黃瓜疫霉菌拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選與鑒定

鄭 京，梁樂霞，宣倩倩，郭慧瀅，周志國，孫澤敏，左國才

（1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊 065000；2.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

【研究意義】疫霉菌在全球廣泛分布，包括一些破壞性侵染重要作物和森林的毀滅性病原體。卵菌綱霜霉目腐霉科疫霉屬Phytophthora［1-2］是植物病原菌中危害最大的屬之一，其中肉桂疫霉菌（Phytophthora cinnamomi）是世界上最具毀滅性的植物病原菌之一［3-4］。本研究涉及到的掘氏疫霉菌（Phytophthora drechsleri）具短絨毛狀氣生菌絲體，這種氣生菌絲體能夠引起黃瓜疫?。‥pidemic Disease，簡稱ED）的發(fā)生。ED 是一種土傳病害，具有較強(qiáng)的毀滅性。黃瓜在感染掘氏疫霉菌后，發(fā)病兇猛，擴(kuò)散迅速，在世界范圍內(nèi)引起嚴(yán)重危害，然而利用植物內(nèi)生菌（endophyte）與植物的互作可以防治這種病害。植物內(nèi)生菌是微生物學(xué)和植物微生態(tài)學(xué)的交叉研究領(lǐng)域，有著很好的發(fā)展前景。目前“資源節(jié)約，環(huán)境友好”已經(jīng)成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展主流，植物內(nèi)生菌的研究已經(jīng)成為生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向，該領(lǐng)域的相關(guān)研究成果不僅在微生物基礎(chǔ)研究方面具有十分重要的理論價(jià)值，而且在解決人口過快增長、資源短缺、環(huán)境污染和農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展等方面也具有重要的實(shí)踐意義。

【前人研究進(jìn)展】20 世紀(jì)40 年代末，日本的黃瓜被一種疫霉菌所侵染，發(fā)生了腳腐病，經(jīng)Katsura 實(shí)地仔細(xì)觀察和深入研究，將該疫霉菌認(rèn)定為一種霉菌新種（命名為Phytophthora melonisKatsura）。1970 年代，我國的黃瓜也大面積遭遇疫病，南京農(nóng)學(xué)院植物病理教研組陸家云等對侵染我國黃瓜的疫霉屬真菌進(jìn)行了生物學(xué)及分類學(xué)研究，表明Phytophthora melonis和Phytophthora drechsleri之間的差異極小，只是Phytophthora melonis的致病性僅限于葫蘆科植物，因此認(rèn)為可以將原來在黃瓜上鑒定的病原菌重新鑒定為Phytophthora drechsleri［5］。之后便有研究者開始利用生物方法防治由該病原菌引起的疫病。Kim等從土壤中分離得到176 株菌株，其中49 株對Phytophthora drechsleri有拮抗作用，最明顯的為腸桿菌Enterobacter asburiae［6］。疫霉菌通常有著廣泛的寄主，除黃瓜外還有辣椒、大豆等。有研究者將多粘類芽孢桿菌進(jìn)行固體發(fā)酵制成肥料用于防治辣椒疫霉?。?］。也有研究者從基因水平上篩選出抗大豆疫霉病的基因，種植含有抗病基因的大豆品種從而預(yù)防大豆疫病的發(fā)生［8］。

【本研究切入點(diǎn)】21 世紀(jì)以來，生物防治逐漸成為熱點(diǎn)。由于生存形式獨(dú)特，植物內(nèi)生菌逐漸被專家們廣泛關(guān)注。通過后續(xù)深入研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生水解酶、植物生長調(diào)節(jié)劑、抗菌物質(zhì)等多種化合物，以增強(qiáng)植物抗病能力，促進(jìn)植物快速生長［9-10］。植物內(nèi)生菌還可使植物天然定殖，且能夠在植物體內(nèi)穩(wěn)定生存下來。因此，利用植物內(nèi)生菌這種手段會使防治效果更加穩(wěn)定、持久且無污染?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究的植物內(nèi)生細(xì)菌分離篩選自黃瓜葉片，通過平板對峙法和發(fā)酵液拮抗法篩選出對掘氏疫霉菌具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌并對其進(jìn)行鑒定。分析此內(nèi)生細(xì)菌對掘氏疫霉菌的拮抗作用，為進(jìn)一步開展理論研究和應(yīng)用提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃瓜（中農(nóng)26 號，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所研制）葉片于2021 年6 月25 日采自天津市武清區(qū)下朱莊。

掘氏疫霉，目前存于本實(shí)驗(yàn)室，于2021 年6 月15 日由北京理工大學(xué)生命學(xué)院馮永君先生惠贈。

NA 培養(yǎng)基：1.5 g 牛肉膏、5.0 g 蛋白胨、7.5 g NaCl，加入去離子水定容至500 mL，調(diào)節(jié)pH 值至7.2～7.4，加入7.5 g 瓊脂混勻；121℃條件下蒸汽滅菌20 min。

PDA 培養(yǎng)基：100.0 g 除去表皮的馬鈴薯塊、10.0 g 葡萄糖、7.5 g 瓊脂，加去離子水至500 mL；115℃、0.1 MPa 條件下蒸汽滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離和初步鑒定 2021 年6 月27日于廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心開始展試驗(yàn)。

取黃瓜葉片，清理表面并洗凈吸干。對進(jìn)行了初步處理的黃瓜葉片的表面完成相關(guān)消毒處理，具體操作為：（1）將濃度為75%的乙醇浸泡黃瓜葉片60 s；（2）將濃度為2.5%的次氯酸浸泡黃瓜葉片5 min；（3）將濃度為75%的乙醇沖洗黃瓜葉片30 s；（4）使用無菌水反復(fù)沖洗黃瓜葉片5 次；（5）為了檢查黃瓜葉片表面是否已徹底消毒，取最后一次洗滌水100 μL，涂布到NA 平板；（6）在超凈工作臺中取經(jīng)過處理的黃瓜葉片（對角線處）1 g 放入研缽，并且加入9 mL 無菌水，研磨至勻漿；（7）靜置20 min 后，設(shè)置3 個(gè)試驗(yàn)處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，分別取100 μL 稀釋液（按3 個(gè)稀釋濃度梯度），涂布NA 平板后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中2 d 左右。

根據(jù)待檢菌株的鏡檢特征、革蘭氏染色反應(yīng)、菌落排列方式和菌落形態(tài)特征等進(jìn)行初步篩選，篩選出存在比較明顯差異的菌落，將篩選出的菌落采用平板劃線法進(jìn)行3 次純化操作，純化后，再使用甘油管進(jìn)行冷凍，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗內(nèi)生菌的篩選與拮抗作用測定 平板對峙法：取掘氏疫霉菌接種至PDA 平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中48 h 左右，直至菌絲生長至鋪滿平板（達(dá)到生長旺盛），在平板邊緣取直徑為6 mm 的菌絲塊，置于距離中央等距打有4 孔的空白PDA 平板中央，在其中的1 個(gè)孔中滴加NA 液體培養(yǎng)基100 μL 作為空白陰性對照，剩下3 孔作為試驗(yàn)處理，分別滴加100 μL 待測內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)液（1 × 108CFU/mL 濃度）；同時(shí)設(shè)置1 個(gè)中央接種菌絲塊但不打孔接種待測細(xì)菌的空白PDA 平板作為掘氏疫霉菌菌絲生長距離的對照。在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至掘氏疫霉菌菌絲生長距離徹底滿過對照孔并延伸至平板邊沿，每個(gè)處理3 次重復(fù)，計(jì)算菌絲生長抑制率：

發(fā)酵液拮抗法：將待測菌株活化后接種至NA液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)（30℃，2.67 r/s）5 d 后，吸取適量培養(yǎng)液用過濾器（0.22 μm）過濾，在16 mL 溫?zé)岬腜DA 培養(yǎng)基中加入4 mL 濾液（同時(shí)作為陰性對照設(shè)置添加4 mL 無菌水處理）充分混合均勻后倒平板，在平板中央接種直徑為6 mm的掘氏疫霉菌菌絲塊，移入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)，計(jì)算抑菌率：

1.2.3 拮抗內(nèi)生菌的分子鑒定

在液體NA 培養(yǎng)基中接種待測拮抗細(xì)菌，置恒溫?fù)u床（30℃，2.67 r/s）培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取培養(yǎng)液利用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，以待測菌株基因組DNA 為模板，采用引物（27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′） 擴(kuò)增其16S rDNA 序列。

PCR 反應(yīng)體系：30 μL 2×PCR Buffer，引物各3 μL，9 μL DNA 模板，超凈水補(bǔ)足至60 μL；PCR擴(kuò)增程序如下：94℃ 10 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物回收后用pMD18-T載體進(jìn)行T連接，提取重組質(zhì)粒測序（蘇州金唯智生物科技有限公司）。

將所獲序列導(dǎo)入NCBI 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的BLAST 查詢系統(tǒng)進(jìn)行比對分析，用CLUSTAL_X 程序?qū)δ繕?biāo)菌株及相關(guān)菌株16S rDNA 序列進(jìn)行處理獲得ALN 文件，然后用MEGA 7 軟件對ALN 文件進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最后進(jìn)行分類分析、數(shù)據(jù)距離度量和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建（鄰域連接法Neighbor-Jioning，NJ）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜葉內(nèi)生菌的分離與初步鑒定

以黃瓜葉片為原材料，進(jìn)行內(nèi)生菌分離與純化操作，根據(jù)待測菌株的鏡檢、革蘭氏染色反應(yīng)、菌落排列方式和菌落形態(tài)等差異，獲得32 株內(nèi)生細(xì)菌編號為CL1～CL3，其中革蘭氏陰性桿菌10 株、革蘭氏陽性桿菌13 株、革蘭氏陽性球菌9 株。

2.2 掘氏疫霉菌拮抗內(nèi)生菌的篩選

以分離得到的32 株黃瓜內(nèi)生細(xì)菌為材料，利用平板對峙法進(jìn)行相關(guān)拮抗試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)8 株對掘氏疫霉有較強(qiáng)抑制作用的拮抗菌株（表1），菌絲抑制率為10.3%～54.3%，抑菌半徑為1～7 mm；抑菌效果較好的菌株有3 株分別為CL7、CL9 和CL15，抑菌半徑及菌絲抑制率分別為：6 mm，45.2%；7 mm，54.3%；6 mm，40.2%。

表1 抗掘氏疫霉內(nèi)生拮抗菌的抑菌半徑和菌絲抑制率Table 1 Inhibition radius and mycelial inhibition rate of endophytic antagonists against Phytophthora drechsleri

圖1 展示了具有較強(qiáng)抑制作用的3 株拮抗菌株，從圖1 可以看出3 株拮抗菌均能有效抑制掘氏疫霉的生長。

圖1 黃瓜內(nèi)生細(xì)菌對掘氏疫霉平板對峙實(shí)驗(yàn)的結(jié)果Fig.1 Results of plate confrontation experiment of endophytic bacteria against Phytophthora drechsleri in cucumber

通過發(fā)酵液拮抗法實(shí)驗(yàn)，對菌株CL7、CL9、CL15 作進(jìn)一步測定，結(jié)果表明，3 個(gè)菌株的發(fā)酵濾液均對掘氏疫霉有拮抗效果（圖2），其中CL9 菌株發(fā)酵液對掘氏疫霉菌的抑菌率達(dá)到72.2%（表2）。

圖2 CL9 菌株對掘氏疫霉菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of CL9 strain on Phytophthora drechsleri

表2 抑制作用較強(qiáng)菌株發(fā)酵液對抗掘氏疫霉的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of strong strain fermentation liquor against Phytophthora drechsleri

2.3 掘氏疫霉菌拮抗內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定

將抑菌效果較強(qiáng)的拮抗菌（抑菌半徑＞6 mm，菌絲抑制率＞ 40.0%）進(jìn)行16S rDNA 序列測定及同源性分析（表3），并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。從表3 可以看出，CL9 和CL15 分別與Pseudomonas f lavescens和Staphylococcussp.親 緣關(guān)系最近，同源性分別達(dá)到99.72%和99.93%；CL7 與Pantoea wallisii同源性為99.58%。

圖3 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的拮抗內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of antagonistic endophytic bacteria based on 16 SrDNA sequences

表3 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA 序列相似性分析Table 3 Similarity analysis of 16S rDNA sequences of antagonistic endophytic bacteria

經(jīng)分子鑒定，確定具備較強(qiáng)拮抗效果的3 株內(nèi)生細(xì)菌分別屬于泛菌屬Pantoeasp.（CL7）、假單胞菌屬Pseudomonassp.（CL9）和葡萄球菌屬Staphylococcussp.（CL15）。

3 討論

黃瓜疫病發(fā)生普遍，黃瓜各個(gè)部位均可被侵染，造成幼苗猝倒、莖桿枯死、果實(shí)腐爛，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致絕產(chǎn)，對黃瓜產(chǎn)量影響很大。黃瓜疫病暴發(fā)突然，采瓜季節(jié)易造成黃瓜植株成片枯死，使黃瓜減產(chǎn)60%以上。青海、海南、江蘇等地都曾有過黃瓜疫病大面積暴發(fā)的案例。黃瓜疫病的防治方法主要以農(nóng)業(yè)防治（利用云南黑籽南瓜作砧木與黃瓜嫁接，利用太陽能對土壤進(jìn)行消毒等）和化學(xué)防治（用72.2%霜霉威水、18.7%烯?！み吝蝓ニ龋橹鳌＿@些防治措施受地理氣候等因素影響，有多種局限性；而且化學(xué)試劑毒性強(qiáng)，在植物和土壤中停留時(shí)間長，容易使霉菌產(chǎn)生抗藥性，對人類和環(huán)境造成威脅［11-13］?，F(xiàn)有研究報(bào)道稱，植物內(nèi)生細(xì)菌不僅可以促進(jìn)宿主植物生長、產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，還可以增強(qiáng)宿主的抗逆性［14］。馬東麗等以曼陀羅葉片為材料分離得到的內(nèi)生細(xì)菌MY1 對谷瘟病菌等14 種植物病原真菌均有良好的抑菌效果，可以證實(shí)植物內(nèi)生細(xì)菌具有增強(qiáng)宿主抗逆性的特點(diǎn)［15］。本研究以黃瓜葉片為材料發(fā)現(xiàn)對掘氏疫霉菌有較強(qiáng)抑制作用的3 株拮抗菌株，這3 株拮抗菌株分別屬于泛菌屬Pantoeasp.、假單胞菌屬Pseudomonassp.和葡萄球菌屬Staphylococcussp.，為植物內(nèi)生菌相關(guān)研究提供材料，同時(shí)為利用植物內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行生物防治提供了有效思路。

利用植物內(nèi)生菌防治植物病害異于傳統(tǒng)方法，從植物-微生物互作、微生物之間互作、微生態(tài)等角度研究植物病原菌的防治綠色環(huán)保，具有很強(qiáng)的潛在應(yīng)用價(jià)值［16］。Gao 等發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌SXKF16-1 對茄花鐮刀菌和尖葉鐮刀菌具有明顯的拮抗作用，能增加根區(qū)土壤細(xì)菌多樣性，在防治土傳病害黃芪根腐病的應(yīng)用上有良好的研究前景［17］；Wang 等研究證實(shí)丹參內(nèi)生真菌抗真菌效果顯著，對改善作物品質(zhì)和生產(chǎn)具有重要意義［18］。目前，應(yīng)用最廣泛的拮抗微生物主要有鏈霉菌、芽孢桿菌、類芽孢桿菌及假單胞菌等［19-21］。芽孢桿菌具有促進(jìn)植物生長的功能并應(yīng)用于多種植物病原菌的生物防治，通過分泌細(xì)胞外代謝物如抗生素、細(xì)胞壁水解酶和鐵載體等表現(xiàn)出拮抗活性［22］。而本研究篩選出的內(nèi)生細(xì)菌假單胞菌屬（Pseudomonassp.）CL9 對掘氏疫霉菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗效果，其發(fā)酵液也存在很強(qiáng)的抑菌作用，說明該菌株也產(chǎn)生了某種抗菌物質(zhì)，為后續(xù)深入研究內(nèi)生拮抗細(xì)菌的抑菌作用機(jī)制提供良好的材料。

4 結(jié)論

本研究以黃瓜葉片為材料，根據(jù)菌株的特征差異分離得到32 株內(nèi)生細(xì)菌，隨后利用平板對峙法及發(fā)酵液拮抗法實(shí)驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，最終得到3 株掘氏疫霉拮抗菌株。通過分子鑒定確定其分別屬于泛菌屬Pantoeasp.（CL7,菌絲抑制率45.2%）、假單胞菌屬Pseudomonassp.（CL9，菌絲抑制率54.3%）和葡萄球菌屬Staphylococcussp.（CL15，菌絲抑制率40.2%）。