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    基于有害結(jié)局路徑的化學(xué)物質(zhì)計算毒理學(xué)研究

    2022-06-06 08:08:40茍瀟于洋林軍閆路彭穎張效偉
    生態(tài)毒理學(xué)報 2022年1期
    關(guān)鍵詞:生物

    茍瀟,于洋,林軍,閆路,彭穎,3,張效偉,*

    1. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室,南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,南京 210023 2. 生態(tài)環(huán)境部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心,北京 100029 3. 流域環(huán)境生態(tài)工程研發(fā)中心,北京師范大學(xué)自然科學(xué)高等研究院,珠海 519087

    毒性數(shù)據(jù)缺乏是化學(xué)物質(zhì)風(fēng)險管理面臨的一大挑戰(zhàn)[1]?;瘜W(xué)物質(zhì)的毒性測試方法正逐步由傳統(tǒng)的資源(時間、金錢、動物)消耗型的體內(nèi)試驗(invivo)[2-3],發(fā)展為資源低消耗的體外試驗(invitro)[4]。高通量篩選技術(shù)(high-throughput screening, HTS)以invitro為基礎(chǔ),聯(lián)合計算機分析技術(shù),可高效地一次性提供多個生物水平的機制數(shù)據(jù)[5-6],為化學(xué)物質(zhì)的毒性測試提供了一種新策略,也促進了預(yù)測毒理學(xué)發(fā)展。比如,由美國環(huán)境保護局(United States Environmental Protection Agency, US EPA)組織的ToxCast項目已使用約1 000種體外生物測試方法對10 000余種化學(xué)物質(zhì)的超過700種生物終點進行了測試[7-10],這些數(shù)據(jù)量龐大的分子機制數(shù)據(jù)為高通量化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測提供了可能。

    目前,數(shù)據(jù)驅(qū)動(data-driven)與機制驅(qū)動(mechanism-driven)是實現(xiàn)體外生物測試數(shù)據(jù)高通量毒性預(yù)測的主要策略[11]。數(shù)據(jù)驅(qū)動方法以定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure-activity relationship, QSAR)和交叉參照(read-across)等為代表。傳統(tǒng)的QSAR與交叉參照都認為結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)物質(zhì)具有相似的生物效應(yīng)[12],因此可基于已有的化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)-效應(yīng)關(guān)系預(yù)測結(jié)構(gòu)明確但未經(jīng)生物測試化學(xué)物質(zhì)的生物活性[13-14]。Braga等[15]基于600余種化學(xué)物質(zhì)已有的結(jié)構(gòu)及皮膚致敏數(shù)據(jù),開發(fā)通過QSAR的方法,預(yù)測化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)皮膚致敏的情況。Russo等[16]基于PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)內(nèi)7 385個化學(xué)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、體外生物測試信息及大鼠經(jīng)口急性毒性數(shù)據(jù),采用交叉參照的方法建立了化學(xué)物質(zhì)的大鼠經(jīng)口急性毒性的預(yù)測方法。數(shù)據(jù)驅(qū)動為未經(jīng)測試的化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測提供了解決方案,但主要局限于機制相對簡單的急性毒性終點,然而目前環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的致毒模式多為在低濃度下、通過多機制引發(fā)多類型的慢性毒性。

    機制驅(qū)動的有害結(jié)局路徑(adverse outcome pathway, AOP)可為化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測提供生物學(xué)通路機制證據(jù)[17-19]。AOP通過關(guān)鍵事件(key event, KE)將分子啟動事件(molecular initiating event, MIE)與個體水平的有害結(jié)局(adverse outcome, AO)聯(lián)系起來[20-21]。目前AOP知識庫(AOP knowledge base, AOP-KB; https://aopkb.oecd.org/index.html)已經(jīng)整合了251條AOPs,包括185個MIEs,745個KEs,147個AOs(截至2019年8月2日)?!度蚧瘜W(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度》(Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals, GHS; https://www.ghs.org)歸納了國際管理要求的10類化學(xué)物質(zhì)健康危害。根據(jù)AO毒性終點及作用的靶器官,按照“系統(tǒng)器官分類”(system organ class, SOC)標(biāo)準(zhǔn)[22],可將147個AOs分為11種毒性類型,分別是致癌/遺傳毒性、生殖毒性、消化系統(tǒng)毒性、內(nèi)分泌干擾、神經(jīng)毒性、呼吸毒性、血液循環(huán)系統(tǒng)毒性、泌尿毒性、免疫毒性、急性致死及發(fā)育毒性,共覆蓋GHS的9類健康危害類型(90%,除“嚴(yán)重眼損傷/刺激”)。AOP知識庫不斷豐富和完善,為滿足環(huán)境管理需求的化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測提供了基礎(chǔ)和機遇。

    AOP的發(fā)展主要是以定性AOP(qualitative AOP)及定量AOP(quantitative AOP, qAOP)2種形式進行。qAOP是基于已有的生物學(xué)知識,借助計算機模型,描述化學(xué)物質(zhì)脅迫下可能發(fā)生的MIE、KE及AO之間的時間/劑量-效應(yīng)關(guān)系[23]。相較于定性AOP,qAOP的發(fā)展目標(biāo)是滿足真實暴露場景下化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測的需求[24]。其概念從提出至今已被廣泛應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)的風(fēng)險管控中。Jaworska等[25]聯(lián)合ToxCast體外測試數(shù)據(jù),預(yù)測124個化學(xué)物質(zhì)與皮膚致敏生物事件(KE ID:824)的劑量-效應(yīng)關(guān)系,并將這些化學(xué)物質(zhì)的皮膚致敏危害度進行排序。Mellor等[26]聯(lián)合ChEMBL(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)數(shù)據(jù)庫,計算出以有潛力激活/抑制芳香烴受體(aryl-hydrocarbon receptor, AhR)等核受體為MIEs,最終誘導(dǎo)肝臟脂肪變性(KE ID:459)的化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)警示子。Phillips等[27]以ToxCast中具有抑制乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)(KE ID:12)體外生物測試活性的32個化學(xué)物質(zhì)劑量-效應(yīng)關(guān)系為基礎(chǔ),結(jié)合QSAR,預(yù)測了1 029個化學(xué)物質(zhì)通過抑制AChE(KE ID:12)誘導(dǎo)相關(guān)AOs的風(fēng)險。由于qAOP的建立需要建立復(fù)雜的時間/劑量-效應(yīng)模型,目前涵蓋的AOP及化學(xué)物質(zhì)數(shù)量少。但是隨著高通量組學(xué)測試、器官芯片和人工智能等新技術(shù)的發(fā)展,未來qAOP有潛力應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)的高通量毒性預(yù)測。

    基于定性AOP的化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測更為簡潔高效。定性AOP構(gòu)建了化學(xué)物質(zhì)脅迫下的關(guān)鍵事件級聯(lián)知識,描述了從MIE到AO的過程,可用于化學(xué)物質(zhì)的危害識別[23]。如果化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)了一條AOP的MIE或KE,則相應(yīng)AO有被引發(fā)的可能。定性AOP盡管未能考慮真實暴露場景下的時間及劑量因素,但目前已覆蓋了多種生物水平,為預(yù)測化學(xué)物質(zhì)潛在的多種毒性終點提供了條件。Aguayo-Orozco等[28]結(jié)合ToxCast化學(xué)物質(zhì)體外生物測試與AOP-KB,使用“細胞毒性爆發(fā)”(cytotoxicity burst, CTB)方法對4 960種化學(xué)物質(zhì)的207條AOPs誘導(dǎo)情況進行了預(yù)測,并建立了首個化學(xué)物質(zhì)的AOP誘導(dǎo)預(yù)測網(wǎng)站(http://saop.cpr.ku.dk/)。但是由于ToxCast體外生物測試數(shù)據(jù)生成背景及質(zhì)量存在差異[29],AOP-KB內(nèi)AOP的發(fā)展成熟度不同(分為“正在發(fā)展中”和“列入經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)計劃中”兩階段),有必要對其毒性預(yù)測準(zhǔn)確性進行進一步評價。

    本研究基于AOP,聯(lián)合ToxCast體外生物測試數(shù)據(jù)建立對化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測的方法,首先評估了具有體外生物測試數(shù)據(jù)的MIE/AOP情況,其次,選取101種典型環(huán)境化學(xué)物質(zhì),分析了其體外生物測試結(jié)果,最后進行毒性預(yù)測,并通過與PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)已報道的化學(xué)物質(zhì)毒性比較,評價此次毒性預(yù)測的結(jié)果。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 “化學(xué)物質(zhì)-體外生物測試-MIE-AO”關(guān)聯(lián)建立

    可通過檢測MIE來識別化學(xué)物質(zhì)的AOP誘導(dǎo)情況[30]。首先,將AOP-KB內(nèi)185個MIEs與ToxCast內(nèi)10 000余種體外生物測試的生物效應(yīng)進行比對,建立“MIE-體外生物測試”表。比對方法為根據(jù)ToxCast內(nèi)對所有體外生物測試與AOP-KB內(nèi)對MIE的生物靶點及效應(yīng)的描述,當(dāng)體外生物測試與MIE的生物靶點與效應(yīng)均一致時,則認為二者比對成功?!癕IE-體外生物測試”表中有48個MIEs能成功比對到共112種體外生物測試方法,這48個MIEs共可對應(yīng)58種AOs,共覆蓋11種毒性類型。

    將“MIE-體外生物測試”與ToxCast內(nèi)化學(xué)物質(zhì)體外生物測試比對,若化學(xué)物質(zhì)與MIE的同一體外生物測試結(jié)果均為陽性,則認為該化學(xué)物質(zhì)可引發(fā)該MIE,并誘導(dǎo)相關(guān)AO。若化學(xué)物質(zhì)與MIE的同一體外生物測試結(jié)果都為陰性,則認為該化學(xué)物質(zhì)不可引發(fā)該MIE,且無法誘導(dǎo)相應(yīng)AO。

    以全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)(CAS RN:1763-23-1)為例,PFOS具有“ATG_PPARα_TRANS_up”、ATG_PPARg_TRANS_up”和“ATG_ERα_TRANS_up”等179個體外生物測試陽性結(jié)果,其中有22個體外生物測試能比對到共37個MIEs,表明PFOS可潛在引發(fā)以激活過氧化物酶體增殖物激活受體α/g(peroxisome proliferators-activated receptorsα/g, PPARα/g)及雌激素受體(estrogen receptorα, ERα)等為生物效應(yīng)的MIEs及其相應(yīng)的AOs(圖1),包括“肝細胞癌變作用增強”(KE ID:1171)、“血管肉瘤增多”(KE ID:1037)、“肥胖”(KE ID:1447)和“乳腺癌”(KE ID:1193)等40個AOs。

    1.2 典型環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的選取

    選取《中國現(xiàn)有化學(xué)物質(zhì)名錄》[31]與AOP-KB(484個化學(xué)物質(zhì),截至2019年8月2日)均有收錄,且在“MIE-體外生物測試”表中具有陽性體外生物測試結(jié)果的化學(xué)物質(zhì),用于后續(xù)基于AOP的毒性預(yù)測。共選取了101個化學(xué)物質(zhì),其中包括32種工業(yè)用品,40種農(nóng)藥,29種藥品及個人護理品(pharmaceutical and personal care products, PPCPs)。

    圖1 建立“化學(xué)物質(zhì)-體外生物測試-MIE-AO”關(guān)聯(lián):以全氟辛烷磺酸(PFOS)為例注:AOP表示有害結(jié)局路徑;MIE表示分子啟動事件;KE表示關(guān)鍵事件;AO表示有害結(jié)局;AC50表示50%最大生物活性濃度。Fig. 1 Establish connection of “chemical-in vitro bioassay-MIE-AO”: Taking perfluorooctane sulfonate (PFOS) as an exampleNote: AOP stands for adverse outcome pathway; MIE stands for molecular initiating event; KE stands for key event; AO stands for adverse outcome; AC50 stands for concentration at 50% of the maximum activity.

    1.3 化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測結(jié)果的評價方法

    將PubChem內(nèi)已報道的毒性作為化學(xué)物質(zhì)真實可引發(fā)的毒性(毒性PubChem),將基于AOP預(yù)測的化學(xué)物質(zhì)毒性作為“毒性AOP”?!岸拘訮ubChem”與“毒性AOP”的內(nèi)涵均是不同的毒性類型(包含在11種毒性類型中)。通過“化學(xué)物質(zhì)-體外生物測試-MIE-AO”預(yù)測化學(xué)物質(zhì)潛在毒性,可能出現(xiàn)真陽性(毒性PubChem與毒性AOP均為“真”)、真陰性(毒性PubChem與毒性AOP均為“否”)、假陽性(毒性PubChem為“否”,毒性AOP為“真”)、假陰性(毒性PubChem為“真”,毒性AOP為“否”),共4種情況(表1)。

    本研究采用2種方式評價此次毒性預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。(1)基于Jaccard相似系數(shù)原理(Jaccard similarity, Js),通過計算“毒性PubChem”與“毒性AOP”二者相似度(公式1),綜合“真陽性”與“真陰性”結(jié)果評價整體毒性預(yù)測率。Js數(shù)值在0%~100%,數(shù)值越高,此次基于AOP的化學(xué)物質(zhì)整體毒性預(yù)測結(jié)果越準(zhǔn)確。(2)但是,由于部分化學(xué)物質(zhì)現(xiàn)有的毒性及體外生物測試數(shù)據(jù)不全以及AOP-KB中部分AOPs發(fā)展不完善,會造成毒性預(yù)測的“真陰性”結(jié)果。為更準(zhǔn)確評價AOP對化學(xué)物質(zhì)真實可引發(fā)的毒性的預(yù)測效果,有必要對“真陽性”結(jié)果進行單獨分析。本研究用“真陽性率”(true positive rate, TPR)(公式2)評價AOP對化學(xué)物質(zhì)真實毒性的預(yù)測效果,TPR數(shù)值范圍為0%~100%,數(shù)值越高表明AOP對化學(xué)物質(zhì)已明確的可真實引發(fā)的毒性預(yù)測越準(zhǔn)確。

    表1 毒性預(yù)測的4種結(jié)果Table 1 Four results of predication toxicity

    (1)

    (2)

    式中:毒性PubChem表示PubChem數(shù)據(jù)庫內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的毒性結(jié)果,毒性AOP表示基于有害結(jié)局路徑AOP預(yù)測的化學(xué)物質(zhì)毒性結(jié)果,陽性毒性AOP表示基于AOP預(yù)測結(jié)果為陽性的毒性類型,陽性毒性PubChem表示在PubChem數(shù)據(jù)庫內(nèi)報道的化學(xué)物質(zhì)毒性為陽性的毒性類型,Js表示Jaccard相似系數(shù),TPR表示真陽性預(yù)測率。

    3)現(xiàn)代職業(yè)教育制度的擴大實驗。2010年,江蘇省印發(fā)《職業(yè)教育創(chuàng)新發(fā)展實驗區(qū)建設(shè)方案》,提出“推動建立現(xiàn)代職業(yè)教育制度,增強職業(yè)教育吸引力和發(fā)展能力?!?012年,貴州省出臺九大舉措,大力發(fā)展職業(yè)教育,其中一項是“探索建立完善現(xiàn)代職業(yè)教育制度”,在體系建設(shè)上,要求從學(xué)歷層次上完善職業(yè)教育體系建設(shè),職業(yè)教育不再局限在中高職層次,而要打通從中等職業(yè)教育、高等職業(yè)教育、本科職業(yè)教育的立交橋政策;同時深化考試和招生改革,在專業(yè)、學(xué)校、層次等幾個方面擴大對口升學(xué)、對口招生的規(guī)模,從而從根本上增強職業(yè)教育的吸引力。

    以PFOS為例,PubChem的數(shù)據(jù)表明PFOS可誘導(dǎo)多種毒性[32-38]?;贏OP框架預(yù)測PFOS可潛在引發(fā)包括“肝細胞癌變”(KE ID:1171)等40個AOs(圖2),共包含11種毒性類型。因此,基于AOP方法預(yù)測了PFOS可潛在引發(fā)11種毒性類型,共覆蓋了90%的GHS健康危害(除“嚴(yán)重眼損傷/刺激”),Js值及TPR值均為100%。

    2 結(jié)果(Results)

    聯(lián)合體外生物測試,建立基于AOP的高通量化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測方法,并對預(yù)測結(jié)果進行評價。我們將該部分研究成果呈現(xiàn)在“應(yīng)用AOP”(application AOP, aAOP)網(wǎng)站(http://112.124.17.107:8000/#/)。

    圖2 基于AOP框架的毒性預(yù)測結(jié)果評價:以PFOS為例注:STOT為特異性靶器官毒性,包括一次接觸/重復(fù)接觸。Fig. 2 Assessment of toxicity prediction based on AOP framework: Taking PFOS as an exampleNote: STOT is specific target organ toxicity, including single exposure and repeated exposure.

    2.1 具有體外生物測試數(shù)據(jù)的MIE/AOP的分析

    AOP-KB內(nèi)有48個MIEs具有體外生物測試數(shù)據(jù)(共112種),共對應(yīng)66條AOPs及58個AOs,覆蓋了11種毒性類型(圖3(a))及90%的GHS健康危害(圖3(b))。其中屬于致癌/遺傳毒性、生殖毒性、消化系統(tǒng)毒性及內(nèi)分泌干擾的AOPs、MIEs及體外生物測試數(shù)據(jù)數(shù)量最多。其相關(guān)AOPs數(shù)量分別為25、16、16和10,MIEs數(shù)量分別為23、14、15和8,體外生物測試數(shù)據(jù)數(shù)量分別為68、72、33和37。而屬于免疫毒性及血液循環(huán)系統(tǒng)毒性的AOPs、MIEs及體外生物測試數(shù)據(jù)數(shù)量最少,其數(shù)量均未超過4。58個AOs覆蓋的9種GHS健康危害中,特異性靶器官毒性、致癌、生殖毒性的AOPs、MIEs及體外生物測試數(shù)據(jù)數(shù)量最多,其相關(guān)AOPs數(shù)量分別為49、25和16,相關(guān)MIEs數(shù)量分別為58、63和14,相關(guān)體外生物測試數(shù)據(jù)數(shù)量分別為97、68和72。而與皮膚腐蝕/刺激、呼吸/皮膚過敏的健康危害相關(guān)的AOPs、MIEs及體外生物測試數(shù)據(jù)數(shù)量最少,其相關(guān)數(shù)量均未超過3。

    AOP-KB所包含的毒性種類豐富(11種毒性類型)、GHS健康危害覆蓋度高(90%),不同的毒性類型相關(guān)的AOP、MIE及體外生物測試數(shù)據(jù)的數(shù)量不同,后期基于AOP-KB的化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測結(jié)果可能產(chǎn)生毒性類型分布不均衡。

    圖3 具有體外生物測試數(shù)據(jù)的MIEs/AOPs的毒性分析注:(a)毒性類型,(b) GHS健康危害;特異性靶器官毒性包括“一次接觸”與“重復(fù)接觸”。Fig. 3 Toxicity analysis of MIEs/AOPs with in vitro bioassays dataNote: (a) Type of toxicity, (b) Health hazard of GHS; specific target organ toxicity includes “single exposure” and “repeated exposure”.

    2.2 化學(xué)物質(zhì)體外生物測試結(jié)果分析

    101個化學(xué)物質(zhì)共有1 092種體外生物測試結(jié)果(圖4(a)),超過80%的測試結(jié)果為陰性,僅有不到20%的測試結(jié)果為陽性?;瘜W(xué)物質(zhì)的1 092種體外生物測試共包含25種生物靶點類型(圖4(b)),覆蓋了多個生物過程。其中生物靶點為核受體、與DNA結(jié)合、激酶、細胞因子的體外生物測試方法總數(shù)量及有活性的數(shù)量最多,平均每個化學(xué)物質(zhì)有146個關(guān)于核受體的體外生物測試,其中有14個陽性測試結(jié)果。生物靶點為裂合酶、雜蛋白類、酯酶及水解酶的陽性測試結(jié)果不足30個,而甲基轉(zhuǎn)移酶的體外生物測試結(jié)果均為陰性,表明化學(xué)物質(zhì)通過甲基轉(zhuǎn)移酶、裂合酶、雜蛋白類、酯酶及水解酶誘導(dǎo)有害結(jié)局的可能性較小。這25個生物靶點類型覆蓋了從細胞水平的生長、分化到生物個體的生長發(fā)育和性別分化等多個生物過程,為基于AOP對這101個化學(xué)物質(zhì)進行毒性預(yù)測提供了豐富的體外生物靶點測試數(shù)據(jù)。

    2.3 化學(xué)物質(zhì)的毒性分析

    圖4 101個化學(xué)物質(zhì)生物測試結(jié)果注:(a) 101個化學(xué)物質(zhì)體外生物測試活性陽性結(jié)果與陰性結(jié)果;(b) 101個化學(xué)物質(zhì)體外生物測試的靶點信息。Fig. 4 Results of in vitro bioassays of 101 chemicalsNote: (a) Positive and negative in vitro bioassays of 101 chemicals; (b) Biotargets of in vitro bioassays for 101 chemicals.

    化學(xué)物質(zhì)的11種毒性類型預(yù)測結(jié)果中,共有374個“真陽性”結(jié)果,291個“真陰性”結(jié)果,312個“假陽性”結(jié)果,134個“假陰性”結(jié)果。整體毒性預(yù)測率(Js值)與真陽性毒性預(yù)測率(TPR值)分別達到59.9%與73.6%。在11種毒性類型中,生殖毒性與發(fā)育毒性的Js值最高,均超過了70%(圖5(b)),而急性毒性的Js值最低,為35.6%(圖5(b))。致癌/遺傳毒性、生殖毒性及消化系統(tǒng)毒性的TPR值最高,均超過了70%(圖5(b)),神經(jīng)毒性的TPR值最低,僅為1%(圖5(b))。134個“假陰性”結(jié)果與312個“假陽性”結(jié)果均覆蓋了11種毒性類型,內(nèi)分泌干擾(23個)與泌尿毒性(22個)的“假陰性”結(jié)果最多,急性毒性(63個)與神經(jīng)毒性(46個)的“假陽性”結(jié)果最多。

    基于AOP,可對101種化學(xué)物質(zhì)的11種毒性類型進行預(yù)測,不同的化學(xué)物質(zhì)及毒性類型的整體毒性預(yù)測率(Js值)與真陽性預(yù)測率(TPR值)不同。造成這一差異的主要原因是:(1)化學(xué)物質(zhì)之間的體外生物測試(陽性)數(shù)據(jù)數(shù)量存在差異;Js值與化學(xué)物質(zhì)生物測試(陽性)數(shù)據(jù)數(shù)量呈正相關(guān)但不顯著(P>0.30,r=0.100,圖5(c)),TPR值與化學(xué)物質(zhì)生物測試(陽性)數(shù)據(jù)數(shù)量呈顯著正相關(guān)(P<0.01,r=0.293,圖5(c));(2)AOP-KB內(nèi)描述不同毒性類型的AOPs、MIEs及相應(yīng)體外生物測試數(shù)據(jù)數(shù)量不同;不同毒性類型的Js值與該類型毒性的AOPs數(shù)量(P>0.10,r=0.432,圖5(d))、MIEs數(shù)量(P>0.10,r=0.481,圖5(d))、體外生物測試數(shù)據(jù)數(shù)量(P>0.10,r=0.436,圖5(d))成正相關(guān)但不顯著;不同毒性類型的TPR值與該類型毒性的AOPs數(shù)量(P<0.02,r=0.685,圖5(d))、MIEs數(shù)量(P<0.01,r=0.734,圖5(d))、體外生物測試數(shù)據(jù)數(shù)量(P<0.01,r=0.752,圖5(d))呈顯著正相關(guān)。

    圖5 101個化學(xué)物質(zhì)的毒性預(yù)測結(jié)果與分析注:(a) 101種化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測結(jié)果;(b) 11種毒性類型的Js值及TPR值;(c) 化學(xué)物質(zhì)的Js值、TPR值與其體外生物測試結(jié)果(陽性)相關(guān)性;(d) 11毒性類型的Js值、TPR值與其在AOP-KB中相關(guān)的MIEs、AOPs及體外生物測試結(jié)果(陽性)數(shù)量的相關(guān)性;A,急性毒性;B,生殖毒性;C,發(fā)育毒性;D,致癌/遺傳毒性;E,消化系統(tǒng)毒性;F,內(nèi)分泌干擾;G,泌尿毒性;H,血液循環(huán)毒性;I,呼吸毒性;J,免疫毒性;K,神經(jīng)毒性;Js是Jaccard相似系數(shù),TPR是真陽性預(yù)測率。Fig. 5 Results and analysis of prediction of toxicity for 101 chemicalsNote: (a) Toxicity prediction results of 101 chemicals; (b) Js and TPR value of 11 toxicity types; (c) The correlation between Js/TPR value and counts of in vitro bioassays (positive) of 101 chemicals; (d) The correlation between Js/TPR and counts of MIEs, AOPs and in vitro bioassays (positive) in AOP knowledge base; A, Acute toxicity; B, Reproductive toxicity; C, Developmental toxicity; D, Carcinogenic/genotoxicity; E, Digestive system toxicity; F, Endocrine disruption; G, Urinary toxicity; H, Blood circulation toxicity; I, Respiratory toxicity; J, Immunotoxicity; K, Neurotoxicity; Js is Jaccard similarity, and TPR is true positive rate.

    3 討論(Discussion)

    本研究建立了基于AOP、聯(lián)合ToxCast體外生物測試數(shù)據(jù)的化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測方法,并對預(yù)測結(jié)果進行了評價。我們發(fā)現(xiàn)101個化學(xué)物質(zhì)可潛在引發(fā)58種AOs,包含11種毒性類型,共覆蓋90%的GHS健康危害,此次整體毒性預(yù)測率(Js值)和真陽性毒性預(yù)測率(TPR值)分別達到59.9%和73.6%。

    定性AOP實現(xiàn)了對所選化學(xué)物質(zhì)的多種毒性終點的預(yù)測,而傳統(tǒng)數(shù)據(jù)驅(qū)動(如QSAR、交叉參照等)的方法往往局限于少數(shù)特定的毒性終點。本研究基于AOP的毒性預(yù)測方法的Js值最高可達84.2%,發(fā)育毒性、生殖毒性及消化系統(tǒng)毒性的Js值均超過70%。而此次預(yù)測結(jié)果的致癌/遺傳毒性的TPR值最高,為84.4%,生殖毒性及消化系統(tǒng)毒性的TPR值也超過了70%(圖5(b))?,F(xiàn)有的基于數(shù)據(jù)驅(qū)動的對化學(xué)物質(zhì)的毒性預(yù)測應(yīng)用中,雖然實現(xiàn)了高通量預(yù)測,但單組模型往往只能針對特定毒性或毒作用模式進行預(yù)測。Mansouri等[39]使用QSAR的方法,建立化學(xué)物質(zhì)的雄激素受體結(jié)合模型,預(yù)測化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)分泌干擾效應(yīng),其預(yù)測準(zhǔn)確率超過80%。Russo等[40]通過交叉參照,對600余種化學(xué)物質(zhì)的大鼠經(jīng)口急性毒性進行預(yù)測,真陽性預(yù)測率為76%。本研究結(jié)果表明相較于慢性毒性,急性毒性的TPR值較低,僅為30%。這是由于急性毒性可能是多個毒性效應(yīng)累加共同作用的結(jié)果,而一般的慢性毒性都有可檢測的KEs。如Angrish等[41-43]通過多年研究發(fā)現(xiàn)β腎上腺素受體、PPARα/g等受體激活是引發(fā)非酒精性脂肪肝炎的KEs。這表明相較于短期高劑量暴露下引發(fā)的急性致死,機制驅(qū)動的AOP可更好地反映長期低劑量暴露引發(fā)的慢性毒性的致毒機制。針對不同的毒性類型,AOP預(yù)測的TPR值與化學(xué)物質(zhì)的體外生物測試數(shù)據(jù)數(shù)量、AOP-KB內(nèi)不同毒性類型的體外生物測試/MIE/AOP數(shù)量均呈顯著正相關(guān)(P<0.02,r>0.290)(圖5(d))。這是因為TPR反映的是AOP對化學(xué)物質(zhì)真實可引發(fā)毒性的預(yù)測準(zhǔn)確性,針對AOP-KB內(nèi)體外生物測試/MIE/AOP越多的化合物毒性,預(yù)測結(jié)果越準(zhǔn)確。這一結(jié)果也表明在AOP的化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測應(yīng)用中,可通過豐富化學(xué)物質(zhì)的體外生物測試靶點,增加化學(xué)物質(zhì)體外生物測試數(shù)據(jù)數(shù)量,開發(fā)不同毒性類型的AOP及不同生物靶點的MIE來提高毒性預(yù)測的真陽性率。如,PubChem顯示101種化學(xué)物質(zhì)中共有47種化學(xué)物質(zhì)具有神經(jīng)毒性,但AOP僅對其中的2種進行了識別(圖5(a))。在比較毒理基因組數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database, CTD; https://ctdbase.org/)中,與神經(jīng)毒性相關(guān)性最強的排名前五的生物分子靶點為FOS原癌基因(Fosproto-oncogene,FOS)、B細胞淋巴瘤(B-cell lymphoma 2, BCL2)、白細胞介素(Interleukin 1β, IL1β)、AChE和淀粉樣前蛋白(amyloid precursor protein, APP)。在AOP-KB中,共有31條AOPs與神經(jīng)毒性相關(guān),主要通過與AChE和5-羥色胺(serotonin)作用來誘導(dǎo)神經(jīng)毒性。但在ToxCast內(nèi),僅有化學(xué)物質(zhì)的AChE及5-羥色胺的生物測試數(shù)據(jù)。為提高基于AOP的神經(jīng)毒性真陽性預(yù)測率,可增測化學(xué)物質(zhì)的FOS、BCL2和IL1β等生物靶點,并開發(fā)以這些生物靶點為KEs的測試方法。完善AOP-KB(開發(fā)不同毒性的MIE/KE/AO,增加MIE的體外生物測試),擴充化學(xué)物質(zhì)的體外生物測試靶點種類及數(shù)量,提高基于AOP的毒性預(yù)測率。

    聯(lián)合體外生物測試、定性AOP可預(yù)測化學(xué)物質(zhì)未被報道但有潛力引發(fā)的毒性,并提供可能的機制信息。101種化學(xué)物質(zhì)被預(yù)測可能引發(fā)共134種未被報道的毒性效應(yīng),覆蓋了11種毒性類型(圖5(a)),其中消化系統(tǒng)毒性和泌尿系統(tǒng)毒性是2種目前未被報道但可被AOP預(yù)測的數(shù)量最多的毒性類型,均超過了20種。雖然,該結(jié)果可能是因為化學(xué)物質(zhì)激活MIE后,其時間/劑量-效應(yīng)不足以引發(fā)AO而產(chǎn)生“假陽性”現(xiàn)象,但是也反映了基于AOP可在早期低劑量暴露下預(yù)測化學(xué)物質(zhì)的潛在毒性效應(yīng)。例如,氟氯氰菊酯(CAS RN:68359-37-5)是全球使用最廣泛的農(nóng)藥之一,具有消化系統(tǒng)毒性、內(nèi)分泌干擾和神經(jīng)毒性等[44-45]。尚無研究報道氟氯氰菊酯是否可對生物的血液循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生致癌作用。基于AOP的化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測結(jié)果表明,氟氯氰菊酯的“NVS_NR_hPPARg”與“ATG_PPARg_TRANS_up”生物測試結(jié)果為陽性,氟氯氰菊酯可活化PPARg。這表明氟氯氰菊酯有通過引發(fā)“激活特異性核受體”(KE ID:1028),誘導(dǎo)“PPARg活化引發(fā)血管肉瘤”(AOP ID:163),最終引發(fā)有害結(jié)局“血管肉瘤的生成”(KE ID:1037)的可能。以上證據(jù)表明,氟氯氰菊酯具有誘導(dǎo)生物血管肉瘤生成的風(fēng)險,其可能的致毒機制為通過激活PPARg、促進生長因子分泌及間充質(zhì)細胞增殖。另一方面,考慮到真實暴露場景下,MIE被激活后,需要一定劑量脅迫及持續(xù)時間才可能引發(fā)AO??山Y(jié)合qAOP,可進一步探討MIE與AO之間的時間/劑量-效應(yīng)關(guān)系,解決基于AOP的化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測結(jié)果中的“假陽性”問題,提高毒性預(yù)測準(zhǔn)確率。

    基于AOP的化學(xué)物質(zhì)計算毒理學(xué)方法可在未來提高我國化學(xué)物質(zhì)環(huán)境風(fēng)險評估的效率和水平。我國生態(tài)環(huán)境部在2019年發(fā)布的《化學(xué)物質(zhì)環(huán)境風(fēng)險評估技術(shù)方法框架性指南(試行)》提出在重點識別化學(xué)物質(zhì)的致癌性、致突變性、生殖發(fā)育毒性、重復(fù)劑量毒性等慢性毒性以及致敏性等健康危害時可以使用計算毒理學(xué)數(shù)據(jù)[46]。本研究在預(yù)測致癌/遺傳毒性、生殖毒性方面的真陽性預(yù)測率均超過了70%。以生殖毒性為例,目前已有11個生殖毒性相關(guān)的MIEs具有高通量invitro測試方法。在未來,如果同時考慮MIE和對應(yīng)的KE,并由此開展多靶點的invitro項目測試有助于提高基于AOP的化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測的準(zhǔn)確率。

    新型測試方法如組學(xué)方法的建立可大幅提高識別化學(xué)物質(zhì)的分子靶標(biāo)的能力。與單一生物靶點的invitro體外生物測試相比,高通量組學(xué)測試可反映化學(xué)物質(zhì)脅迫下的所有生物響應(yīng)[47],目前以基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組為代表的組學(xué)方法已經(jīng)在化學(xué)物質(zhì)毒性研究中得到廣泛應(yīng)用[48]。盡管ToxCast體外測試已經(jīng)涵蓋了700余種測試靶點,但與生物體潛在作用靶點相比還比較有限。而且這些測試靶點大部分集中于生殖、內(nèi)分泌和致癌性方面,這導(dǎo)致基于現(xiàn)有的體外生物測試數(shù)據(jù)的毒性預(yù)測結(jié)果具有一定的局限性。這也是本研究中針對神經(jīng)毒性、呼吸毒性和血液循環(huán)系統(tǒng)毒性等的TPR值比較低的原因。后續(xù)可通過組學(xué)測試增加化學(xué)物質(zhì)體外生物測試靶點,以提高聯(lián)合體外生物測試數(shù)據(jù)、基于AOP的化學(xué)物質(zhì)的毒性預(yù)測準(zhǔn)確性。

    此外,基于AOP的計算毒理學(xué)策略可用于對化學(xué)物質(zhì)的分層測試(tiered test)和風(fēng)險評估。環(huán)境管理部門很早意識到動物毒性試驗在化學(xué)物質(zhì)毒性評估上的局限性,動物試驗不僅成本高、耗時長,且高劑量暴露的動物測試與人體暴露相關(guān)性差。而單一的替代性方法,invitro或計算模型(insilico)往往僅強調(diào)特定的危害信息,不夠全面。因此綜合應(yīng)用高通量測試、組學(xué)測試和計算模型等信息的策略對化學(xué)物質(zhì)進行分層測試,即根據(jù)第一步測試的結(jié)果,決定下一步必須進行的測試。這極大地減少了動物的使用量,縮短了化學(xué)物質(zhì)危害識別的時間,提高了化學(xué)物質(zhì)風(fēng)險評估的效率[49]。在未來,可將基于AOP的計算毒理學(xué)方法應(yīng)用于設(shè)計化學(xué)物質(zhì)的分層測試與風(fēng)險評估策略。

    綜上,本研究建立了基于AOP、聯(lián)合ToxCast體外測試數(shù)據(jù)的化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測方法,通過與PubChem內(nèi)已報道的化學(xué)物質(zhì)毒性比較,對毒性預(yù)測結(jié)果進行評價。結(jié)果表明,聯(lián)合體外生物測試,AOP框架有潛力實現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)的多類型毒性預(yù)測。我們建議可通過(1)聯(lián)合高通量組學(xué)測試等方法,增加化學(xué)物質(zhì)體外測試的生物靶點種類及數(shù)量;(2)完善AOP-KB,開發(fā)不同毒性類型的AOP及不同生物靶點的MIE;(3)結(jié)合并開發(fā)qAOP,模擬真實暴露場景的時間/劑量-效應(yīng)關(guān)系,減少預(yù)測的“假陰性”結(jié)果;(4)結(jié)合數(shù)據(jù)驅(qū)動(如QSAR、交叉參照、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等),對未經(jīng)生物測試的化學(xué)物質(zhì)進行毒性預(yù)測,提高基于AOP的化學(xué)物質(zhì)高通量毒性預(yù)測的適用范圍及預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確性。

    通訊作者簡介:張效偉(1978—),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要研究方向為生態(tài)毒理學(xué)和健康風(fēng)險評估。

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