FTIR光譜結(jié)合曲線擬合研究萌發(fā)水稻種子

李姝潔，劉 杰，鄧子昂，歐全宏，時(shí)有明，劉 剛*

1.云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院，云南 昆明 650500 2.曲靖師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，云南 曲靖 655011

引 言

水稻是世界的三大糧食作物之一，超過(guò)一半的世界人口以大米為主食[1]。世界上有一百多個(gè)國(guó)家種植水稻，每年全世界種植的水稻超過(guò)7億噸，中國(guó)的水稻產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的四分之一以上[2]。水稻種子是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，其萌發(fā)特性可以直接影響到水稻的產(chǎn)量。萌發(fā)是水稻生產(chǎn)的第一步，良好的種子萌發(fā)是幼苗形態(tài)建成的關(guān)鍵基礎(chǔ)[3]。

種子萌發(fā)是指種子從生命活動(dòng)相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)化為生理代謝旺盛狀態(tài)發(fā)育成新個(gè)體的過(guò)程，在形態(tài)上表現(xiàn)為胚根、胚芽突破種皮并向外生長(zhǎng)[4]。種子萌發(fā)過(guò)程一般分為三個(gè)階段，第一階段開始吸水，水分代謝、呼吸代謝開始，酶的活化與合成；第二階段吸水滯緩，貯藏物質(zhì)動(dòng)員，胚細(xì)胞迅速生長(zhǎng)至一定階段，胚根突破種皮；第三階段重新開始大量吸水，胚細(xì)胞加速分裂和分化，胚根和胚芽伸出種皮發(fā)育到一定程度。在這個(gè)過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列生化變化，包括酶的活化與胚乳和種皮的破裂，細(xì)胞溶質(zhì)的滲漏，細(xì)胞器、膜和DNA的修復(fù)，以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成[5]。種子從發(fā)育的成熟階段便開始大量積累淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等貯藏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在種子萌發(fā)時(shí)，糊粉層受赤霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶，淀粉被水解酶分解為可溶性的葡萄糖和麥芽糖，降解后的淀粉被盾片吸收，然后合成蔗糖并運(yùn)送到胚胎或幼苗中進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育，在玉米種子萌發(fā)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)蔗糖明顯由盾片向胚軸輸出[6]；蛋白質(zhì)被蛋白酶水解為氨基酸，分解產(chǎn)生的氨基酸可用于合成新的蛋白質(zhì)，或脫氨后為呼吸氧化提供碳鏈[4]；脂肪先被脂肪酶水解為甘油和脂肪酸，隨后分別經(jīng)過(guò)氧化、三羧酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)和糖酵解最終被轉(zhuǎn)化為葡萄糖和蔗糖，輸送到生長(zhǎng)部位，為新器官和組織的合成提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量。Han等[7]采用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)小麥種子萌發(fā)過(guò)程中胚和胚乳進(jìn)行代謝組學(xué)比較分析，研究發(fā)現(xiàn)胚動(dòng)員主要蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝，而胚乳動(dòng)員貯藏淀粉和次要蛋白質(zhì)代謝。Zhou等[8]對(duì)苦蕎麥種子萌發(fā)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分的變化及其抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽種子中總蛋白和總糖含量的下降分別伴隨著氨基酸和還原糖含量的增加，維生素C和B1降低，維生素B2和B6含量變化不大，脂肪酸含量隨發(fā)芽時(shí)間的變化趨勢(shì)無(wú)規(guī)律性。用氣相色譜法、質(zhì)譜法、化學(xué)測(cè)定等方法研究種子萌發(fā)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)動(dòng)員，這些方法需要復(fù)雜的化學(xué)提取和分離過(guò)程，操作繁瑣，周期較長(zhǎng)。因此選擇一種可靠、簡(jiǎn)便、快速、無(wú)損的方法來(lái)研究貯藏物質(zhì)在種子萌發(fā)過(guò)程中的變化是一個(gè)迫切的需要。

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)是一種基于化合物中官能團(tuán)和極性鍵振動(dòng)的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，具有快速、低成本等特點(diǎn)，是獲取分子結(jié)構(gòu)信息的有力工具，已廣泛應(yīng)用于生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域。FTIR也應(yīng)用于種子研究，Gordon等[9]利用中紅外光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合的方法，鑒定了不同地區(qū)(如降雨量、溫度和陽(yáng)光的不同)大麥的光譜差異。Julián de la Rosa-Millána等[10]用傅里葉變換紅外光譜研究去皮、發(fā)芽和擠壓對(duì)黑豆理化特性、蛋白質(zhì)和淀粉消化特性影響。在此用傅里葉變換紅外光譜法結(jié)合曲線擬合研究萌發(fā)水稻種子，分析未處理、萌發(fā)2，4，6，8，10，12和14 d的水稻種子的原始、二階、二維紅外光譜，對(duì)多糖、蛋白質(zhì)和脂肪的特征帶進(jìn)行曲線擬合，通過(guò)特征帶的峰面積百分比分析貯藏物質(zhì)的動(dòng)用情況。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品制備

實(shí)驗(yàn)所用的水稻種子為楚粳29號(hào)，購(gòu)買于云南省陸良縣種子公司。選取大小均勻、顆粒飽滿的水稻種子，按一定間隔均勻放于鋪有兩層濕潤(rùn)發(fā)芽紙的發(fā)芽盒中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。每盒24粒，每個(gè)處理重復(fù)3次。然后將發(fā)芽盒移至25 ℃的智能恒溫光照培養(yǎng)箱中，保持水分充足，分別培養(yǎng)2，4，6，8，10，12和14 d，光照設(shè)置為12 h光照，12 h黑暗。每天查看發(fā)芽情況，每隔兩天取出一組，干燥待測(cè)。

1.2 FTIR光譜測(cè)量

將樣品放于瑪瑙研缽中研磨成細(xì)粉，與適量溴化鉀混合研磨后壓片，測(cè)試光譜。光譜儀為美國(guó)Perkin Elmer公司生產(chǎn)的Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀，配備DTGS探測(cè)器。分別對(duì)未處理、發(fā)芽2，4，6, 8, 10, 12和14 d的水稻種子各采集15個(gè)樣本光譜，所得光譜均為扣除溴化鉀背景的光譜。光譜范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)16次。用EUROTHERM公司生產(chǎn)的SYD-TC-01型的溫控儀進(jìn)行熱擾動(dòng)，以2 ℃·min-1的速度加熱，光譜采集溫度范圍為50～120 ℃，每隔10 ℃進(jìn)行一次采集。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用紅外分析軟件OMNIC8.2對(duì)光譜進(jìn)行基線校正、5點(diǎn)平滑、歸一化等預(yù)處理；用Savitsky-Golay方法對(duì)光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理；利用Origin9進(jìn)行光譜處理及曲線擬合，對(duì)紅外光譜的多糖、蛋白質(zhì)、脂肪的選定區(qū)域特定帶進(jìn)行擬合，計(jì)算子峰面積占比。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同萌發(fā)時(shí)間水稻種子的傅里葉變換紅外光譜分析

圖1 不同萌發(fā)天數(shù)水稻種子的傅里葉變換紅外光譜

圖2為不同萌發(fā)天數(shù)水稻種子原始紅外光譜的幾個(gè)特征峰吸收強(qiáng)度比，各峰強(qiáng)比均來(lái)自10個(gè)樣本光譜的平均譜圖。A1 659/A1 019比值隨萌發(fā)天數(shù)的增加而減小，表明蛋白質(zhì)與多糖的相對(duì)含量隨萌發(fā)時(shí)間的增加而發(fā)生變化；A1 740/A1 019比值隨萌發(fā)天數(shù)的增加而減小，表明脂肪與多糖的相對(duì)含量隨萌發(fā)時(shí)間的增加而發(fā)生變化；A1 157/A1 019和A1 157/A1 081的比值隨萌發(fā)天數(shù)的增加而減小，表明多糖的相對(duì)含量隨萌發(fā)時(shí)間的增加而發(fā)生變化。

圖2 不同萌發(fā)天數(shù)水稻種子紅外光譜的特征峰吸收強(qiáng)度比

2.2 萌發(fā)水稻種子的二維相關(guān)紅外光譜分析

圖3為不同萌發(fā)天數(shù)的水稻種子在814～1 000 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜，其自動(dòng)峰情況見表1。萌發(fā)0～8 d水稻種子二維相關(guān)紅外光譜[圖3(a—e)]的所有交叉峰均為正交叉峰；萌發(fā)10 d的水稻種子[圖3(f)]在(840, 908 cm-1)處的交叉峰為負(fù)，其余交叉峰為正；萌發(fā)12 d的水稻種子[圖3(g)]在(843, 908 cm-1)處的交叉峰為負(fù)，其余交叉峰為正；萌發(fā)14 d的水稻種子[圖3(h)]在(834, 884 cm-1)和(834, 908 cm-1)處的交叉峰為負(fù)，其余交叉峰為正。從圖3(a—h)還可看出，隨種子萌發(fā)時(shí)間的增加，883 cm-1自動(dòng)峰強(qiáng)度呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，834 cm-1自動(dòng)峰強(qiáng)度先增強(qiáng)后減弱，950 cm-1處自動(dòng)峰在萌發(fā)6 d后消失，同時(shí)出現(xiàn)了974 cm-1的自動(dòng)峰。結(jié)果顯示，在814～1 000 cm-1范圍內(nèi)不同萌發(fā)天數(shù)水稻種子的二維相關(guān)紅外光譜自動(dòng)峰個(gè)數(shù)有一定的變化，隨萌發(fā)時(shí)間的增加，最強(qiáng)自動(dòng)峰的位置從875 cm-1附近變?yōu)榱?74 cm-1附近，而在901，875和834 cm-1左右自動(dòng)峰強(qiáng)度和位置均發(fā)生明顯變化，這些變化可能與種子在萌發(fā)過(guò)程中糖類物質(zhì)的動(dòng)員有關(guān)。

表1 不同萌發(fā)時(shí)間水稻種子在814～1 000 cm-1范圍內(nèi)二維相關(guān)紅外光譜的自動(dòng)峰情況

圖3 不同萌發(fā)天數(shù)水稻種子在814～1000 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜

圖4為不同萌發(fā)天數(shù)的水稻種子在1 028～1 340 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜，其自動(dòng)峰情況見表2。從圖4可看出，所有自動(dòng)峰的交叉峰均為正交叉峰。在萌發(fā)6 d前，最強(qiáng)自動(dòng)峰的位置由1 229 cm-1逐漸變?yōu)? 067 cm-1，且強(qiáng)度發(fā)生變化；在種子萌發(fā)6～14 d中，最強(qiáng)自動(dòng)峰位置不變，但強(qiáng)度發(fā)生變化。隨萌發(fā)時(shí)間的增加，1 118 cm-1弱自動(dòng)峰強(qiáng)度先增強(qiáng)后減弱，最終消失。結(jié)果顯示，在1 028～1 340 cm-1范圍內(nèi)不同萌發(fā)天數(shù)水稻種子的二維相關(guān)紅外光譜自動(dòng)峰個(gè)數(shù)有一定的變化，1 067，1 138和1 198 cm-1處自動(dòng)峰位置不變但強(qiáng)度有所變化，而在1 038，1 098，1 229和1 259 cm-1左右自動(dòng)峰強(qiáng)度和位置均發(fā)生明顯變化，這些變化可能與種子在萌發(fā)過(guò)程中糖類、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的動(dòng)員有關(guān)。

表2 不同萌發(fā)時(shí)間水稻種子在1 028～1 340 cm-1范圍內(nèi)二維相關(guān)紅外光譜的自動(dòng)峰情況

圖4 不同萌發(fā)天數(shù)水稻種子在1 028～1 340 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜

2.3 曲線擬合分析

紅外光譜的定量分析方法一般分為兩種：一種是測(cè)定特征峰的吸收強(qiáng)度，另一種是測(cè)量特征吸收峰的峰面積。由于峰面積受樣品因素和儀器因素的影響比峰強(qiáng)度小，因此采用峰面積進(jìn)行定量分析的較多。二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜和曲線擬合相結(jié)合是進(jìn)行分峰擬合的有效手段，由二階導(dǎo)數(shù)光譜確定所取范圍內(nèi)重疊峰的位置和個(gè)數(shù)，在此基礎(chǔ)上對(duì)所選范圍的原始紅外光譜進(jìn)行曲線擬合則可將重疊峰一一分開。水稻種子的光譜在1 200～950和1 800～1 600 cm-1的擬合結(jié)果如圖5、圖6所示。

圖5 水稻種子1 200～950 cm-1范圍的二階導(dǎo)數(shù)光譜(a)和曲線擬合圖(b)

圖6 水稻種子的紅外光譜在1 800～1 600 cm-1范圍的二階導(dǎo)數(shù)光譜(a)和曲線擬合圖(b)

種子的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在萌發(fā)過(guò)程中有明顯變化，采用峰面積百分比來(lái)分析它們的含量變化。分別對(duì)每個(gè)萌發(fā)時(shí)間下的8個(gè)樣本光譜進(jìn)行曲線擬合，選取多糖特征峰(1 020，1 053 cm-1)、蛋白質(zhì)特征峰(1 641，1 692 cm-1)和脂肪特征峰(1 744 cm-1)，計(jì)算它們的峰面積百分比，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。

表3 水稻種子在不同萌發(fā)程度下的特征峰峰面積百分比

未萌發(fā)的水稻種子1 020 cm-1特征帶的面積百分比為30.46%，萌發(fā)14天后減小到12.10%。結(jié)果表明，多糖的相對(duì)含量在萌發(fā)過(guò)程中總體上呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)減小的趨勢(shì)，這與黃國(guó)平[14]研究小米的總糖變化趨勢(shì)一致。1 053 cm-1峰面積百分比在未萌發(fā)水稻種子中為8.89%，隨萌發(fā)時(shí)間的增加，該百分比呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，最終在萌發(fā)14天時(shí)達(dá)到30.88%。結(jié)果表明，該特征帶可能表示可溶性糖的相對(duì)含量變化情況，可溶性糖的相對(duì)含量隨萌發(fā)時(shí)間的增加而上升。在萌發(fā)前期淀粉被活化的淀粉酶水解導(dǎo)致淀粉含量減少，水解產(chǎn)生可溶性糖(如葡萄糖、麥芽糖)導(dǎo)致可溶性糖含量增多，之后水解產(chǎn)物被運(yùn)輸?shù)脚撸峁┙o新器官生長(zhǎng)所需的物質(zhì)與能量。

未萌發(fā)水稻種子的脂肪特征帶1 744 cm-1峰面積百分比為16.86%，萌發(fā)后0～8 d逐漸下降為9.05%，隨后10～14 d有所增加。結(jié)果表明，隨萌發(fā)時(shí)間的增加，水稻種子脂肪的相對(duì)含量呈現(xiàn)先減少后增大的趨勢(shì)。萌發(fā)初期脂肪含量會(huì)降低可能是由于萌發(fā)初期胚乳代謝尚未開啟，細(xì)胞修復(fù)不完全，脂肪外滲所導(dǎo)致的含量下降，還可能是脂肪被活化的水解酶水解為甘油和脂肪酸，又經(jīng)過(guò)糖酵解最終轉(zhuǎn)化為葡萄糖和蔗糖而導(dǎo)致的。而隨后脂肪含量的略微增加可能是萌發(fā)過(guò)程中其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)用于合成膜脂，此時(shí)主要消耗的能量物質(zhì)并非脂肪，因此其含量會(huì)有所增加[17]。

綜上，在水稻種子的萌發(fā)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量和結(jié)構(gòu)發(fā)生著顯著的變化，隨萌發(fā)時(shí)間的增加，多糖和蛋白質(zhì)的相對(duì)含量逐漸減少，可溶性糖的相對(duì)含量逐漸增加，氨基酸的相對(duì)含量先增加后減少，脂肪的相對(duì)含量在0～8 d內(nèi)逐漸降低，隨后8～14 d內(nèi)有所增加。

3 結(jié) 論

利用傅里葉變換紅外光譜結(jié)合曲線擬合對(duì)萌發(fā)水稻種子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，分別測(cè)量了不同萌發(fā)時(shí)間水稻種子的傅里葉變換紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜和二維相關(guān)紅外光譜。原始光譜顯示，水稻種子的主要成分為淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪，A1 659/A1 019，A1 740/A1 019，A1 157/A1 019和A1 157/A1 081的吸收峰強(qiáng)度比隨萌發(fā)時(shí)間的增加而減小。不同萌發(fā)程度水稻種子在814～1 000和1 028～1 340 cm-1的二維相關(guān)紅外光譜自動(dòng)峰個(gè)數(shù)有一定差異，最強(qiáng)自動(dòng)峰的位置和強(qiáng)度發(fā)生了明顯變化?；诙A導(dǎo)數(shù)紅外光譜對(duì)1 200～950和1 800～1 600 cm-1區(qū)域進(jìn)行曲線擬合分析并計(jì)算相應(yīng)的特征峰峰面積百分比，多糖、蛋白質(zhì)和脂肪特征峰面積百分比均隨萌發(fā)時(shí)間的增加有顯著變化。以上結(jié)果表明，種子萌發(fā)伴隨著一系列的水分代謝、呼吸代謝和貯藏物質(zhì)代謝，萌發(fā)的水稻種子生理生化特性發(fā)生了顯著變化。貯藏物質(zhì)動(dòng)用明顯，淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪在萌發(fā)過(guò)程中被分解，淀粉和蛋白質(zhì)相對(duì)含量隨萌發(fā)時(shí)間的增加逐漸下降，脂肪的相對(duì)含量隨萌發(fā)時(shí)間的增加先降低后上升，表明傅里葉變換紅外光譜法是種子萌發(fā)的一種可靠、快速、簡(jiǎn)便、有效的研究手段。

附 錄

圖S1 不同萌發(fā)天數(shù)水稻種子的紅外光譜在1 200～950 cm-1范圍的曲線擬合圖譜

圖S2 不同萌發(fā)天數(shù)水稻種子的紅外光譜在1 800～1 600 cm-1范圍的曲線擬合圖譜