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    雙酚A促進糞腸球菌中信息素調(diào)控質(zhì)粒pCF10介導(dǎo)的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移

    2022-06-06 08:29:44楊雨桐周宏瑞楊曉波王尚薛斌李辰宇趙辰張曦諶志強王景峰邱志剛
    生態(tài)毒理學(xué)報 2022年1期
    關(guān)鍵詞:耐藥影響

    楊雨桐,周宏瑞,楊曉波,王尚,薛斌,李辰宇,趙辰,張曦,諶志強,王景峰,邱志剛

    軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所,天津 300050

    糞腸球菌是一種在自然環(huán)境中廣泛存在的革蘭氏陽性細菌。由于其特殊的耐藥機制及高頻率的耐藥基因轉(zhuǎn)移方式,導(dǎo)致了環(huán)境中耐藥糞腸球菌的廣泛傳播??股乜剐曰蛟诩毦械膹V泛傳播,已嚴重威脅到人類的健康[1-2]?;蛟诩毦g的水平轉(zhuǎn)移主要分為轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合3種方式,其中接合是指通過細菌間接觸從而轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的方式,其轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的頻率和效率最高[3]。在腸球菌屬的接合轉(zhuǎn)移中存在一類信息素應(yīng)答質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移,其接合轉(zhuǎn)移頻率高達10-1(接合子數(shù)量/供體菌數(shù)量),且攜帶抗生素抗性基因,使得耐藥現(xiàn)狀更加嚴峻[4-5]。信息素調(diào)控質(zhì)粒編碼了一種利用多肽信息素作為信號分子的特殊接合轉(zhuǎn)移機制。糞腸球菌中的信息素通常是由7~8個氨基酸組成的多肽,這種多肽在無質(zhì)粒的細菌細胞(受體)中產(chǎn)生和釋放,并在含有質(zhì)粒的細菌細胞(供體)中誘導(dǎo)質(zhì)粒發(fā)生轉(zhuǎn)移[6-9]。

    醫(yī)院和養(yǎng)殖場廢水排放等人類活動,自然水體可能被抗生素污染[10],而抗生素殘留給細菌帶來的選擇性壓力是抗生素抗性基因的廣泛傳播的原因之一[11]。但研究者證明非抗生素因素(如納米材料、重金屬離子和消毒劑等)也能夠造成耐藥基因廣泛傳播[12-14]。

    雙酚A(BPA, 4,4’-dihydroxy-2,2-diphenylpropane;CAS:80-05-7)是一種自然水體中常見的環(huán)境雌激素類污染物。雙酚A是世界上生產(chǎn)量最高的化學(xué)原料之一[15],工業(yè)上常使用雙酚A作為單體合成環(huán)氧樹脂等聚合物,用于制造多種生活用品[16]。雙酚A的核心結(jié)構(gòu)類似于天然的17β-雌二醇,因此具有雌激素效應(yīng),經(jīng)廣泛證實是一種內(nèi)分泌干擾物[17-20]。強酸、強堿和高溫等條件會加劇連接雙酚A單體的酯鍵的水解,使得雙酚A單體通過垃圾填埋場滲出液、工業(yè)廢水等途徑進入環(huán)境[19, 21-22]。在自然水體中雙酚A的含量也相對較高,通??捎忙蘥·L-1來計量[23]。雙酚A的化學(xué)構(gòu)象及穿膜方式與信息素類似[24],又與攜帶抗生素抗性基因的細菌在空間上產(chǎn)生交集,如果其能夠促進耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移,將使耐藥基因擴散形勢更加嚴峻。

    本文選擇了最具代表性的信息素調(diào)控質(zhì)粒pCF10質(zhì)粒作為研究對象,通過建立腸球菌間耐藥基因接合轉(zhuǎn)移模型研究了雙酚A濃度及作用時間對pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響規(guī)律;并利用熒光定量PCR技術(shù)測定了雙酚A對調(diào)控信息素產(chǎn)生的相關(guān)基因表達的影響,初步揭示雙酚A促進pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的機制。本研究為全面了解環(huán)境中雙酚A的生物效應(yīng)提供了新的科學(xué)依據(jù),也為環(huán)境中耐藥基因擴散防控和生態(tài)安全提供理論指導(dǎo)。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 菌株、質(zhì)粒培養(yǎng)條件及接合轉(zhuǎn)移實驗

    本研究中使用的細菌均來源于糞腸球菌OG1RF(ATCC47077)。信息素調(diào)控質(zhì)粒pCF10[25]攜帶編碼四環(huán)素抗性的抗性基因,由美國明尼蘇達大學(xué)Gary Dunny教授惠贈。供體菌OGlRF(pCF10)為腸球菌OGlRF攜帶pCF10質(zhì)粒,能夠耐受0.01 g·L-1四環(huán)素;受體菌OGlRS是腸球菌OG1RF經(jīng)本實驗室誘導(dǎo)獲得鏈霉素抗性的腸球菌,能夠耐受3 g·L-1鏈霉素;接合子OG1RS(pCF10)為受體菌OG1RS獲得pCF10質(zhì)粒,能夠耐受0.01 g·L-1四環(huán)素和3 g·L-1鏈霉素。供體菌OG1RF(pCF10)和受體菌OG1RS分別接種于含有對應(yīng)濃度抗生素的腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)(北京酷來搏科技有限公司,中國)中,37 ℃條件下培養(yǎng)10 h后將菌液按1∶10的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的含相應(yīng)抗生素的BHI培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中5 h生長至對數(shù)期。在冷凍離心機(5408R,Eppendorf,德國)4 ℃、4 629g、5 min條件下,利用磷酸緩沖鹽溶液(PBS,北京索萊寶科技有限公司,中國)離心洗滌3次后用LB肉湯培養(yǎng)基(Becton,Dickinson公司,美國)重懸菌液并調(diào)整OG1RF(pCF10)和OG1RS菌液濃度至1×108CFU·mL-1。隨后將供、受體菌按照1∶1的比例混合組成接合轉(zhuǎn)移體系,在37 ℃條件下培養(yǎng)一定時間后,取100 μL菌液利用含2 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA)(純度≥99.5%,上海麥克林生化科技有限公司,中國)的PBS緩沖液進行梯度稀釋。取稀釋2個梯度和3個梯度的10 μL菌液分別滴在含有0.01 g·L-1四環(huán)素和3 g·L-1的鏈霉素的雙抗BHI瓊脂培養(yǎng)基上篩選接合子;取稀釋4個梯度和5個梯度的10 μL菌液滴在只含有3 g·L-1鏈霉素或只含有0.01 g·L-1四環(huán)素的BHI瓊脂培養(yǎng)基上分別篩選受體菌或供體菌。待菌液被充分吸收后,倒置放入37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱,培養(yǎng)36 h左右計數(shù)形成的單菌落。

    1.2 雙酚A濃度對pCF10接合轉(zhuǎn)移影響實驗

    雙酚A(純度≥99%,Sigma-Aldrich公司,美國)溶于二甲基亞砜(DMSO)(純度≥99.7%,Sigma-Aldrich公司,美國),制成濃度為1 mmol·L-1的儲備液。按照1.1中制備接合轉(zhuǎn)移體系的方法制備7份體積相同接合菌液,其中5份分別加入濃度為1×10-2、1×10-1、1、10和100 nmol·L-1的雙酚A,其余2份分別加入等體積的滅菌雙蒸水和終濃度為1.1×10-2g·L-1的DMSO作對照。菌液混勻后置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后,按照1.1中的方法分別計數(shù)供體菌、受體菌和接合子數(shù)量。本實驗至少重復(fù)3次。

    1.3 雙酚A作用時間對pCF10接合轉(zhuǎn)移影響實驗

    按照1.1中的方法制備3份接合轉(zhuǎn)移菌液,其中一份加入終濃度為1 nmol·L-1的雙酚A,另外2份分別加入等體積的滅菌雙蒸水和DMSO作為對照。同時制備供體菌和受體菌菌液,按照以上方法加入雙酚A、雙蒸水和DMSO,進行雙酚A對供、受體菌生長的影響實驗。所有菌液混勻后置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng),分別在1、2、4、6和8 h取出100 μL菌液按照1.1中的方法分別計數(shù)供體菌、受體菌和接合子數(shù)量。本實驗至少重復(fù)3次。

    1.4 活性氧檢測

    按照1.1中的方法制備供體菌、受體菌和接合轉(zhuǎn)移菌液各3份。在供、受體菌和接合轉(zhuǎn)移菌液中各取一份加入1 nmol·L-1的雙酚A處理4 h,另外2份加入滅菌雙蒸水和活性氧檢測試劑盒提供的陽性對照Rosup分別作為陰性對照和陽性對照。取雙酚A和Rosup處理4 h后的接合轉(zhuǎn)移菌液各100 μL進行接合子計數(shù),剩余菌液用于測定活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量。ROS的測定參照活性氧檢測試劑盒(CA1410,北京索萊寶科技有限公司,中國)的使用說明進行。具體步驟如下:1 mL細胞懸液加入1 μL(終濃度為10 μmol·L-1)新鮮制備的DCFH-DA熒光探針?;旌衔镌?7 °C條件下靜置20 min,每5 min振蕩顛倒混勻一次。在4 ℃、4 629g、5 min條件下,用PBS離心清洗3次以去除多余的熒光探針。使用酶標儀(SpectraMax M5,Molecular Devices公司,美國)在激發(fā)光488 nm、發(fā)射光525 nm測定熒光值。

    1.5 細菌總RNA的提取

    按照1.1中的方法制備接合轉(zhuǎn)移菌液,加入終濃度1 nmol·L-1的雙酚A(等體積的雙蒸水作為對照)在37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后,迅速回收細菌細胞,置于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。解凍后? ℃、9 700g、2 min條件下離心完全去除上清,細菌沉淀用于提取總RNA。使用細菌總RNA提取試劑盒(DP430,天根生化科技有限公司,中國)提取細菌總RNA,具體操作過程按照試劑盒說明書進行。利用微量分光光度計(ND-ONE-W,Thermo Fisher公司,美國)測定RNA濃度后,利用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(KR116-02,天根生化科技有限公司,中國)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄的操作按照試劑盒說明書進行,所用的引物為試劑盒提供的FQ-RT Primer Mix。cDNA置于-80 ℃低溫冰箱保存,用于后面的熒光定量PCR實驗。

    1.6 細菌基因組DNA的提取

    按照1.1中的方法制備接合轉(zhuǎn)移菌液,加入終濃度1 nmol·L-1的雙酚A(等體積的雙蒸水作為對照)在37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后,迅速回收細菌細胞。使用細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302,天根生化科技有限公司,中國)分別提取雙酚A處理組和對照組的細菌基因組DNA。提取的DNA置于-80 ℃低溫冰箱保存,用于后面的熒光定量PCR實驗。

    1.7 熒光定量PCR實驗

    熒光定量PCR實驗中所用的引物利用軟件DNASTAR V7.1進行設(shè)計,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。相關(guān)基因引物序列及擴增產(chǎn)物片段長度如表1所示。

    熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括SYBR Green預(yù)混液(A25742,Thermo Fisher公司,美國) 10 μL,上下游引物(終濃度為5×10-2nmol·L-1)各1 μL,cDNA模板1 μL,雙蒸水7 μL。每個樣品至少做3個復(fù)孔。熒光定量PCR實驗在美國Bio-Rad公司型號為CFX96的熒光定量PCR儀上完成,所用軟件為Bio-Rad CFX Maestro。PCR的擴增程序為95 ℃預(yù)變性5min,然后進行40個循環(huán)的95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s和72 ℃延伸10 s。最后進行熔解曲線測定,程序為:65 °C 5 s,升高至95 °C變性DNA產(chǎn)物。

    利用絕對定量的方法計算樣品目的基因拷貝值,以內(nèi)參基因16S rRNA校正PCR模板的拷貝數(shù)。研究中的基因擴增標準曲線如圖1所示。

    1.8 信息素的測定方法

    按照1.1中方法制備接合菌液2份,其中1份加入終濃度為1 nmol·L-1的雙酚A,另1份加入等體積的雙蒸水作為對照。接合菌液放置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,迅速取出并放置于冰上20 min。離心機在12 857g、4 ℃條件下離心10 min,保留上清液,然后用0.22 μm孔徑的一次性針頭式濾器(SLGP033RB,Millipore公司,美國)過濾上清。取800 μL過濾后的上清液加入100 μL乙腈(純度≥99.9%,上海麥克林生化科技有限公司,中國)和100 μL氫氧化銨(純度≥25%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司,中國),室溫1 400 r·min-1混勻15 min后,在21 ℃、20 000g條件下離心15 min。取600 μL上清液與600 μL 10%氫氧化銨水溶液(V∶V)混合,短暫離心后使用C18固相萃取柱(廣州翔博生物科技有限公司,中國)進行萃取。首先分別將5 mL乙腈和5 mL水通過固相萃取柱,使其活化。然后將1 mL樣品通過固相萃取柱,依次用5 mL 5%乙腈水溶液(V∶V)、0.75 mL和0.5 mL 30%乙腈水溶液(V∶V)進行洗脫,收集第2次和第3次洗脫樣品在液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(H CLASS_XEVO TQ-S micro,Waters公司,美國)上進行檢測。

    表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

    圖1 不同基因拷貝數(shù)的對數(shù)值與擴增循環(huán)數(shù)的對應(yīng)關(guān)系標準曲線Fig. 1 Standard curve corresponding to the log of the copy number of each primer gene and cycle threshold

    超高效液相條件:C18 (1.7 μm,2.1 mm×50 mm,Waters公司,美國)色譜柱,流動相:乙腈(A),0.1%甲酸(純度≥99.5%,上海麥克林生化科技有限公司,中國)、5 mmol·L-1乙酸銨的水溶液(B)。體積流量0.3 mL·min-1,柱溫35 ℃,進樣量5 μL。梯度洗脫程序:0~0.5 min,96%A;0.5~1.5 min,40%A;1.5~2.5 min,40%A;2.5~3 min,96%A;3~5 min,96%A。

    質(zhì)譜條件:選擇ESI正離子模式,其余條件如表2所示。

    表2 質(zhì)譜條件參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用GraphPad Prism 8.3.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,并利用SPSS 26.0軟件對多因素影響接合子數(shù)量、測定ROS水平的相關(guān)實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,對測定基因轉(zhuǎn)錄水平和信息素含量等相關(guān)實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗分析,P<0.05被認為有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。

    2 結(jié)果(Results)

    2.1 雙酚A濃度對糞腸球菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響

    雙酚A濃度對糞腸球菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響如圖2所示。供體菌和受體菌初始濃度均為1×108CFU·mL-1,接合轉(zhuǎn)移4 h條件下,自然狀態(tài)下形成接合子數(shù)量約為6.61×105CFU·mL-1(Control組)。同時在1.1×10-2g·L-1的DMSO作用下,接合子數(shù)量為6.27×105CFU·mL-1,與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(one-way ANOVA,P>0.05),說明溶劑DMSO對pCF10質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移無影響。接合體系在1 nmol·L-1雙酚A作用4 h后接合子數(shù)量約為1.37×106CFU·mL-1,可達對照組的2倍左右。在1×10-1nmol·L-1和1×10-2nmol·L-1的雙酚A作用下,接合體系中接合子的數(shù)量也有明顯的提升(1.12~1.19×106CFU·mL-1)。1、10-1和10-2nmol·L-1的雙酚A顯著地提高了接合子的數(shù)量,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著性差異(one-way ANOVA,P<0.05)。而在10 nmol·L-1和100 nmol·L-1濃度的雙酚A作用下,接合子數(shù)量在6.11×105CFU·mL-1,與對照組相比無明顯差異(one-way ANOVA,P>0.05)。這一結(jié)果表明,在1×10-2~1 nmol·L-1的濃度范圍內(nèi),雙酚A對pCF10質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移具有促進作用,并且這一影響與雙酚A濃度相關(guān)。

    圖2 雙酚A(BPA)濃度對接合轉(zhuǎn)移的影響(*P<0.05、**P<0.01)注:DMSO表示該組為加入終濃度為1.1×10-2 g·L-1的二甲基亞砜(DMSO)的對照組。Fig. 2 Effect of bisphenol A (BPA) concentration on conjugative transfer (*P<0.05, **P<0.01)Note: DMSO indicates that the group added with a final concentration of 1.1×10-2 g·L-1 of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a control.

    為了進一步確定雙酚A能夠促進接合轉(zhuǎn)移體系中耐藥基因tetM豐度的增加,利用熒光定量PCR的方法測定了tetM基因在接合轉(zhuǎn)移前后的豐度。如圖3所示,在接合開始時實驗組與對照組的tetM基因相對豐度均在5×10-3左右。當(dāng)接合時間達到4 h時,1 nmol·L-1雙酚A作用后的接合體系中tetM基因相對豐度可達1.2×10-1左右,而自然狀態(tài)下發(fā)生接合轉(zhuǎn)移的體系中tetM基因相對豐度僅為8×10-2左右,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著性差異(t-test,P<0.01)。在雙酚A作用下,耐藥基因tetM的相對基因豐度可提高1.5倍。這一結(jié)果表明,雙酚A可以通過接合轉(zhuǎn)移的方式使耐藥基因的相對豐度顯著提高。

    圖3 雙酚A作用下,tetM基因相對豐度的變化(**P<0.01)Fig. 3 Changes in the relative abundance of tetM under the effect of BPA (**P<0.01)

    2.2 雙酚A作用時間對糞腸球菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響

    雙酚A作用時間對糞腸球菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響如圖4所示。在自然狀態(tài)下(Control組),pCF10質(zhì)粒的接合子數(shù)量在接合時間0~4 h內(nèi)隨作用時間的延長而增加,在接合4 h時接合子數(shù)量在9.3×105CFU·mL-1左右,達到最高點。在接合4 h后,接合子數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢。同時在1.1×10-2g·L-1的DMSO作用下,在作用時間1~8 h內(nèi)接合子數(shù)量與空白對照組相比經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無明顯差異(one-way ANOVA,P>0.05),說明溶劑DMSO對pCF10質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移無顯著影響。在1 nmol·L-1雙酚A作用于接合體系4~6 h后,接合子數(shù)量相較于空白對照組有明顯的增加,其中雙酚A作用4 h后,接合子數(shù)量可由8.6×105CFU·mL-1升至1.5×106CFU·mL-1,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著性差異(one-way ANOVA,P<0.05)。結(jié)果表明,在雙酚A作用下,接合子數(shù)量隨時間的變化趨勢與自然狀態(tài)下類似,均呈現(xiàn)出隨著作用時間的延長,接合子數(shù)量先增加后降低的規(guī)律。接合時間在4~6 h時,雙酚A對pCF10質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移具有促進作用,且在接合4 h時,雙酚A對接合轉(zhuǎn)移的促進作用最明顯。

    通過進一步觀察供受體菌的生長情況可以發(fā)現(xiàn)(圖5),接合轉(zhuǎn)移過程中雙酚A作用下的供受體菌數(shù)量與對照組相比均無明顯變化。這一結(jié)果表明,雙酚A不是通過影響供受體菌數(shù)量從而影響接合子數(shù)量的。

    圖4 雙酚A作用下,接合時間對接合轉(zhuǎn)移的影響(**P<0.01)Fig. 4 Effect of treatment time on conjugative transfer in the presence of BPA (**P<0.01)

    2.3 雙酚A對細菌氧化應(yīng)激的影響

    許多研究表明,ROS的產(chǎn)生會促進RP4、RK2等質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)接[12, 29],但是雙酚A是否也是通過促使腸球菌產(chǎn)生ROS進而影響pCF10質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移還未可知。本文研究了雙酚A對糞腸球菌ROS產(chǎn)生的影響及ROS的產(chǎn)生對pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響。研究結(jié)果表明,在作用4 h后雙酚A雖然能夠顯著促進pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移,但在該時刻供、受體菌和接合體系細菌細胞中的ROS含量與對照組相比均無明顯差異(圖6(a),one-way ANOVA,P>0.05),說明雙酚A促進pCF10接合轉(zhuǎn)移過程并未影響細菌的ROS的產(chǎn)生。為了進一步確證雙酚A對本接合轉(zhuǎn)移體系中ROS產(chǎn)生的影響,我們將其作用時間延長至24 h,發(fā)現(xiàn)其作用下ROS水平與對照組比較有了明顯的升高(圖6(b)),但是我們使用ROS陽性對照Rosup處理接合細菌4 h后進行接合子計數(shù)(圖6(c))后發(fā)現(xiàn),Rosup處理組的接合子數(shù)量相較于對照組并無明顯差異(約在5×105CFU·mL-1)。這些結(jié)果表明,雙酚A促進糞腸球菌中的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移不是通過影響細菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激這一途徑實現(xiàn)的。

    圖5 雙酚A對接合轉(zhuǎn)移過程中供體菌的影響(a)和雙酚A對接合轉(zhuǎn)移過程中受體菌的影響(b)Fig. 5 Effect of BPA on donor bacteria during conjugative transfer (a) and effect of BPA on receptor bacteria during conjugative transfer (b)

    圖6 雙酚A對活性氧(ROS)水平及接合轉(zhuǎn)移的影響注:(a)接合4 h后受體菌、供體菌及接合體系中的ROS水平;(b)接合24 h后接合體系中的ROS水平;(c)雙酚A及ROS陽性對照Rosup對接合轉(zhuǎn)移的影響;**P<0.01。Fig. 6 Effect of BPA on reactive oxygen species (ROS) levels and conjugative transferNote: (a) ROS levels in recipient bacteria, donor bacteria, and conjugation after 4 h of conjugation initiation; (b) ROS levels in conjugation after 24 h of conjugation initiation; (c) Effect of BPA and ROS control Rosup on conjugative transfer; **P<0.01.

    2.4 雙酚A對信息素編碼基因表達和信息素生成的影響

    pCF10系統(tǒng)中,ccfA基因編碼正調(diào)控信息素cCF10[30],prgQ基因編碼負調(diào)控信息素iCF10[26],2種信息素互為拮抗作用,更高效地調(diào)控接合轉(zhuǎn)移過程。我們研究了雙酚A對調(diào)控信息素編碼基因ccfA和prgQ的mRNA表達的影響。在雙酚A的作用下,ccfA基因的表達量由對照組的3.5×10-3copies·(16S)-1升高至6×10-3copies·(16S)-1,prgQ基因的表達量由對照組的1.5×10-2copies·(16S)-1升高至2.5×10-2copies·(16S)-1,均具有顯著性差異(t-test,P<0.05)(圖7)。我們進一步檢測了接合體系上清液中信息素cCF10的含量,實驗結(jié)果表明,在雙酚A作用下,接合體系上清液中信息素濃度由0.33 ng·mL-1提高至0.84 ng·mL-1,升高了2倍左右(圖8)。在雙酚A作用下,翻譯后水解形成成熟的信息素cCF10的濃度顯著升高,這也與ccfA基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高相對應(yīng)。雙酚A通過調(diào)控生成信息素基因的mRNA表達,進而促進信息素的生成可能是雙酚A促進pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的重要機制。

    圖7 雙酚A對信息素編碼基因表達的影響注:*P<0.05。Fig. 7 Effect of BPA on the expression of pheromone-encoded genesNote: *P<0.05.

    圖8 雙酚A作用下,接合體系上清液中信息素含量的變化注:*P<0.05。Fig. 8 Changes in the pheromone concentration in the supernatant of the conjugative system under the effect of BPANote: *P<0.05.

    3 討論(Discussion)

    內(nèi)分泌干擾物雙酚A在環(huán)境中的污染問題一直廣受關(guān)注,其在自然水體中大量分布[31-32],對人體健康構(gòu)成的嚴重威脅也不容小覷[21, 33-34]。尤其是雙酚A對生殖健康的影響已有不少研究報道[35-36],但關(guān)于雙酚A對耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的影響和機制卻鮮有報道。糞腸球菌不但具有較強的天然耐藥性[37],且極易被誘導(dǎo)而發(fā)生高效的耐藥基因水平轉(zhuǎn)移[38]。本文揭示了耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的新途徑,同時也提示我們關(guān)注環(huán)境污染物的生物效應(yīng)形式和機制,重新認識其在環(huán)境中的作用和行為,對生態(tài)安全領(lǐng)域具有重要意義。

    雙酚A對pCF10質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移具有促進作用且與雙酚A濃度相關(guān)(圖2),即在一定濃度范圍內(nèi)具有促進作用。當(dāng)雙酚A濃度在1×10-2~1 nmol·L-1的范圍內(nèi)時,雙酚A具有促進pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的效應(yīng),且在1 nmol·L-1時促進效果最強。雙酚A濃度影響細胞生理活動的研究不勝枚舉,如雙酚A影響精原細胞增殖時,劑量-效應(yīng)曲線呈倒U型,當(dāng)雙酚A濃度超過特定范圍時促進細胞增殖的效應(yīng)顯著下降[39]。有研究報道,一些微生物可以通過活躍的化學(xué)外排或化學(xué)降解抵抗因雙酚A暴露濃度增加而升高的毒性[40]。在本研究中出現(xiàn)劑量-效應(yīng)曲線為倒U型的現(xiàn)象推測是由于高濃度雙酚A作用下,細菌的外排能力或降解能力已達到極限。過量的雙酚A對細菌產(chǎn)生毒性,從而影響了細菌接合轉(zhuǎn)移的能力。

    細菌對抗生素的耐藥性通常是通過可移動的遺傳元件如接合質(zhì)粒或接合轉(zhuǎn)座子等獲得的,使接合轉(zhuǎn)移發(fā)生在病原菌或共生菌之間[41-42]。在pCF10質(zhì)粒中,四環(huán)素抗性基因tetM存在于接合轉(zhuǎn)座子Tn916中[43]。通過基因的水平轉(zhuǎn)移,四環(huán)素抗性基因可以隨轉(zhuǎn)座子擴散到其他細菌中,使其也對抗生素產(chǎn)生耐藥性。在雙酚A作用下,由糞腸球菌組成的接合體系中耐藥基因的相對豐度顯著提升(圖3),意味著雙酚A能夠使體系中含有耐藥基因tetM的細菌與細菌總量的比例從8%提高到>1%。糞腸球菌作為廣泛分布于人體腸道內(nèi),且易于在環(huán)境中存活的指示微生物,已被證明其存在與自然水體游泳者患胃腸疾病相關(guān)[44]。而每年全世界消費雙酚A的體量也不容忽視,在自然水環(huán)境中,雙酚A含量一般在1 ng·L-1~1 μg·L-1的范圍內(nèi)[21, 23, 45],與本研究中雙酚A影響耐藥基因轉(zhuǎn)移的濃度范圍基本重合。當(dāng)糞腸球菌與雙酚A在時間和空間上發(fā)生重疊,便極大地增加了耐藥基因擴散的環(huán)境風(fēng)險,對人類健康造成嚴重影響,也對生態(tài)安全構(gòu)成了極大的威脅。

    雙酚A對pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的促進作用與雙酚A作用下的接合時間相關(guān)(圖4)。在雙酚A作用下,接合時間為4 h時,接合子數(shù)量達到最高點。當(dāng)接合時間超過4 h后,接合子數(shù)量隨時間的延長逐漸下降。多肽信息素屬于革蘭氏陽性菌的群體感應(yīng)信號分子[46],胞外的信號分子隨著培養(yǎng)時間的延長而累積,從而產(chǎn)生群感效應(yīng)以調(diào)節(jié)細菌的群體行為[47]。接合子數(shù)量在達到接合終點后隨時間推移而降低,我們分析該現(xiàn)象是由于群感效應(yīng)中細胞自身的程序性自殺機制激活了細胞死亡,接合子數(shù)量逐漸回歸初始水平。

    細菌細胞中的ROS主要包括超氧陰離子自由基(O2·-)、·OH和H2O2[48]。當(dāng)ROS含量超過自身可以承載的水平時就會引起細菌的氧化應(yīng)激,從而損害細菌的各種生物大分子,例如核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等[49]。目前有研究證明了細菌耐藥性與ROS的產(chǎn)生存在一定相關(guān)性。研究者發(fā)現(xiàn)ROS可以造成細菌DNA的突變或篩選出抗氧化能力較強的菌株,進而增加耐藥菌株產(chǎn)生的概率[50-51]。在細菌接合轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究中,也有很多研究者認為細菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激是其接合轉(zhuǎn)移升高的原因之一[12, 14]。因細菌中ROS主要在細胞膜上產(chǎn)生,過量的ROS會對細胞膜蛋白造成影響,繼而改變其通透性,使得質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移增加[52-53]。大量實驗證明,在RP4質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移體系中,多種影響因素如納米材料[12]、非營養(yǎng)性甜味劑[54]以及非阿片類止痛藥[55]等都可以通過產(chǎn)生ROS,誘導(dǎo)細菌的氧化應(yīng)激,從而促進質(zhì)粒在革蘭氏陰性細菌大腸桿菌中的接合轉(zhuǎn)移。本研究中雙酚A作用4 h時未引起糞腸球菌中ROS含量升高(圖6(a)),可能是由于其作為革蘭氏陽性細菌細胞壁較厚,雙酚A刺激在在短時間內(nèi)未能引起細菌細胞反應(yīng)。也有實驗證明雙酚A作用24 h后可以刺激細胞中ROS的產(chǎn)生,引起氧化應(yīng)激[56]。本文通過實驗證明雙酚A作用于接合體系24 h后可以引起細菌細胞內(nèi)ROS含量的升高(圖6(b)),但由于接合轉(zhuǎn)移反應(yīng)較為迅速,還未達到產(chǎn)生較強ROS的時刻,接合轉(zhuǎn)移已經(jīng)完成。接下來通過進一步實驗證明,在產(chǎn)生大量ROS的Rosup作用下,接合轉(zhuǎn)移并未發(fā)生顯著提升(圖6(c))。故得出結(jié)論雙酚A促進糞腸球菌中的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移不是通過影響細菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激這一途徑實現(xiàn)的。

    本研究主要從雙酚A對信息素編碼基因的mRNA表達和信息素的生成等方面初步探討了雙酚A影響pCF10介導(dǎo)的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的機制。糞腸球菌OG1RF中ccfA基因編碼一種名為CcfA的脂蛋白前體,成熟的多肽信息素是由CcfA經(jīng)蛋白水解加工而成的[8]。為了防止信息素造成的自體誘導(dǎo),供體細菌分泌抑制肽iCF10作為cCF10的競爭性抑制劑。抑制肽iCF10由pCF10質(zhì)粒上的prgQ基因編碼。雙酚A可以促進編碼信息素cCF10的ccfA基因的表達(圖7(a)),同時誘發(fā)了接合體系中的prgQ基因高表達。通過測定雙酚A處理后接合體系上清液中信息素濃度顯著升高(圖8),進一步證明雙酚A可以通過促進信息素編碼基因ccfA表達,繼而促進信息素的生成,最終促進接合轉(zhuǎn)移的高頻發(fā)生。

    綜上所述,本研究初步證實了自然水體環(huán)境濃度下的雙酚A能夠促進信息素調(diào)控質(zhì)粒pCF10介導(dǎo)的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移,并對雙酚A影響pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的機制進行了初步探討。目前關(guān)于雙酚A成為內(nèi)分泌干擾物的研究已有一些進展,但多局限于臨床領(lǐng)域。而雙酚A作為環(huán)境雌激素類污染物在環(huán)境中的行為和影響抗生素抗性基因擴散的機制尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究證明雙酚A除對人類健康造成直接影響外,還會影響環(huán)境中耐藥基因的豐度,使抗生素抗性基因擴散形勢更為嚴峻。本研究將增強社會對環(huán)境雌激素污染物生物效應(yīng)的認識和理解,填補雙酚A這一傳統(tǒng)環(huán)境污染物在生態(tài)安全領(lǐng)域的研究空缺。為人類與生態(tài)環(huán)境和諧共處提供理論基礎(chǔ),或?qū)閷崿F(xiàn)對雙酚A和抗生素抗性基因傳播元件的監(jiān)測和控制這一最終目標提供技術(shù)支持。本研究對雙酚A影響耐藥基因擴散的機制進行了初步的探索,但對于它的深層機制仍亟需進一步研究。信息素調(diào)控質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移過程需要通過一個相對復(fù)雜的系統(tǒng)進行調(diào)控,如供、受體細菌間的粘附、質(zhì)粒的切割、組裝及跨膜轉(zhuǎn)運等過程。雙酚A是否對這些調(diào)控過程產(chǎn)生影響從而對質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移造成影響,還有待于我們進一步研究。

    通訊作者簡介:邱志剛(1979—),男,博士,研究員,主要研究方向細菌耐藥性的產(chǎn)生、發(fā)展與控制。

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