豬瘟病毒檢測和豬瘟疫苗研究進展

張 璞，陳建凱，賴月輝，林德銳，李復(fù)坤，周曉敏，侯高偉，齊冬梅

（1.佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231；2.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東 廣州 511356）

豬瘟（Classical Swine Fever，CSF）是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的病毒性疾病之一。自CSF 出現(xiàn)以來，對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失。在自然條件下，豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）經(jīng)鼻侵入豬體內(nèi)，有時通過眼結(jié)膜、生殖道黏膜或皮膚傷口進入體內(nèi)，也可以經(jīng)口腔和非腸道途徑感染豬。CSF 在臨床上表現(xiàn)為死亡率很高的急性型或死亡率變化不定的亞急性型、慢性型、隱性型及持續(xù)感染型，癥狀主要為發(fā)病豬高熱稽留和小血管壁變性引起各器官、組織廣泛出血、梗死和壞死等病變。世界動物衛(wèi)生組織（World Organization for Animal Health，OIE）將CSF 列為最重要的法定報告?zhèn)魅静≈唬谖覈涣袨橐活悅魅静?。所有OIE 成員國有義務(wù)向OIE 通報疾病、感染和任何相關(guān)的重要流行病學事件。

第一份CSF 報告可追溯至1810 年美國田納西州發(fā)生的CSF 疫情；19 世紀上半葉，美國有10 個州暴發(fā)CSF 疫情。歐洲第一份CSF 報告可追溯至1862 年的英國，之后傳播到瑞典、法國和丹麥。從20 世紀60 年代開始，CSF 呈世界性傳播。近30 年來，很多國家先后采取了消滅CSF 的綜合防制措施，取得了顯著成效。目前，無CSF 的國家和地區(qū)共38 個，包括整個北美洲、大洋洲，以及法國、葡萄牙、瑞典等大部分歐盟國家。CSF 在亞洲和中、南美洲，加勒比地區(qū)仍然流行。除馬達加斯加和南非有CSF 暴發(fā)的報道外，該病在非洲的情況知之甚少［1-2］。近年該病在韓國、哥倫比亞、俄羅斯、巴西和日本CSF 均有暴發(fā)。特別是日本在時隔26 年無CSF 病例后的2018 年再次在家豬和野豬中暴發(fā)CSF 疫情［3］。由此可見，CSF 仍然是一種地方性和可復(fù)發(fā)性病毒病，持續(xù)威脅全球豬肉生產(chǎn)和人類的食品安全。20 世紀50年代以前，CSF 在我國的流行極為普遍，造成重大的經(jīng)濟損失。50 年代后期起，我國采取了以疫苗免疫為主的綜合防控措施，有效控制了CSF 的流行。目前，我國的CSF 主要以地方性和散發(fā)性流行。現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)以集約化和規(guī)?；B(yǎng)殖為主要發(fā)展趨勢，群發(fā)性疾病尤其是傳染病是阻礙養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要因素。以預(yù)防為主的CSF 防控策略明確了CSF 疫苗、CSFV 抗原和抗體診斷技術(shù)不可或缺的重要作用。本文從CSFV 抗原和抗體診斷技術(shù)、CSFV 疫苗開發(fā)進展和前景等方面進行綜述，以期為更好地防控CSF 提供參考。

1 CSF 病原學

CSFV 屬于黃病毒科瘟病毒屬，是近似球型的單股正鏈RNA 病毒，病毒粒子平均直徑為44 nm，內(nèi)有20 面體立體對稱的核衣殼，其直徑為24～30 nm，外有脂蛋白囊膜包裹，囊膜表面有6～8 nm 的囊膜糖蛋白纖突［4］。

1.1 CSFV 基因組

CSFV 基因組全長約12.3 kb，包含1 個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），編碼含3 898個氨基酸的多聚蛋白，分子量大小約438 ku。兩側(cè)分別攜帶1 個內(nèi)部核糖體進入位點的5'-端非編碼區(qū)（5'-UTR，長度約360～374 bp）和富含尿苷的3'-端非編碼區(qū)（3'-UTR，長度為272～243 bp）。CSFV 是瘟病毒中相對穩(wěn)定的病毒，現(xiàn)有3 個基因群（Group 1、Group 2、Group 3），其中Group 1 分為1.1、1.2、1.3 等基因亞群，Group 2 分為2.1、2.2、2.3 等基因亞群。目前國內(nèi)主要流行株為2.1、2.2 和1.1 基因型［4］。

1.2 CSFV 蛋白質(zhì)

CSFV 多聚蛋白在病毒和宿主細胞的蛋白酶作用下，逐步裂解為C、Erns、E1、E2 等4 種結(jié)構(gòu)蛋白和Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B 等8 種非結(jié)構(gòu)蛋白。C 蛋白是由99個氨基酸組成的帶大量堿性電荷的衣殼蛋白。C蛋白的主要區(qū)域相對保守，與其他瘟病毒的同源性大于91%。Erns蛋白是由227 個氨基酸組成的分子量約44～48 ku 的囊膜糖蛋白，通過分子間的二硫鍵形成同源二聚體。Erns糖蛋白具有RNase活性，能抑制雙鏈RNA 合成，導致免疫抑制，引起動物的淋巴和上皮細胞凋亡。E1 蛋白是由195個氨基酸組成的分子量約31 ku 的囊膜糖蛋白，不能誘導機體產(chǎn)生中和抗體。E2 蛋白是由373 個氨基酸組成的分子量約51～55 ku 的囊膜糖蛋白，為I 型跨膜蛋白，能誘導機體產(chǎn)生中和抗體，是豬瘟的主要保護性抗原蛋白。

豬瘟病毒的8 種非結(jié)構(gòu)蛋白，Npro蛋白是屬內(nèi)特有的蛋白，比較保守。Npro蛋白通過調(diào)節(jié)病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA 中間體水平干擾CSFV 細胞免疫應(yīng)答。p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B 等其他幾個非結(jié)構(gòu)蛋白與CSFV 病毒復(fù)制、感染性病毒顆粒形成、致細胞病變生物型、病毒毒力及持續(xù)感染有關(guān)［4］。

2 CSFV 抗原/抗體檢測技術(shù)

中等毒力和低毒力的CSFV 不會引起典型的臨床癥狀，但可以在豬群中緩慢傳播。與非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）、豬呼吸和繁殖綜合征（Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome，PRRS）、副豬嗜血桿菌病（Haemophilus parasuis，Hps）等一種或多種病原混合感染時，難以通過臨床癥狀或剖檢病變來確診CSFV 病例，需要通過實驗室檢測確診［5］?？焖贉蚀_的實驗室和臨床檢測技術(shù)對于CSF防控具有極其重要的作用。

2.1 CSFV 抗原檢測技術(shù)

對于CSFV 的分離、病毒抗原和核酸的檢測，可以使用血清和動物體液，以及死亡動物的扁桃體、脾臟、淋巴結(jié)、胸腺、腸、腎、肺等器官樣本［5］。CSFV 可以在多種豬源細胞上生長，如豬腎細胞系PK15 細胞、SK6 細胞，以及豬睪丸細胞系ST細胞。病原分離是CSF 確診的經(jīng)典方法之一。絕大多數(shù)CSFV 分離株是非細胞致病性的，在細胞培養(yǎng)中無明顯的細胞病變。因此，在CSFV 感染細胞后，病毒抗原必須通過免疫過氧化物酶染色試驗（Immunoperoxidase Test，IPT）或免疫熒光抗體試驗（Fluorescent Antibody Test，F(xiàn)AT）來驗證。敏感和快捷的反轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）和熒光定量PCR（qRT-PCR）是目前實驗室應(yīng)用更廣泛的CSFV 核酸檢測方法，很多實驗室將qRT-PCR 作為快速CSFV 診斷的首選方法。檢測CSFV 核酸的新技術(shù)在不斷發(fā)展。高曉龍等［6］建立了CSFV微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）方法。張雨杭［7］利用CRISP/Casl3a 核酸檢測技術(shù)建立CSF 強弱毒鑒別檢測技術(shù)。如需確診CSF 還需要進行免疫熒光或病原分離鑒定。

2.2 CSFV 抗體檢測技術(shù)

國內(nèi)常用的CSFV 抗體檢測方法有病毒中和試驗（Virus Neutralization Test，VNT）、膠體金免疫層析法（Gold Immunochromatography Assay，GICA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunsorbent Assay，ELISA）等。VNT 方法靈敏度高、特異性好、準確性高，是CSFV 抗體檢測的金標準，可以用于非免疫豬的CSF 臨床病例確診、流行病學調(diào)查和免疫豬疫苗免疫效果評價等。CSFV 同屬的牛病毒性腹瀉粘膜病病毒（Bovine Viral Diarrhoea Virus，BVDV）、邊界病毒（Border Disease Virus，BDV）等瘟病毒感染可能會干擾CSFV 抗體診斷，VNT 方法可以區(qū)分CSFV 特異性抗體和BVDV、BDV 以及其他反芻動物瘟病毒感染產(chǎn)生的抗體。因此，VNT 可以復(fù)核在ELISA 抗體檢測中的陽性樣品或可疑樣品，并確定這些抗體是否為CSFV 特異性抗體。但VNT 檢測費時、費力，而且檢測成本高，目前還未能實現(xiàn)高通量和自動化檢測，不適用于處理大量的臨床樣品。

GICA 技術(shù)具有使用方便，對操作人員要求不高，無需特殊儀器設(shè)備和試劑，并可以直接判斷等優(yōu)點，因此特別適合應(yīng)用于基層試驗室和CSFV 臨床批量篩查。近年來，GICA 技術(shù)也在不斷向多靶標、高敏感性方向發(fā)展，如量子點、磁顆粒等新材料被用于試劑條的制備［8］。李華瑋等［9］首次在國內(nèi)建立了可以區(qū)分強弱毒CSFV 抗體的雙抗原夾心法免疫層析試紙條。尹清清［10］以膠體金標記和量子點耦聯(lián)重組CSFV E2 蛋白，研制了檢測CSFV 抗體免疫層析試紙條。萬穎等［11］制備CSFV E2 蛋白抗體檢測的膠體金免疫層析試紙條，檢測用時更短（5～10 min）。

ELISA 是一種快速、簡便、應(yīng)用廣泛的血清學診斷技術(shù)，突出優(yōu)點是可以在短時間內(nèi)檢測大量樣本。其在CSF 血清學調(diào)查中起到非常重要的作用。國內(nèi)外已開發(fā)出多種CSFV 抗體檢測試劑盒產(chǎn)品并商品化。國外常用商業(yè)化試劑盒包括美國愛德士公司（IDEXX Laboratories）、荷蘭百測公司（Biocheck）、德國勃林格殷格翰制藥公司（Boehringer Ingelheim）、賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）等生產(chǎn)的試劑盒。國內(nèi)注冊的CSFV 抗體檢測試劑盒有豬瘟病毒間接ELISA 抗體檢測試劑盒、豬瘟病毒阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒、豬瘟病毒化學發(fā)光ELISA 抗體檢測試劑盒等3 種，進口注冊1 個豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒（表1）。上述CSFV 抗體檢測試劑盒的產(chǎn)品類型主要是間接ELISA、競爭性ELISA 或阻斷ELISA 等，針對CSFV 全病毒、E2或Erns/E0 蛋白產(chǎn)生的抗體。近年來，更多的新技術(shù)和新思路應(yīng)用到CSFV 抗體ELISA 試劑盒開發(fā)中，如Wang 等［12］利用有中和能力的單克隆抗體建立競爭ELISA 檢測C 株CSF 疫苗免疫產(chǎn)生的抗體。李元曦等［13］建立了可以快速鑒別CSFV野毒和疫苗毒的可視化基因芯片檢測技術(shù)。王麗等［14］建立了CSFV Erns/E2 融合蛋白間接ELISA抗體檢測技術(shù)。徐璐等［15］等建立的化學發(fā)光競爭ELISA 抗體檢測方法與熒光抗體病毒中和試 驗（Fluorescent Antibody Virus Neutralization Test，F(xiàn)AVN）方法檢測的中和抗體效價更接近。麻園等［16］建立了CSFV 化學發(fā)光ELISA 抗體檢測技術(shù)，敏感性、特異性、重復(fù)性良好。不斷提高ELISA 試劑盒的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，更好地應(yīng)對當前多病原混合感染的復(fù)雜豬病現(xiàn)狀，設(shè)計和優(yōu)化適用于CSF 標記疫苗的ELISA 抗體檢測試驗盒，可靠地區(qū)分受感染和接種疫苗動物（Discrimination of Infected from Vaccinated Animals，DIVA）仍然是豬瘟血清學診斷技術(shù)的主要挑戰(zhàn)。

表1 國內(nèi)注冊豬瘟抗體檢測試劑盒Table 1 Domestic registered CSFV antibody detection kits

3 CSF 疫苗

從歷史上看，一些國家將大規(guī)模減毒活疫苗免疫接種作為一項強制性CSF 防控措施，并輔以其他生物安全措施，成功應(yīng)對CSF 疫情。目前，西方發(fā)達國家已不再使用疫苗接種而直接采取撲殺的方法來防制CSF。但疫苗接種仍然是世界上大多數(shù)國家特別是發(fā)展中國家控制CSF 的主要手段。隨著生物技術(shù)特別是分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，更多的CSF 新型疫苗被開發(fā)和批準使用。

3.1 減毒活疫苗

減毒活疫苗多是通過兔體或細胞連續(xù)傳代獲得的適應(yīng)性突變減毒株。減毒活疫苗最常用的毒株是我國的豬霍亂兔化弱毒HCLV株〔亦稱中國疫苗株（C株）〕、俄羅斯的LK-VNIVViM株、日本的GPE-株、法國的Thiverval株、墨西哥的PAV株等［2］。這些疫苗的共同優(yōu)點是使用方便、成本低、易于生產(chǎn)、安全性良好，特別是對仔豬和懷孕母豬安全。上述減毒疫苗已在全世界廣泛應(yīng)用。

3.1.1 C 株 C 株兔化弱毒疫苗是目前國際上應(yīng)用最廣泛、國內(nèi)唯一應(yīng)用的CSF 疫苗，也是控制CSF 最有效的疫苗之一。該疫苗毒株于1954—1958 年由中國獸藥監(jiān)察所等單位成功培育，具有無血毒癥、不排毒、不通過懷孕母豬胎盤屏障的優(yōu)點，而且毒力返強的可能性很小，在豬體內(nèi)傳30 代后仍安全［4］。C 株疫苗不但有突出的安全性和有效性［17］，而且疫苗的生產(chǎn)工藝技術(shù)簡單，成本低廉，易于臨床使用和推廣。不同國家已經(jīng)開發(fā)了多種源自豬瘟C 株的疫苗，如匈牙利的SUVAC 疫苗、美國的VADIMUN 疫苗、德國的Duvaxin 和Riems 疫苗、墨西哥的Norden 和Porcivac 疫苗、巴西的PS Poreo 疫苗、斯洛伐克的Tipest 疫苗、捷克共和國的TVM-1 疫苗、俄羅斯的LK 疫苗等［2］。

我國C 株兔化弱毒疫苗的研制和應(yīng)用主要有以下幾個階段：1958 年研制出牛體反應(yīng)苗；1964 年研制出乳兔苗；后來由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所等單位研制出豬瘟兔化弱毒同源原代細胞苗（1973—1978 年）、乳豬腎細胞苗（1978—1980年）、綿羊腎細胞苗（1980 年）、奶山羊腎細胞苗（1982 年）、犢牛睪丸原代細胞苗（1985 年）等，其中犢牛睪丸原代細胞苗目前仍有生產(chǎn)和應(yīng)用；2004 年中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和廣東永順生物制藥股份有限公司聯(lián)合開展了豬睪丸傳代細胞系（ST細胞）生產(chǎn)豬瘟疫苗的研究，并在2008 年成功研制出ST 細胞系生產(chǎn)的豬瘟活疫苗（傳代細胞源），現(xiàn)在由國內(nèi)19 個獸用生物制品生產(chǎn)廠家生產(chǎn)并廣泛應(yīng)用［4］；2020 年華威特（江蘇）生物制藥有限公司與碩騰生物制藥有限公司等企業(yè)共同研制了豬瘟活疫苗（C 株，懸浮培養(yǎng)），同年軍事科學院軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所與江蘇勃林格殷格翰生物制品有限公司等公司聯(lián)合開發(fā)了豬瘟活疫苗（C 株，PK/WRL 傳代細胞源）。2010年以來在國內(nèi)注冊的豬瘟活疫苗相關(guān)信息見表2。

表2 2010 年后國內(nèi)注冊的豬瘟活疫苗Table 2 Domestic registered CSFV live vaccines after 2010

3.1.2 LOM 株 LOM 株是1956 年由日本分離的低毒力Miyagi 株通過牛腎細胞連續(xù)傳代致弱獲得。1968—1969 年，韓國獸醫(yī)研究所（Institute of Veterinary Research，IVR）首次將LOM 株疫苗作為候選疫苗進行田間試驗，并于1974 年在韓國廣泛推廣使用。LOM 株疫苗在韓國使用了幾十年，充分證明了該疫苗的安全性和有效性，但仍存在毒力返強的風險。韓國濟州島原本并無豬瘟病例，實行不接種疫苗政策10 年后，在2014 年接種了LOM 株疫苗，導致濟州島發(fā)生了CSF 地方性暴發(fā)，給養(yǎng)豬場造成巨大損失［18］。

3.1.3 GPE-株 GPE-株（Guinea-pig Exaltationnegative strain，GPE-）疫苗是1969年由日本東京國立動物衛(wèi)生研究所（National Institute of Animal Health，NIAH）研制的。該疫苗株來源于野生型ALD株，經(jīng)豬睪丸細胞、牛睪丸細胞和原代豚鼠腎細胞等多次傳代致弱獲得。GPE-株疫苗對懷孕母豬和仔豬安全，在亞洲和大洋洲廣泛應(yīng)用。研究表明，在豬體連續(xù)傳代11次后，GPE-毒株毒力返強，這與E2蛋白上的T830A、NS4B蛋白上的V2475A和A2563V 3個氨基酸被取代有關(guān)［19］。

3.1.4 Thiverval 株 Thiverval 株是由CSF 強毒Alfort株在豬腎原代細胞上傳代后轉(zhuǎn)到胎牛肌肉細胞，29～30 ℃低溫下經(jīng)170 多代次的細胞傳代培養(yǎng)選育出的低溫變異株，1971 年在法國獲得專利。該疫苗遺傳穩(wěn)定性和安全性好，可應(yīng)用于免疫抑制的動物［2］。數(shù)十年的應(yīng)用結(jié)果表明，Thiverval 株疫苗對懷孕母豬和仔豬安全有效，可防止豬瘟垂直傳播。

3.1.5 PAV-250 株 PAV-250 株是由CSFV A 株經(jīng)PK15細胞連續(xù)傳代250次獲得。自1979年以來，該疫苗在墨西哥的CSF 防控和根除計劃中起到非常重要的作用。PAV-250 株疫苗安全性、免疫原性、遺傳穩(wěn)定性良好，可以抵御豬瘟不同強毒株的攻擊［20］。

3.2 標記疫苗

CSF 減毒活疫苗安全有效，但在臨床實踐中難以與野毒感染區(qū)分，因此新型標記疫苗的研發(fā)越來越受關(guān)注。目前CSF 標記疫苗主要包括亞單位疫苗、嵌合疫苗等。

3.2.1 E2 蛋白亞單位疫苗 E2 蛋白是CSFV 的主要結(jié)構(gòu)糖蛋白，具有高度免疫原性，可以誘導機體產(chǎn)生中和抗體［4］，因此E2 蛋白常作為CSF亞單位疫苗的理想候選蛋白。歐洲共同體藥物評審委員會（European Agency for the Evaluation of Medicinal Products，EMEA）批準了兩種桿狀病毒表達的E2 蛋白亞單位疫苗，即德國拜耳公司的Bayovac?CSF Marker 和荷蘭英特威公司的Porcilis?pesti。大量的免疫攻毒試驗證實，上述疫苗具有較高的安全性［21］，但存在免疫產(chǎn)生期長和保護作用不完全等問題。這些疫苗無法完成垂直保護，病毒依然有可能通過懷孕母豬胎盤傳播導致豬只持續(xù)感染。為了提供完全保護，免疫豬需要接種兩次疫苗［22］。由于這些標記蛋白疫苗不能在豬體內(nèi)繁殖，因此不適合口服接種，特別是對野豬群的免疫［23］。

我國第一個豬瘟E2 蛋白亞單位疫苗為天康生物股份有限公司研制的豬瘟病毒E2 蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗（Rb-03 株），2017 年獲得新獸藥證書，并于2018 年獲得生產(chǎn)許可。該疫苗是基于桿狀病毒表達的豬瘟病毒C 株1.1 基因亞型E2 糖蛋白的亞單位疫苗，經(jīng)兩次免疫接種后，豬群可產(chǎn)生較強的免疫力，能抵御CSF 強毒石門株的攻擊。接種該疫苗的豬E2 蛋白中和抗體滴度升高，可以抵御CSFV 兩種基因型（1 型和2 型）的強毒攻擊［24］，二免后14 d時達到免疫高峰期［25］。2020 年，由華中農(nóng)業(yè)大學與武漢科前生物股份有限公司等公司共同研發(fā)的豬瘟病毒E2 蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗（WH-09 株）獲得新獸藥證書和生產(chǎn)許可。國內(nèi)注冊的豬瘟滅活疫苗見表3。

表3 國內(nèi)注冊的豬瘟滅活疫苗Table 3 Domestic registered CSFV inactivated vaccines

亞單位疫苗無毒力返強風險，而且兼具DIVA特性。但與減毒活疫苗相比較還存在一些弱點，如細胞免疫反應(yīng)弱、免疫產(chǎn)生期長、免疫持續(xù)期短、一次免疫不能提供完全保護等，因此亞單位疫苗需要多次免疫以增加或保持抗體滴度［26］。

3.2.2 嵌合疫苗 鑒于瘟病毒屬內(nèi)BVDV、BDV、CSFV 之間的親緣關(guān)系，設(shè)計改進豬瘟標記疫苗，開發(fā)出系列嵌合瘟病毒疫苗。代表性產(chǎn)品是歐盟批準的第一個針對CSF 的標記活疫苗——美國碩騰公司研制的Suvaxyn?CSF Marker 疫苗。該產(chǎn)品的抗原CP_E2alf 以BVDV CP7 株作為骨架，表達豬瘟病毒Alfort/187 株E1 和E2 糖蛋白［27］。此疫苗對家豬和野豬肌肉注射免疫，安全性和有效性良好，并可用于口服，能抵御強毒和中等毒力毒株的攻擊；肌肉注射免疫1 次，1 周后可產(chǎn)生較強的保護力，免疫持續(xù)期至少6 個月［28］。

2016 年，由5 家韓國獸用疫苗公司聯(lián)合研制的豬瘟嵌合活疫苗Flc-LOM-BErns株通過了韓國的生產(chǎn)許可。Flc-LOM-BErns是CSF LOM 株去除全長Erns基因和衣殼蛋白3′端的52 個堿基后，以BVDV 相應(yīng)部分替代獲得的Flc-LOM-BErns感染性克隆。該疫苗可對懷孕母豬產(chǎn)生完全保護［29］。但由于對家豬和野豬口服該疫苗的臨床應(yīng)用剛開始，因此對其安全性等還不清楚。

明確CSFV 的毒力影響因素對設(shè)計CSFV 標記活疫苗非常重要。在CSFV 基因組中引入基因突變，減少1 個或多個毒力影響因素，通過感染性克隆可能會創(chuàng)造出更安全、有效的具有DIVA特性的疫苗。Holinka 等［30］通過將兩個獨立的基因修飾引入CSFV Brescia 株的基因組中，構(gòu)建了帶有兩個抗原標記的豬瘟減毒活疫苗毒株FlagT4v株。在E1基因中引入Flag?抗原表位作為陽性抗原標記；去掉E2基因上單克隆抗體WH303 株識別表位（829TAVSPTTLR837），因該突變可以干擾對病毒表位的識別，因此作為陰性抗原標記。為了改善FlagT4v 株的基因穩(wěn)定性，避免毒力返強，繼而開發(fā)了FlagT4Gv 株。FlagT4Gv 株免疫豬可以抵抗親本毒的攻擊；并且免疫后豬體內(nèi)的IFN-α水平增加。其缺點是尚無與該候選疫苗配套的DIVA 檢測技術(shù)。

為了開發(fā)具有DIVA 特性的C 株標記疫苗，Han 等［31］利用反向遺傳操作技術(shù)制備了缺失E2 糖蛋白HQ06 單抗識別位點上117F、119G、122P 氨基酸的突變體rHCLV-E2F117A、rHCLVE2G119A、rHCLV-E2P122A。經(jīng)靜脈免疫兔，所有突變體均能引起兔體產(chǎn)生定型熱，并能在兔脾臟中復(fù)制。其中rHCLV-E2P122A 在兔和豬體內(nèi)均能誘導抗豬瘟中和抗體，但不能誘導抗豬瘟hq06 識別表位的抗體，可以與C 株誘導的抗體相區(qū)分。

3.3 復(fù)制子疫苗

正鏈RNA 病毒的自我復(fù)制RNA（復(fù)制子）正逐步成為哺乳動物細胞中基因表達和新型疫苗開發(fā)的有力工具。復(fù)制子即至少1 個結(jié)構(gòu)基因部分或完全缺失而導致功能缺陷，無法產(chǎn)生感染性子代病毒但具有復(fù)制能力的病毒基因組。復(fù)制子可以被包裝到病毒囊膜中，利用細胞生成病毒復(fù)制子顆粒（Virus Replicon Particles，VRP）。VRP疫苗主要優(yōu)點包括：VRP 與親代病毒感染細胞的效率相同；安全性良好，不會造成水平或垂直傳播；不產(chǎn)生感染性子代病毒，無毒力返強隱患；可誘導細胞毒性T 細胞應(yīng)答；可通過檢測VRP 中缺失的蛋白或抗原表位的抗體，區(qū)分VRP 疫苗接種的動物與感染的動物［32］。

Semliki Forest 病毒復(fù)制載體標記疫苗rAdVSFV-E2 株是基于復(fù)制缺陷的腺病毒5 型（Ad5）載體，表達CSFVE2基因的Semliki Forest 病毒復(fù)制子。rAdV-SFV-E2 株可以刺激豬產(chǎn)生細胞和體液免疫反應(yīng)。二免后，可以抵御CSFV 強毒株的攻擊，效果與C 株相當。該候選疫苗效力不會受豬體內(nèi)存在的相關(guān)抗體（如CSFV 和BVDV 抗體）的影響，也不會受到其他豬用活疫苗聯(lián)合使用的影響［33］。仔豬的母源抗體能對CSF 強毒攻擊提供一定的保護［34］。

3.4 病毒載體疫苗

3.4.1 豬痘病毒載體疫苗 豬痘病毒（Swinepox Virus，SPV）只感染豬，且通常感染輕微，偶爾伴有局部皮膚損傷，可自然愈合。SPV 擁有雙鏈DNA 基因組，可以攜帶和表達大量外源基因，可以刺激機體產(chǎn)生細胞和體液免疫。Lin 等［35］以SPV 基因組為骨架，插入E2基因構(gòu)建了重組rSPV-E2 候選疫苗株。rSPV-E2 肌肉注射免疫可誘導機體產(chǎn)生CSFV 特異性中和抗體，為CSF 免疫提供臨床保護。

3.4.2 偽狂犬載體疫苗 偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）的gE、gI、TK 和PK 等蛋白已被證實與PRV 的毒力相關(guān)。相應(yīng)的基因可以用外源基因替代而不影響病毒的感染和復(fù)制。因此，PRV常被用作表達其他病原體主要免疫原的載體以研制多價疫苗。仇華吉研究團隊利用豬PRV TJ 株研制了兩種重組PRV 病毒，即rPRVTJ-delgE 和rPRVTJ-delgE/gI/TK，其對易感動物安全，可以抵抗豬PRV 強毒攻擊；創(chuàng)制了表達CSFV E2 基因的重組PRV 載體病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2，研究表明，rPRVTJ-delgE/gI-E2 對豬安全，可誘導產(chǎn)生豬PRV 抗體和CSFV 中和抗體，可抵抗豬PRV TJ 株和CSFV 石門株的強毒攻擊，可作為抗CSFV 和豬PRV 感染的二價DIVA 候選疫苗［36］。

Tong 等［37］開發(fā)了一種雙價PRV/CSFV DIVA候選疫苗JS-2012-gE/gI-E2，將E2基因插入缺失型PRV 變異株JS-2012-gE/gI 中，獲得重組候選疫苗。研究表明，JS-2012-gE/gI-E2 單次接種足以對CSFV 和豬PRV 強毒攻擊提供完全保護，且對仔豬安全。

目前，CSFV 和豬PRV 感染仍然是我國養(yǎng)豬業(yè)的最大威脅。CSFV 和豬PRV 雙價疫苗可簡化疫苗接種程序，降低接種成本。因此，含有E2基因的重組豬PRV 二價DIVA 疫苗有望在CSFV和豬PRV 的控制和根除中發(fā)揮重要作用。CSFV C 株和PRV Bartha-K61 株在我國廣泛使用，幾乎所有仔豬都攜帶CSFV 和豬PRV 的母源抗體。JS-2012-gE/gI-E2 評價表明，PRV 母源抗體可嚴重干擾體液免疫反應(yīng)，是PRV 病毒載體疫苗實際應(yīng)用的主要障礙［37］。

3.4.3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒載體疫苗 Gao等［39-40］以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV）弱毒疫苗株HuN4-F112株的基因組為骨架，插入CSFVE2編碼基因，通過反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了rPRRSV-E2株。初步研究表明，單次接種rPRRSV-E2 可誘導產(chǎn)生PRRSV 和CSFV 特異性抗體，充分保護豬免受PRRSV 和CSFV 的強毒攻擊。PRRSV或CSFV 的母源抗體均不干擾rPRRSV-E2 的免疫［38］。rPRRSV-E2 對HP-PRRSV 和CSFV 的免疫持續(xù)期至少為20 周［39］。PRRSV 母源抗體不干擾rPRRSV-E2 的免疫，這可能由于PRRSV 母源抗體對rPRRSV-E2 的中和效價較低［40］。此外，rPRRSV-E2 免疫期可達到18～26 周。rPRRSV-E2是一種很有前途的雙價DIVA 候選疫苗，只需要1 次接種即可同時對抗PRRSV 和CSFV 感染［38-39］。

3.4.4 腺病毒載體疫苗 重組腺病毒載體在獸用疫苗的研發(fā)中應(yīng)用廣泛。Sun 等［40］開發(fā)了腺病毒AdV5 型載體CSF 疫苗株rAdV-SFV-E2。研究表明，該疫苗對小鼠、家兔和豬安全；雙劑量免疫（抗原含量為6.25×105TCID50）或單劑量免疫（抗原含量為107TCID50）對強毒攻擊具有完全保護作用；rAdV-SFV-E2 效力與C 株一樣不會受到母源抗體影響；接種rAdV-SFV-E2 不會引發(fā)抗載體免疫干擾；與PRV 活疫苗共同免疫對疫苗效力無影響；新生仔豬可以通過免疫母豬獲得母源抗體。

3.4.5 新城疫病毒載體疫苗 新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）可用作載體進行CSF 載體疫苗的構(gòu)建。重組新城疫病毒（rNDV）可使用雞胚進行大量生產(chǎn)，是一種有效和經(jīng)濟的生產(chǎn)方法。NDV 可以通過滴鼻和點眼等途徑接種，從而可改變以NDV 為載體的疫苗接種途徑。Kumar 等［41］利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了表達CSFV E2 和Erns蛋白的rNDV 毒株，經(jīng)鼻內(nèi)接種該疫苗的豬只可產(chǎn)生高滴度的CSFV 中和抗體，表明NDV 是一種有效的載體，可用于開發(fā)針對CSF 和其他豬病的疫苗。

4 展望

CSF 持續(xù)威脅全球養(yǎng)豬業(yè)，雖然已有很多適用于試驗室和臨床診斷的成熟方法，也研發(fā)了大量CSFV 抗原/抗體檢測商品化試劑盒，但診斷方法的敏感性、特異性、可重復(fù)性、現(xiàn)場實時檢測技術(shù)（Point-of-Care Diagnostics，POCD）等仍有較大的進步空間。特別是當前CSF 臨床癥狀復(fù)雜，多種疫病混合感染，繼續(xù)致力于開發(fā)新型、快捷、可靠的診斷方法和試劑產(chǎn)品以促進CSF 疫病的監(jiān)測和控制非常必要。

幾十年來，很多國家一直采用安全高效的減毒活疫苗接種來控制CSF，一些國家成功根除了CSF。減毒活疫苗在免疫產(chǎn)生期和免疫持續(xù)期方面具有突出優(yōu)勢，但缺乏DIVA 特性，不能區(qū)分免疫和野毒感染。E2 亞單位疫苗作為第一代商品化的DIVA 疫苗，安全性良好但有效性還需提升，而且不可用于口服。盡管在CSFV 病原、基因組和蛋白、抗原/抗體診斷技術(shù)、減毒活疫苗、病毒載體疫苗和亞單位疫苗等方面已有很多研究基礎(chǔ)，但CSFV 仍然有許多問題有待解決，如CSF免疫發(fā)病機制、病毒與宿主間互作機制、CSFV毒力決定因素等，攻克CSF 和CSFV 相關(guān)的難題才能研制出能滿足抗原高效呈遞、多價、安全、成本低、易于產(chǎn)業(yè)化且兼具DIVA 特性和市場需求的CSFV 疫苗。