基于黃酮積累的苦蕎萌發(fā)工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

白永亮，林柔敏，吳采瑛，何偉俊，曾 榮，夏 雨

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528200；2.中山洪力健康食品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，廣東 中山 528437）

【研究意義】苦蕎（Fagopyrum tataricum）為蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）一年生雙子葉作物［1］，具有生育期短、耐冷涼、耐貧瘠、適應(yīng)性較強(qiáng)等特點，常作為山區(qū)、丘陵區(qū)輪作換茬的重要作物之一［2-3］，主要分布于我國西南、華北、西北等省區(qū)。隨著食品加工技術(shù)的不斷發(fā)展，以苦蕎作為原料開發(fā)的休閑產(chǎn)品和健康飲品逐漸面市，如苦蕎面、苦蕎茶和苦蕎餅干等。但由于苦蕎口味苦澀、加工性能較差，所以產(chǎn)品中添加量甚少、使用率不高。萌發(fā)是一種安全、健康、快速和簡便的加工改性方法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于大豆、綠豆和花生等作物原料［4-5］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】萌發(fā)不僅可以提高苦蕎內(nèi)對人體有益的活性成分含量，還能降低其中有毒、有害或抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的含量［6-7］。研究表明，黃酮作為苦蕎的主要活性成分，具有豐富的藥理功效，萌發(fā)過程中黃酮含量顯著提升［8-12］，且受到苦蕎預(yù)處理方式［10］、溫度［8］以及光照［13-14］等因素的影響。馬輝等［10］通過微波處理苦蕎種子，研究萌發(fā)苦蕎中總黃酮等含量的變化規(guī)律，結(jié)果表明采用微波協(xié)同L-phe 處理的條件下，萌發(fā)7 d 的苦蕎芽苗的總黃酮含量最高。李曉丹等［11］采用金屬鹽溶液浸種萌發(fā)苦蕎種子，表明采用1 000 mg/L硫酸鋁溶液進(jìn)行萌發(fā)處理后，每100 g 干重總黃酮含量可達(dá)1 347.1 mg。王珺儒等［15］在苦蕎萌發(fā)過程中進(jìn)行了紅光、白光和藍(lán)光等不同光源處理，結(jié)果表明藍(lán)光條件下可促進(jìn)苦蕎合成蘆丁、槲皮苷和槲皮素，提高其抗氧化活性。【本研究切入點】萌發(fā)可以作為一種提高黃酮含量和抗氧化性的有效方法，研究苦蕎萌發(fā)的環(huán)境變量因素對苦蕎黃酮積累的影響具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于黃酮含量的積累，對苦蕎萌發(fā)工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)的萌發(fā)工藝參數(shù)，進(jìn)而探究萌發(fā)對苦蕎抗氧活性的影響，為苦蕎在功能性食品原料中的應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苦蕎籽粒：產(chǎn)自云南昭通，云南朱提苦蕎生物科技開發(fā)有限公司

試劑：次氯酸鈉溶液，分析純，天津市百世化工有限公司；無水乙醇，分析純，湖南江虹試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（濃度＞98%），上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

儀器設(shè)備：TH2-82A型氣浴恒溫振蕩器，常州市化能實驗儀器廠；LHS-150/250HC-Ⅱ恒溫恒濕箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GXZ-500D型恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司；THZ-82型水浴恒溫振蕩器，常州亞特實驗儀器有限公司；紫外可見光分光光度計，上海現(xiàn)科分光儀器有限公司；TG16G型高速離心機(jī)，常州金壇良友儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 苦蕎萌發(fā)樣品預(yù)處理 選取沒有破損、顆粒大小均勻、成熟飽滿的苦蕎種子，用蒸餾水洗凈。用5% NaClO 溶液浸泡消毒15 min，用蒸餾水反復(fù)洗凈。在直徑15 cm 的培養(yǎng)皿中放入已消毒的苦蕎籽粒200 粒，置于一定溫度和濕度的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行浸麥處理。浸麥后的苦蕎籽粒均勻撒在鋪有雙層紗布的培養(yǎng)皿中，置于一定溫度、濕度和光照強(qiáng)度的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)處理，3 次重復(fù)。萌發(fā)結(jié)束后馬上用液氮對苦蕎芽進(jìn)行冷凍，放入冷庫預(yù)凍24 h 后，置于-40℃、0.01 MPa 的環(huán)境下真空冷凍24 h，之后置于高速粉碎機(jī)中在液氮保護(hù)下進(jìn)行磨粉，萌動苦蕎粉過孔徑0.250 mm 篩，用封口袋包裝，于-4℃保存，備用。

1.2.2 單因素試驗 前期在浸麥溫度20℃下采用“浸二斷六”的方式浸麥40 h 后，分別考察萌發(fā)溫度（15、20、25、30、35℃）、光照強(qiáng)度（2500、5000、7500、10000、12500lx）、相對濕度（65%、70%、75%、80%、85%）以及萌發(fā)時間（24、32、40、48、56 h）對萌發(fā)苦蕎黃酮含量的影響。單因素試驗在基礎(chǔ)條件為萌發(fā)溫度25 ℃、萌發(fā)時間48 h、相對濕度80%、光照強(qiáng)度7500lx 的條件下進(jìn)行。

1.2.3 正交試驗 以萌發(fā)溫度、萌發(fā)時間、相對濕度和光照強(qiáng)度為考察因素，以苦蕎黃酮含量為考察指標(biāo)，優(yōu)化萌發(fā)工藝參數(shù)，從中篩選最優(yōu)工藝條件和技術(shù)參數(shù)。根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計的正交試驗因素水平見表1。

表1 苦蕎萌發(fā)工藝的正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal experimental design of Fagopyrum tataricum germination process

1.2.4 總黃酮含量測定 參照張強(qiáng)等［16］方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。

1.2.5 主要黃酮類化合物種類鑒定 基于UHPLC-QE-MS 的方法進(jìn)行黃酮類化合物種類測定。色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm×3 μm）；柱 溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5.0 μL；流動相A：0.1%甲酸水；流動相B：乙腈；定量分析質(zhì)譜儀器：ThermoFisher TSQ Altis；掃描模式：SRM；噴霧電壓：3.8 kV；金屬毛細(xì)管溫度：350℃；鞘氣流速：30 arb；輔助氣流速：10 arb；噴霧溫度：150℃；碰撞能量：20 eV。

1.2.6 抗氧化活性測定 （1）DPPH·自由基清除率。參照Gorjanovi? 等［17］方法并作適當(dāng)修改：將苦蕎和苦蕎芽分別經(jīng)真空冷凍干燥后，粉碎過0.250 mm篩，用乙醇在70℃恒溫水浴鍋中浸提6 h，冷卻后抽濾，用乙醇定容于50 mL 容量瓶中，作為待測液體備用。取300 μL 待測液體，加入2.0 mL 0.093 mmol/L DPPH·溶液混合均勻，在黑暗處放置30 min 后于517 nm 波長處測定吸光度，以體積分?jǐn)?shù)80%乙醇作空白對照。

（2）ABTS+·自由基清除率。參照Kim 等［18］、Oh 等［19］方法并作適當(dāng)修改。待測液制備同（1），取25 mL 7.4 mmol/L ABTS 原液與25 mL 2.45 mmol/L過硫酸鉀混合，在黑暗中放置12～16 h，然后用無水乙醇稀釋50 倍，得到ABTS+·溶液。吸取1 mL 待測液，加入4 mL ABTS+·溶液，混合均勻后在734 nm 波長處測吸光度，以無水乙醇作空白對照。

（3）亞鐵還原能力。參照Lu 等［20］方法并作適當(dāng)修改。待測液制備同（1），吸取900 μL待測液，加入270 μL 去離子水、2.7 mL FRAP 試劑〔用40 mmol/L 鹽酸配 制2.5 mL 10 mmol/L 的TPTZ，再 與2.5 mL 20 mmol/L FeCl3和25 mL 0.3 mol/L的醋酸緩沖液（pH 3.6）混合，加熱至37℃制成〕，混合均勻后37℃水浴30 min，在595 nm 波長處測定吸光度，以80%乙醇作空白對照。所有樣品均設(shè)3 次重復(fù)。

式中，A樣為樣品吸光值，A空為空白對照吸光值。

試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism7.04 軟件進(jìn)行分析，采用SPSS Statistics10.0 軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎萌發(fā)工藝單因素試驗

2.1.1 光照強(qiáng)度對苦蕎黃酮含量的影響 在萌發(fā)溫度25℃、萌發(fā)時間48 h、相對濕度80%條件下，不同光照強(qiáng)度對苦蕎黃酮含量的影響如圖1所示。當(dāng)光照強(qiáng)度為2 500～7 500 lx 時，苦蕎黃酮含量隨著光照強(qiáng)度提高而顯著增加，并于光照強(qiáng)度7 500 lx 達(dá)到最大值；當(dāng)光照強(qiáng)度為7 500～12 500 lx 時，苦蕎黃酮含量隨著光照強(qiáng)度提高而顯著降低（P＜0.05）。綜上，選擇光照強(qiáng)度7 500 lx進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖1 光照強(qiáng)度對黃酮含量的影響Fig.1 Effect of light intensity on flavone content

2.1.2 萌發(fā)溫度對苦蕎黃酮含量的影響 在萌發(fā)時間48 h、相對濕度80%、光照強(qiáng)度7 500 lx 條件下，不同萌發(fā)溫度對苦蕎黃酮含量的影響如圖2 所示。從圖2 可以看出，適當(dāng)升高萌發(fā)溫度可顯著提高苦蕎黃酮含量，在25 ℃下黃酮含量達(dá)到最大值；但隨著溫度不斷升高，會對苦蕎種子生長發(fā)育造成影響。綜上，選擇萌發(fā)溫度25 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖2 萌發(fā)溫度對黃酮含量的影響Fig.2 Effect of germination temperature on flavone content

2.1.3 萌發(fā)時間對苦蕎黃酮含量的影響 萌發(fā)溫度25℃、相對濕度80%、光照強(qiáng)度7 500 lx 條件下，不同萌發(fā)時間對苦蕎黃酮含量的影響如圖3 所示。從圖3 可以看出，苦蕎的黃酮含量隨著萌發(fā)時間增加而顯著提高，在萌發(fā)48 h 達(dá)到峰值，此時苦蕎芽粉中總黃酮含量高達(dá) 7.65%，48～56 h 逐漸趨于平緩，表明芽粉中活性成分的合成積累主要發(fā)生在萌發(fā)初期。綜上，選擇萌發(fā)時間48 h 進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖3 萌發(fā)時間對黃酮含量的影響Fig.3 Effect of germination time on flavone content

2.1.4 相對濕度對苦蕎黃酮含量的影響 在萌發(fā)溫度25 ℃、萌發(fā)時間48 h、光強(qiáng)7 500 lx 條件下，不同相對濕度對苦蕎黃酮含量的影響如圖4 所示，當(dāng)相對濕度由65%提高至80%時，苦蕎黃酮含量顯著提高并達(dá)到峰值，相對濕度80%～85%黃酮含量無顯著變化。綜上，選擇相對濕度80%進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖4 相對濕度對黃酮含量的影響Fig.4 Effect of relative humidity on flavone content

2.2 苦蕎萌發(fā)工藝的正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交試驗設(shè)計，優(yōu)化影響苦蕎黃酮含量的萌發(fā)條件。由表2 極差分析結(jié)果可以看出，4 個因素對苦蕎黃酮含量影響的主次順序為C＞A＞B＞D，即萌發(fā)時間對苦蕎黃酮含量影響較大，光照強(qiáng)度和萌發(fā)溫度次之，相對濕度對苦蕎黃酮含量影響相對較小。由K值可以看出A2B2C2D2為最優(yōu)組合，因此苦蕎最優(yōu)萌發(fā)工藝為萌發(fā)溫度25℃、萌發(fā)時間48 h、光照強(qiáng)度7 500 lx、相對濕度80%。在此最佳工藝條件下，萌發(fā)苦蕎黃酮含量為7.489%，較原麥（1.562%）高5.927 個百分點。

表2 苦蕎萌發(fā)工藝的正交優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal optimization design and results of Fagopyrum tataricum germination process

2.3 苦蕎萌發(fā)前后的黃酮化合物種類測定結(jié)果

在萌發(fā)時間48 h、光照強(qiáng)度7 500 lx、萌發(fā)溫度25℃、相對濕度80%的最優(yōu)萌發(fā)工藝條件下，苦蕎萌發(fā)結(jié)果見圖5，萌發(fā)前后苦蕎的主要黃酮類化合物包括金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、4'-O-葡萄糖苷牡荊素、山奈酚3-葡萄糖鼠李糖苷、槲皮素、木犀草素、異鼠李素、橙黃決明素-β-D-葡萄糖苷、棕矢車菊素、異鼠李素-3-鄰甲基橙皮苷、山奈酚-3-O-蕓香苷以及山奈酚-7-Oβ-D-吡喃葡萄糖苷，萌發(fā)后苦蕎中的4'-O-葡萄糖苷牡荊素、異槲皮苷、金絲桃苷、蘆丁、異鼠李素-3-鄰甲基橙皮苷和棕矢車菊素含量顯著提高，槲皮素含量顯著降低?？梢姡嗍w經(jīng)過萌發(fā)后，除槲皮素外的各類黃酮化合物峰面積均有明顯升高，總黃酮含量顯著提高。因此，萌發(fā)可以增加苦蕎中黃酮化合物的含量，進(jìn)而提高苦蕎的抗氧化能力。

圖5 苦蕎萌發(fā)前后黃酮類化合物峰面積的變化Table 5 Changes of peak areas of Fagopyrum tataricum flavones before and after germination

2.4 苦蕎萌發(fā)前后的抗氧化活性測定結(jié)果

在萌發(fā)溫度25℃、萌發(fā)時間48 h、光照強(qiáng)度7 500 lx、相對濕度80%的最優(yōu)萌發(fā)工藝條件下萌發(fā)，苦蕎的抗氧化活性見表3。由表3 可知，苦蕎萌發(fā)后，DPPH·自由基清除率、ABTS+·自由基清除率以及亞鐵還原能力均顯著提高，表明萌發(fā)能夠提高其抗氧化活性?？嗍w抗氧化活性提高可能與萌發(fā)過程中各種內(nèi)源酶被激活導(dǎo)致黃酮類化合物含量變化有關(guān)，同時也與黃酮類化合物種類有關(guān)，不同種類黃酮類化合物對抗氧化活性的貢獻(xiàn)需進(jìn)一步研究［21］。

表3 苦蕎萌發(fā)前后的抗氧化活性變化Table 3 Changes of antioxidant activity of Fagopyrum tataricum before and after germination

3 討論

目前，苦蕎萌發(fā)工藝研究主要集中在以萌芽特性（發(fā)芽勢、萌芽率、芽長）為指標(biāo)的工藝優(yōu)化方面，通過控制萌發(fā)條件提高苦蕎萌發(fā)率、增強(qiáng)苦蕎萌發(fā)活力［22-23］，但以功能性成分為衡量指標(biāo)的工藝優(yōu)化研究相對較少。本研究基于苦蕎萌發(fā)過程中黃酮類化合物的積累，探討了萌發(fā)時間、光照強(qiáng)度、萌發(fā)溫度和相對濕度4 個因素對苦蕎萌發(fā)前后黃酮化合物種類和含量的影響。本研究獲得的產(chǎn)品為苦蕎芽，與吳志偉［24］、趙佳利等［25］研究的苦蕎芽菜有所區(qū)別，但環(huán)境因素影響的結(jié)果相似。本研究中，除萌發(fā)時間外，光照強(qiáng)度是影響苦蕎黃酮積累的顯著因素之一。研究表明，黃酮的合成與苯丙環(huán)代謝密切相關(guān)，光照通過影響苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性促進(jìn)苯丙環(huán)代謝，進(jìn)而提高苦蕎黃酮含量［26］。也有研究表明，光照與否對苦蕎總黃酮含量影響不大，但避光條件培養(yǎng)的芽重、胚軸和胚根長度都優(yōu)于光照條件［27］，這可能與選取的光照條件有關(guān)。

本研究測定的苦蕎萌發(fā)后總黃酮含量達(dá)到7.489%，與童曉萌等［8］、許先猛等［28］測得的黃酮含量（10.34 mg/g 和62.6 mg/g）相比，本萌發(fā)工藝得到的黃酮含量較高，具有顯著優(yōu)勢。本研究中，苦蕎萌發(fā)前后黃酮類化合物的種類不變，主要包括4'-O-葡萄糖苷牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素和異鼠李素-3-鄰甲基橙皮苷，與許先猛等［28］研究的黃酮種類有所差異。對比前人相關(guān)研究，不同品種和產(chǎn)地的苦蕎中含有的黃酮種類有所差異。例如，徐寶才等［29］采用的四川苦蕎中主要含有槲皮素-3-蕓香糖葡萄糖苷、蘆丁、山奈酚-3-蕓香糖苷和槲皮素，而閆超等［30］研究的內(nèi)蒙古苦蕎中的黃酮主要包括蘆丁和少量的槲皮素、兒茶素、表兒茶素和山奈酚。

本研究比較了苦蕎萌發(fā)前后的抗氧化性變化，通過DPPH 自由基清除率、ABTS 自由基清除率和亞鐵還原能力的體外抗氧化指標(biāo)進(jìn)行測定，應(yīng)進(jìn)一步通過測定體內(nèi)抗氧化活性解釋苦蕎黃酮的抗氧化機(jī)理。此外，可以研究苦蕎黃酮種類與抗氧化性的相關(guān)性，后續(xù)通過特定黃酮的調(diào)控，更大程度提高苦蕎黃酮的抗氧化性。從種子萌發(fā)過程代謝途徑方面來看，不同萌發(fā)時期所涉及的黃酮代謝途徑可能有一定差異。因此，進(jìn)一步研究苦蕎萌發(fā)過程中的代謝途徑，通過調(diào)控促進(jìn)苦蕎功能性成分合成，對深入研究苦蕎種子萌發(fā)的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究通過單因素試驗考察了萌發(fā)時間、光照強(qiáng)度、萌發(fā)溫度和相對濕度對苦蕎萌發(fā)的總黃酮含量的影響，除萌發(fā)時間外，光照強(qiáng)度是影響黃酮積累的主要因素。通過正交試驗優(yōu)化后，苦蕎最佳萌發(fā)工藝為萌發(fā)時間48 h、光照強(qiáng)度7 500 lx、萌發(fā)溫度25℃、相對濕度80%，在此條件下，苦蕎總黃酮含量達(dá)7.489%，比苦蕎原麥黃酮含量1.562%提高了5.927 個百分點。萌發(fā)前后，苦蕎中主要的黃酮化合物種類不變，主要包括4'-O-葡萄糖苷牡荊素、異槲皮苷、槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、異鼠李素-3-鄰甲基橙皮苷和棕矢車菊素，除槲皮素外其他種類均有提升。萌發(fā)后苦蕎的抗氧化活性顯著提高，DPPH 自由基清除率由萌發(fā)前49.97%提高到54.39%，ABTS 自由基清除率由38.86%提高到52.12%，F(xiàn)RAP 由萌發(fā)前的52.59%提高到64.87%。