基于DNA條碼技術(shù)的高通量食品中動物源性成分的快速檢測方法

張先茂 顏庭林

摘 要：本文應(yīng)用DNA條碼技術(shù)，研究通用引物，擴(kuò)增動物源性加工食品中線粒體基因COI，開發(fā)檢驗快速、準(zhǔn)確、低成本和高通量的食品中動物源性成分的快速檢測方法。結(jié)果表明，該方法有很好的特異性，最低檢出限為0.10 ng/μL，可以對未知、已知動物源性成分的食品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的定性、定量檢測。

關(guān)鍵詞：DNA條碼技術(shù);高通量快速檢測;動物源性成分;通用引物

Rapid Detection of Animal Derived Ingredients in High Throughput Food Based on DNA Barcode Technology

ZHANG Xianmao， YAN Tinglin

（Gansu Province Product Quality Supervision and Inspection Research Institute， Lanzhou 730050， China）

Abstract： In this paper， DNA barcode technology is used to study universal primers to amplify the COI of mitochondrial genes in animal-derived processed foods， and to develop a rapid， accurate， low-cost and high-throughput rapid detection method for animal-derived components in food. The results show that the method has good specificity， the minimum detection limit is 0.10 ng/μL， and it can perform rapid and accurate qualitative and quantitative detection of food with unknown and known animal-derived components.

Keywords： DNA bar code technology; high throughput rapid detection; animal derived ingredients; universal primers

DNA條形碼技術(shù)是近年來新興的DNA分子檢測技術(shù)[1]。不同于傳統(tǒng)的分子檢測技術(shù)，DNA條形碼以一對通用引物擴(kuò)增物質(zhì)的線粒體基因COI標(biāo)準(zhǔn)序列，通過序列內(nèi)堿基的多樣性對已知和未知的成分進(jìn)行識別，且這種技術(shù)已逐漸應(yīng)用于食品領(lǐng)域[2]。在動物源性食品中，線粒體基因COI已成為動物物種鑒定中公認(rèn)的理想DNA條形碼片段。由于DNA分子的熱穩(wěn)定性，DNA條碼技術(shù)在加工肉類食品中鑒定動物源性成分、標(biāo)簽符合性查驗等方面被廣泛應(yīng)用[3-5]。

目前對肉類加工食品中未知動物源性成分的檢驗還處于空白階段，傳統(tǒng)的Sanger測序技術(shù)僅能對已知動物源性成分進(jìn)行檢驗，在對多種未知動物源性成分的檢驗方面還存在不足。本實驗應(yīng)用DNA條碼技術(shù)，結(jié)合納米技術(shù)，開發(fā)能快速、準(zhǔn)確檢測食品中動物源性成分的檢驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

動物源性食品來源：熟制牛肉、熟制羊肉、熟制鴨肉、熟制雞肉、熟制豬肉和熟制牦牛肉購自蘭州某大型超市，-18 ℃保存;熟制馬肉購自甘南藏區(qū)。

1.2 試劑

動物源性成分DNA提取試劑盒（天根生物科技有限公司，包括DNA裂解液;PCR緩沖液 10X;dNTP 10X;Tap酶5 U/μL）;瓊脂糖（Sigma）;GEL-Red（碧云天生物科技有限公司，

10000X）。

1.3 設(shè)備

PCR儀（美國伯樂，T100）;水平電泳儀（美國伯樂，PowrpacBasic）;凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂，GEL DOCXR）;熒光定量PCR儀（美國賽默飛，QuantStudio）;核酸蛋白測定儀（美國賽默飛，Nanodrop one）;組織破碎儀（格蘭迪森，GD-IN）。

1.4 實驗方法

1.4.1 引物探針設(shè)計

應(yīng)用PrimerBank，結(jié)合VALENTINI等[6]的方法，設(shè)計牛肉、羊肉、鴨肉、雞肉和豬肉的通用引物，引物探針序列如表1所示。

1.4.2 樣本DNA提取及質(zhì)量檢測

根據(jù)試劑盒說明書步驟提取動物源性食品樣品DNA。提取純化后的DNA溶液為10 μL，取0.2 μL到核酸蛋白測定儀中測定純度，核酸純度控制在70～120 ng/μL[7]。

1.4.3 高通量DNA條碼技術(shù)的建立

與賽默飛生物科技有限公司合作，將設(shè)計的通用內(nèi)參基因序列，F(xiàn)'端通用引物，R'端通用引物，探針引物固定在熒光實時定量PCR儀器配套的微流控芯片上。將純化后濃度為70～120 ng/μL的核酸，牛、羊、鴨、雞、豬DNA滴加在熒光實時PCR微流控芯片上[8]。通過優(yōu)化實驗，最終確定多重實時熒光PCR反應(yīng)最優(yōu)條件見表2。

1.4.4 方法特異性及檢出限

取同樣質(zhì)量的牛、羊、鴨、雞、豬、馬和牦牛動物源性樣品，用組織破碎儀打碎，混勻，按照1.4.2的方法提取DNA，對混合樣品進(jìn)行多重實時熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增熒光曲線，檢測通用引物擴(kuò)增的特異性[9]。

將牛、羊、鴨、雞和豬的模板樣品的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，原始DNA濃度為100 ng/μL，稀釋后濃度分別為10.00 ng/μL、1.00 ng/μL、0.10 ng/μL和0.01 ng/μL。多重實時熒光PCR擴(kuò)增后，檢測牛、羊、鴨、雞和豬的模板樣品DNA的最低檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取質(zhì)量及純度檢測結(jié)果

按照1.4.2實驗方法提取樣品中DNA，用核酸蛋白分析儀測定核酸濃度。如表3所示，所有樣品DNA提取效果較好，DNA濃度在150～270 ng/μL，需要對DNA濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋，控制DNA濃度在70～120 ng/μL。

2.2 多重DNA條碼擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)通用引物和探針擴(kuò)增牛、羊、雞、鴨和豬樣品，通過優(yōu)化PCR條件，最終被檢測樣品均擴(kuò)增出明亮、無拖尾的特征性目的條帶，說明該方法可以同時檢測5種樣品，且無干擾條帶。擴(kuò)增出的片段，牛源性樣品為274 bp，羊源性樣品為331 bp，雞源性樣品為227 bp，鴨源性樣品為201 bp，豬源性樣品為398 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖1。

2.3 特異性和檢出限檢測結(jié)果

在已知樣品中混入馬、牦牛動物源性物質(zhì)，根據(jù)多重動物源性樣品多重實時熒光擴(kuò)增結(jié)果，馬動物源性食品應(yīng)用通用引物擴(kuò)增，擴(kuò)增不出熒光條帶，說明該方法研究的通用引物具有特異性。如圖2所示，1號為空白，2號為馬肉，顯示無擴(kuò)增產(chǎn)物。3號、4號分別為牛、牦牛，說明該引物對同源相似性大的動物源性食品均有擴(kuò)增效果。5～8號分別為羊、雞、鴨、豬源性食品，均有很好的熒光擴(kuò)增曲線。取牛、羊、雞、鴨和豬的模板樣品，混合打碎后提取純化DNA，經(jīng)梯度稀釋后，混合樣品DNA濃度依次為100.00 ng/μL、10.00 ng/μL、1.00 ng/μL、0.10 ng/μL和0.01 ng/μL。經(jīng)多重實時熒光PCR擴(kuò)增后，結(jié)果如圖3所示，1號為DNA濃度100.00 ng/μL，2號為DNA濃度10.00 ng/μL，3號為DNA濃度1.00 ng/μL，4號為DNA濃度0.10 ng/μL，5號為DNA濃度0.01 ng/μL，6號為空白。DNA濃度為0.01 ng/μL時，無擴(kuò)增熒光曲線，表明DNA濃度過低，不能有效擴(kuò)增。最低DNA濃度為0.10 ng/μL時有熒光擴(kuò)增曲線，表明該方法能檢測到的最低DNA濃度為0.10 ng/μL，該方法的檢出限為0.10 ng/μL。

3 結(jié)論

該方法研究應(yīng)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)，開發(fā)通用引物探針，快速檢測牛、羊、雞、鴨和豬5種混合樣品中每類樣品的含量，該檢驗方法能檢測DNA的最低濃度為0.10 ng/μL，方法檢出限為0.10 ng/μL，該靈敏度滿足國家標(biāo)準(zhǔn)檢測動物源性成分標(biāo)準(zhǔn)要求。

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