp。（引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成）。反應(yīng)體系：2xEs Taq MasterMix（Dye）（康為世紀(jì)公司）25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 200 ng，去離子水補(bǔ)充至50 μL。PCR反應(yīng)在多通道PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35 次，72 ℃再延伸2 min。產(chǎn)物置于4℃保存。

1.3.3 凝膠電泳 以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物是否為擴(kuò)增目的基因片段，以100 bp Ladder DNA Marker（康為世紀(jì)公司）作為片段大小參照物，每例PCR產(chǎn)物取5 μL，電壓120 V，電泳30 min。在紫外凝膠成像系統(tǒng)上對凝膠進(jìn)行成像顯影并觀察。

1.3.4 基因測序 將合格的PCR 產(chǎn)物在1～2 d 寄送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行基因測序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組出生胎齡、出生體重及總膽紅素值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，兩組性別構(gòu)成、分娩方式、基因型分布及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。二分類變量非條件Logistic 回歸分析比較UGT1A1基因不同突變類型對不明原因新生兒高膽影響的優(yōu)勢比（OR）和95%可信區(qū)間（CI）；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組出生胎齡、出生體重、性別構(gòu)成及分娩方式比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；病例組總膽紅素值高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR 產(chǎn)物呈單一條帶，片段大小與目的基因相符，見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3UGT1A1基因測序結(jié)果及分析

2.3.1 啟動子區(qū) 在UGT1A1基因啟動子區(qū)共發(fā)現(xiàn)TATA盒（TA）7插入突變33例，其中病例組16例，對照組17例；在病例組中發(fā)現(xiàn)A（TA）6TAA/A（TA）7TAA[簡稱（TA）6/7）]雜合插入突變14 例，A（TA）7TAA/A（TA）7TAA[簡稱（TA）7/7]純合插入突變2例；對照組全部為（TA）6/7插入突變。總插入突變的基因頻率分別為9.0%、8.5%，比較兩組基因型分布和等位基因頻率，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表2。

圖2 UGT1A1 TATA盒插入突變位點(diǎn)測序圖（正向測序）

表2 兩組UGT1A1 TATA盒基因型分布和等位基因頻率比較n（%）

2.3.2 第1 外顯子區(qū) 在UGT1A1基因第1 外顯子區(qū)共發(fā)現(xiàn)G71R 錯(cuò)義突變43 例，其中病例組33 例，對照組10 例；在病例組中發(fā)現(xiàn)雜合子（G/A）29 例，純合子（A/A）4例；對照組全部為雜合子?？傚e(cuò)義突變的等位基因頻率分別為18.5%、5.0%，比較兩組基因型分布和等位基因頻率，病例組G71R 基因型分布及等位基因頻率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖3、表3。

表3 兩組UGT1A1 G71R基因型分布和等位基因頻率比較n（%）

圖3 UGT1A1 G71R錯(cuò)義突變位點(diǎn)測序圖（正向測序）

在UGT1A1基因第1外顯子區(qū)共發(fā)現(xiàn)P229Q錯(cuò)義突變8例，其中病例組3例，對照組5例；病例組和對照組均為雜合子（C/A）?？傚e(cuò)義突變的等位基因頻率分別為1.5%、2.5%，比較兩組基因型分布和等位基因頻率，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4、表4。

圖4 UGT1A1 P229Q錯(cuò)義突變位點(diǎn)測序圖（反向測序）

表4 兩組UGT1A1 P229Q基因型分布和等位基因頻率比較n（%）

2.3.3UGT1A1基因不同突變類型對不明原因新生兒高膽影響的Logistic回歸分析 采用二分類變量非條件Logistic回歸分析本研究發(fā)現(xiàn)的TATA盒、G71R 和P229Q 這3 個(gè)突變位點(diǎn)對不明原因新生兒高膽紅素血癥的影響，發(fā)現(xiàn)本研究中UGT1A1G71R錯(cuò)義突變是不明原因新生兒高膽的危險(xiǎn)因素（P＜0.001），新生兒攜帶有G71R 錯(cuò)義突變發(fā)生不明原因新生兒高膽紅素血癥是野生型的4.540 倍。而UGT1A1TATA 盒（TA7）插入突變和P229Q 錯(cuò)義突變不是不明原因新生兒高膽的危險(xiǎn)因素（P＞0.05），表5。

表5 UGT1A1基因不同突變類型對不明原因新生兒高膽影響的Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

UGT1A1由第1外顯子和第2～5共同外顯子編碼。體外研究顯示只有UGT1A1 酶結(jié)合底物是膽紅素，該酶為肝臟內(nèi)膽紅素代謝的唯一酶[12]。除了已明確黃疸病因外，不明原因新生兒高膽發(fā)病常常與UGT1A1基因突變有關(guān)，全球范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因突變類型有300 余種，突變方式包括插入突變、錯(cuò)義突變、缺失突變等。

本研究結(jié)果顯示，兩組中UGT1A1基因突變類型以G71R錯(cuò)義突變?yōu)橹?，比較兩組G71R等位基因頻率，病例組的等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示G71R 錯(cuò)義突變可能與不明原因新生兒高膽發(fā)生有關(guān)系，這與本課題組前期相關(guān)研究結(jié)果相符[13]。結(jié)合Logistic 回歸分析，UGT1A1G71R錯(cuò)義突變是不明原因新生兒高膽發(fā)生的危險(xiǎn)因素。UGT1A1G71R 錯(cuò)義突變?yōu)閁GT1A1基因第1外顯子區(qū)的第211位堿基由G突變?yōu)锳，使該編碼的密碼子由甘氨酸（GGA）變?yōu)榫彼幔ˋGA），使UGT1A1的葡萄糖醛酸化能力下降，引起新生兒高膽。本研究病例組G71R等位基因頻率高于廣西黑衣壯族地區(qū)（15.5%）[14]、低于廣西來賓地區(qū)不同民族間（19.0%、27.0%、20.0%）[15]、云南?。?3.0%）[16]、廣東漢族（29.2%）[17]、重慶地區(qū)（42.4%）[18]、越南（27.3%）[19]、日本（47.0%）[4]等。

UGT1A1啟動子區(qū)TATA 盒已知突變類型為（TA）5、（TA）7、（TA）8 三種類型。在本研究中發(fā)現(xiàn)UGT1A1TATA盒以（TA）7插入突變?yōu)橹?，其突變頻率僅次于G71R 錯(cuò)義突變，比較兩組（TA）7 等位基因頻率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示（TA）7插入突變可能與不明原因新生兒高膽紅素血癥發(fā)生無關(guān)系，這與Akaba 等[2]報(bào)道過UGT1A1TATA 盒（TA）7 插入突變不是亞洲地區(qū)引起新生兒黃疸的主要突變類型是一致的。結(jié)合Logistic 回歸分析結(jié)果，提示（TA）7插入突變不是不明原因新生兒高膽的危險(xiǎn)因素。Beutler 等[8]曾報(bào)道（TA）7插入突變在白人群體中的基因頻率為38.7%，在亞洲人群中僅為16.0%，只有在非洲血統(tǒng)的人群中才發(fā)現(xiàn)有（TA）5和（TA）8突變類型。本研究中病例組（TA）7等位基因頻率低于廣西黑衣壯族地區(qū)（13.0%）[14]、亞洲人群（16.0%）[8]。

本研究在UGT1A1基因第1 外顯子區(qū)共發(fā)現(xiàn)8例P229Q雜合突變，并同時(shí)存在有TATA盒插入突變，其中1 例為A（TA）7/7TAA-P229Q，另外7 例均為A（TA）6/7TAA-P229Q，比較兩組P229Q 等位基因突變頻率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示P229Q 錯(cuò)義突變可能與不明原因新生兒高膽發(fā)生無關(guān)系。結(jié)合Logistic 回歸分析結(jié)果提示UGT1A1P229Q 錯(cuò)義突變不是不明原因新生兒高膽的危險(xiǎn)因素。Osamu等[20]報(bào)道過UGT1A1基因第1 外顯子區(qū)存在P229Q錯(cuò)義突變（UGT1A1*27），是引起日本Gilbert綜合征（GS）和Crigler NajjarⅡ型（CN Ⅱ）患者UGT1A1酶活性下降引起高膽紅素血癥。中國臺灣也曾報(bào)道過A（TA）6/7TAA-P229Q 的等位基因雜合突變使UGT1A1 酶活性減少，臨床表現(xiàn)為Gilbert 綜合征[21]。Kaniwa 等[9]提出在A（TA）6/7TAA-P229Q 的等位基因雜合突變的日本和中國臺灣患者中觀察到的高膽紅素血癥可主要?dú)w因于TATA盒（TA）7插入突變。這提示P229Q 錯(cuò)義突變對不明原因新生兒高膽影響不大，由于本研究中發(fā)現(xiàn)P229Q錯(cuò)義突變例數(shù)較少，之后需要加大樣本量進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究探討了不明原因新生兒高膽和正常新生兒在UGT1A1基因啟動子區(qū)及第1外顯子區(qū)的突變情況，分析所檢測到的突變類型與不明原因新生兒高膽發(fā)生的關(guān)系，明確UGT1A1G71R 錯(cuò)義突變與不明原因新生兒高膽發(fā)生有關(guān)系，是其危險(xiǎn)因素，攜帶有該基因錯(cuò)義突變可能會增加新生兒高膽的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。為今后不明原因新生兒高膽發(fā)生發(fā)展提供基因遺傳學(xué)證據(jù)。