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    耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測新方法

    2022-06-07 16:27:40董源源
    智慧醫(yī)學(xué) 2022年4期
    關(guān)鍵詞:葡萄球菌特異性熒光

    董源源

    摘要 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)可導(dǎo)致多種感染病。萬古霉素是治療感染的最后藥物,隨著耐藥性不斷增加,發(fā)現(xiàn)了對萬古霉素耐藥的菌株。本研究通過大腸桿菌表達系統(tǒng),表達出具有識別活性的可溶性細(xì)胞壁結(jié)合域(CBD)蛋白,并偶聯(lián)磁珠(MBs)作為捕獲分子,實現(xiàn)分離。通過裂解細(xì)菌獲得內(nèi)部的ATP催化化學(xué)反應(yīng),收集釋放的生物發(fā)光( BL )信號,定量檢測目標(biāo)細(xì)菌。結(jié)果表明該方法具有簡單、快速診斷MRSA的應(yīng)用潛力。

    關(guān)鍵詞:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;細(xì)胞壁結(jié)合域;生物發(fā)光分析

    1. 導(dǎo)論

    超級細(xì)菌的耐藥性使診斷與治療變得困難,給公共醫(yī)療資源帶來巨大負(fù)擔(dān)。金黃色葡萄球菌可以引起嚴(yán)重感染,隨著耐藥性增加,很多常用的抗生素都無法用以治療[1],還可能可引發(fā)疾病。萬古霉素是治療MRSA最后的藥物,但由于存在對其耐藥的MRSA菌株,給治療感染帶來了巨大困難。CBD是革蘭氏陽性菌內(nèi)溶素的組成部分,負(fù)責(zé)識別和結(jié)合細(xì)菌內(nèi)保守板塊,給予了內(nèi)溶素的特異性。每個細(xì)胞上CBD結(jié)合位點高達107個,結(jié)合能力與抗體相當(dāng)。CBD具有更寬的識別譜且成分僅為蛋白質(zhì),故具有較高安全保障。本研究表達出CBD結(jié)合域,以其為生物捕獲探針,利用ATP生物發(fā)光技術(shù),建立了一種特異性識別MRSA的新方法,利用ATP提取液可以使MRSA分解,進行在實際樣中的應(yīng)用。

    2.實驗

    2.1儀器:蛋白純化儀來自GE,化學(xué)發(fā)光檢測儀來自Remax,熒光顯微鏡來自Nikon Instruments,酶標(biāo)儀來自Molecular Devices,超聲波細(xì)胞粉碎機來自SCIENTZ,雙系統(tǒng)超低溫冰箱來自中科都菱。

    2.2實驗方法

    (1)CBD蛋白的大量表達純化:預(yù)表達后大量表達蛋白,取8 mL過夜菌接種于LB液體培養(yǎng)基中,加IPTG至其最終的濃度為0.5 mM后。離心15 min收集菌體并復(fù)溶于PBS 中。加蛋白酶抑制劑使終濃度為1 mM。將混合液置于冰水混合物中超聲破菌,離心機在4 ℃下以4000 rmp 離心40 min,上清用0.45 ?m無菌濾器過濾。(2)CBD對MRSA的廣譜識別能力測定:取1 mL MRSA菌液,離心3 min后棄去上清并收集沉淀,復(fù)溶于PBS中,加入10 ?L GFP-CBD,避光反應(yīng)30min。再將染色細(xì)胞以5000 rmp離心3 min,去除上清,將沉淀復(fù)溶于PBS。將制得的成片置于熒光顯微鏡下,隨后在明場和綠色熒光通道下觀察。(3)CBD-MBs 的制備:取80 ?L MBs懸浮液置于在磁力架上,用10 mM MES緩沖液洗滌后,將洗滌好的MBs加入到1 mL MES 緩沖液中,于37℃反應(yīng)1 h后,將MBs重新分散于2 mL CBD溶液中,在4℃下過夜避光反應(yīng)。將反應(yīng)完成的反應(yīng)液PBS洗滌3次,再將偶聯(lián)完成的CBD-MBs 重新分散于封閉液中,于室溫下反應(yīng)30 min。(4)MRSA的檢測:取1 mL的MRSA菌液加60 ?L的CBD-MBs 懸浮液,在37℃下孵育1 h,加入100 ?L ATP提取液反應(yīng)2 min,再加入100 ?L β-CD(tris-HCl),反應(yīng)1 min取50 ?L反應(yīng)液至微孔中,加入發(fā)光底液以觸發(fā)BL信號。

    2.3結(jié)果與討論

    2.3.1 MRSA的檢測的原理:CBD-MBs通過所建立的磁分離技術(shù)富集實際樣中的MRSA,CBD可以與細(xì)菌細(xì)胞壁上保守表位結(jié)合,形成非共價鍵與CBD特異性的結(jié)合,聯(lián)用磁性分離方法,迅速富集并分離MRSA。裂解液使細(xì)菌裂解,導(dǎo)致ATP釋放,釋放的ATP與基于螢光素的BL試劑溶液反應(yīng),產(chǎn)生強烈的BL信號。

    2.3.2 CBD的廣譜識別能力:綠色熒光通道下,MRSA菌株表面上均發(fā)出強烈的綠色熒光,與明場下細(xì)菌的位置可以重疊,但在MSSA菌株上并不能觀察到綠色熒光。證明CBD可以廣譜識別所有MRSA 菌株類型,并排除來自MSSA菌株干擾,為其臨床應(yīng)用帶來可能。

    2.3.3 MRSA的檢測:用ATP生物發(fā)光技術(shù),收集釋放的BL,信號范圍為1.0×103 CFU mL-1-1.0×107 CFU mL-1,對于低中高濃度MRSA進行相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分析,其RSD值分別為0.6%,2.1% 和0.1%(n = 3),檢測性能表示式:

    2.3.4基于CBD檢測方法的特異性:選用三種革蘭氏陽性菌及三種革蘭氏陰性菌,所有待測干擾菌和MRSA的濃度均為1.0×106 CFU mL-1。DI值分別為1.1%、1.2%、1.1%、0.8%、1.3%和1.0%,混合物1為0.3%,包含這6種干擾菌和MRSA的混合液2的BL信號與單獨含有MRSA的BL信號強度差異為8%,說明沒有干擾,CBD有高度特異性,只能識別MRSA 菌株。干擾度計算方程式:

    2.3.5實際樣品檢測:對尿液與生理鹽水樣品都進行2種濃度的檢測,回收率均在 83.0% - 110.0%間,RSD值均不超過8.6%,故該方法適用于各類樣品中MRSA檢測。

    3. 結(jié)論

    本研究將CBD作為生物識別試劑,偶聯(lián)磁分離技術(shù),對目標(biāo)細(xì)菌的快速分離,通過ATP生物發(fā)光技術(shù)收集釋放的BL信號來定量檢測,建立了一種快速準(zhǔn)確的檢測方法,可應(yīng)用到實際樣品檢測MRSA 的含量,在實際診斷中有巨大潛力。

    基金項目:國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助(項目編號:202110635110)

    參考文獻

    [1] Huskins, W. C.; Goldmann, D. A. Controlling meticillin-resistant Staphylococcus aureus, aka “Superbug”. Lancet 2005, 365(9456), 295-297.2E02E538-F772-4947-BDDE-EE3300E4F93E

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