雙酚A促進(jìn)糞腸球菌中信息素調(diào)控質(zhì)粒pCF10介導(dǎo)的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移

楊雨桐，周宏瑞，楊曉波，王尚，薛斌，李辰宇，趙辰，張曦，諶志強(qiáng)，王景峰，邱志剛

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050

糞腸球菌是一種在自然環(huán)境中廣泛存在的革蘭氏陽性細(xì)菌。由于其特殊的耐藥機(jī)制及高頻率的耐藥基因轉(zhuǎn)移方式，導(dǎo)致了環(huán)境中耐藥糞腸球菌的廣泛傳播?？股乜剐曰蛟诩?xì)菌中的廣泛傳播，已嚴(yán)重威脅到人類的健康[1-2]。基因在細(xì)菌間的水平轉(zhuǎn)移主要分為轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合3種方式，其中接合是指通過細(xì)菌間接觸從而轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的方式，其轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的頻率和效率最高[3]。在腸球菌屬的接合轉(zhuǎn)移中存在一類信息素應(yīng)答質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移，其接合轉(zhuǎn)移頻率高達(dá)10-1(接合子數(shù)量/供體菌數(shù)量)，且攜帶抗生素抗性基因，使得耐藥現(xiàn)狀更加嚴(yán)峻[4-5]。信息素調(diào)控質(zhì)粒編碼了一種利用多肽信息素作為信號(hào)分子的特殊接合轉(zhuǎn)移機(jī)制。糞腸球菌中的信息素通常是由7～8個(gè)氨基酸組成的多肽，這種多肽在無質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞(受體)中產(chǎn)生和釋放，并在含有質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞(供體)中誘導(dǎo)質(zhì)粒發(fā)生轉(zhuǎn)移[6-9]。

醫(yī)院和養(yǎng)殖場廢水排放等人類活動(dòng)，自然水體可能被抗生素污染[10]，而抗生素殘留給細(xì)菌帶來的選擇性壓力是抗生素抗性基因的廣泛傳播的原因之一[11]。但研究者證明非抗生素因素(如納米材料、重金屬離子和消毒劑等)也能夠造成耐藥基因廣泛傳播[12-14]。

雙酚A(BPA, 4,4’-dihydroxy-2,2-diphenylpropane；CAS：80-05-7)是一種自然水體中常見的環(huán)境雌激素類污染物。雙酚A是世界上生產(chǎn)量最高的化學(xué)原料之一[15]，工業(yè)上常使用雙酚A作為單體合成環(huán)氧樹脂等聚合物，用于制造多種生活用品[16]。雙酚A的核心結(jié)構(gòu)類似于天然的17β-雌二醇，因此具有雌激素效應(yīng)，經(jīng)廣泛證實(shí)是一種內(nèi)分泌干擾物[17-20]。強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和高溫等條件會(huì)加劇連接雙酚A單體的酯鍵的水解，使得雙酚A單體通過垃圾填埋場滲出液、工業(yè)廢水等途徑進(jìn)入環(huán)境[19, 21-22]。在自然水體中雙酚A的含量也相對(duì)較高，通?？捎忙蘥·L-1來計(jì)量[23]。雙酚A的化學(xué)構(gòu)象及穿膜方式與信息素類似[24]，又與攜帶抗生素抗性基因的細(xì)菌在空間上產(chǎn)生交集，如果其能夠促進(jìn)耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移，將使耐藥基因擴(kuò)散形勢(shì)更加嚴(yán)峻。

本文選擇了最具代表性的信息素調(diào)控質(zhì)粒pCF10質(zhì)粒作為研究對(duì)象，通過建立腸球菌間耐藥基因接合轉(zhuǎn)移模型研究了雙酚A濃度及作用時(shí)間對(duì)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響規(guī)律；并利用熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定了雙酚A對(duì)調(diào)控信息素產(chǎn)生的相關(guān)基因表達(dá)的影響，初步揭示雙酚A促進(jìn)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的機(jī)制。本研究為全面了解環(huán)境中雙酚A的生物效應(yīng)提供了新的科學(xué)依據(jù)，也為環(huán)境中耐藥基因擴(kuò)散防控和生態(tài)安全提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 菌株、質(zhì)粒培養(yǎng)條件及接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

本研究中使用的細(xì)菌均來源于糞腸球菌OG1RF(ATCC47077)。信息素調(diào)控質(zhì)粒pCF10[25]攜帶編碼四環(huán)素抗性的抗性基因，由美國明尼蘇達(dá)大學(xué)Gary Dunny教授惠贈(zèng)。供體菌OGlRF(pCF10)為腸球菌OGlRF攜帶pCF10質(zhì)粒，能夠耐受0.01 g·L-1四環(huán)素；受體菌OGlRS是腸球菌OG1RF經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)獲得鏈霉素抗性的腸球菌，能夠耐受3 g·L-1鏈霉素；接合子OG1RS(pCF10)為受體菌OG1RS獲得pCF10質(zhì)粒，能夠耐受0.01 g·L-1四環(huán)素和3 g·L-1鏈霉素。供體菌OG1RF(pCF10)和受體菌OG1RS分別接種于含有對(duì)應(yīng)濃度抗生素的腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)(北京酷來搏科技有限公司，中國)中，37 ℃條件下培養(yǎng)10 h后將菌液按1∶10的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的含相應(yīng)抗生素的BHI培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中5 h生長至對(duì)數(shù)期。在冷凍離心機(jī)(5408R，Eppendorf，德國)4 ℃、4 629g、5 min條件下，利用磷酸緩沖鹽溶液(PBS，北京索萊寶科技有限公司，中國)離心洗滌3次后用LB肉湯培養(yǎng)基(Becton，Dickinson公司，美國)重懸菌液并調(diào)整OG1RF(pCF10)和OG1RS菌液濃度至1×108CFU·mL-1。隨后將供、受體菌按照1∶1的比例混合組成接合轉(zhuǎn)移體系，在37 ℃條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后，取100 μL菌液利用含2 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA)(純度≥99.5%，上海麥克林生化科技有限公司，中國)的PBS緩沖液進(jìn)行梯度稀釋。取稀釋2個(gè)梯度和3個(gè)梯度的10 μL菌液分別滴在含有0.01 g·L-1四環(huán)素和3 g·L-1的鏈霉素的雙抗BHI瓊脂培養(yǎng)基上篩選接合子；取稀釋4個(gè)梯度和5個(gè)梯度的10 μL菌液滴在只含有3 g·L-1鏈霉素或只含有0.01 g·L-1四環(huán)素的BHI瓊脂培養(yǎng)基上分別篩選受體菌或供體菌。待菌液被充分吸收后，倒置放入37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱，培養(yǎng)36 h左右計(jì)數(shù)形成的單菌落。

1.2 雙酚A濃度對(duì)pCF10接合轉(zhuǎn)移影響實(shí)驗(yàn)

雙酚A(純度≥99%，Sigma-Aldrich公司，美國)溶于二甲基亞砜(DMSO)(純度≥99.7%，Sigma-Aldrich公司，美國)，制成濃度為1 mmol·L-1的儲(chǔ)備液。按照1.1中制備接合轉(zhuǎn)移體系的方法制備7份體積相同接合菌液，其中5份分別加入濃度為1×10-2、1×10-1、1、10和100 nmol·L-1的雙酚A，其余2份分別加入等體積的滅菌雙蒸水和終濃度為1.1×10-2g·L-1的DMSO作對(duì)照。菌液混勻后置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，按照1.1中的方法分別計(jì)數(shù)供體菌、受體菌和接合子數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3 雙酚A作用時(shí)間對(duì)pCF10接合轉(zhuǎn)移影響實(shí)驗(yàn)

按照1.1中的方法制備3份接合轉(zhuǎn)移菌液，其中一份加入終濃度為1 nmol·L-1的雙酚A，另外2份分別加入等體積的滅菌雙蒸水和DMSO作為對(duì)照。同時(shí)制備供體菌和受體菌菌液，按照以上方法加入雙酚A、雙蒸水和DMSO，進(jìn)行雙酚A對(duì)供、受體菌生長的影響實(shí)驗(yàn)。所有菌液混勻后置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在1、2、4、6和8 h取出100 μL菌液按照1.1中的方法分別計(jì)數(shù)供體菌、受體菌和接合子數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.4 活性氧檢測(cè)

按照1.1中的方法制備供體菌、受體菌和接合轉(zhuǎn)移菌液各3份。在供、受體菌和接合轉(zhuǎn)移菌液中各取一份加入1 nmol·L-1的雙酚A處理4 h，另外2份加入滅菌雙蒸水和活性氧檢測(cè)試劑盒提供的陽性對(duì)照Rosup分別作為陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。取雙酚A和Rosup處理4 h后的接合轉(zhuǎn)移菌液各100 μL進(jìn)行接合子計(jì)數(shù)，剩余菌液用于測(cè)定活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量。ROS的測(cè)定參照活性氧檢測(cè)試劑盒(CA1410，北京索萊寶科技有限公司，中國)的使用說明進(jìn)行。具體步驟如下：1 mL細(xì)胞懸液加入1 μL(終濃度為10 μmol·L-1)新鮮制備的DCFH-DA熒光探針?；旌衔镌?7 °C條件下靜置20 min，每5 min振蕩顛倒混勻一次。在4 ℃、4 629g、5 min條件下，用PBS離心清洗3次以去除多余的熒光探針。使用酶標(biāo)儀(SpectraMax M5，Molecular Devices公司，美國)在激發(fā)光488 nm、發(fā)射光525 nm測(cè)定熒光值。

1.5 細(xì)菌總RNA的提取

按照1.1中的方法制備接合轉(zhuǎn)移菌液，加入終濃度1 nmol·L-1的雙酚A(等體積的雙蒸水作為對(duì)照)在37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，迅速回收細(xì)菌細(xì)胞，置于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。解凍后? ℃、9 700g、2 min條件下離心完全去除上清，細(xì)菌沉淀用于提取總RNA。使用細(xì)菌總RNA提取試劑盒(DP430，天根生化科技有限公司，中國)提取細(xì)菌總RNA，具體操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。利用微量分光光度計(jì)(ND-ONE-W，Thermo Fisher公司，美國)測(cè)定RNA濃度后，利用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(KR116-02，天根生化科技有限公司，中國)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄的操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，所用的引物為試劑盒提供的FQ-RT Primer Mix。cDNA置于-80 ℃低溫冰箱保存，用于后面的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)菌基因組DNA的提取

按照1.1中的方法制備接合轉(zhuǎn)移菌液，加入終濃度1 nmol·L-1的雙酚A(等體積的雙蒸水作為對(duì)照)在37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，迅速回收細(xì)菌細(xì)胞。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302，天根生化科技有限公司，中國)分別提取雙酚A處理組和對(duì)照組的細(xì)菌基因組DNA。提取的DNA置于-80 ℃低溫冰箱保存，用于后面的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

1.7 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中所用的引物利用軟件DNASTAR V7.1進(jìn)行設(shè)計(jì)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。相關(guān)基因引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度如表1所示。

熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Green預(yù)混液(A25742，Thermo Fisher公司，美國) 10 μL，上下游引物(終濃度為5×10-2nmol·L-1)各1 μL，cDNA模板1 μL，雙蒸水7 μL。每個(gè)樣品至少做3個(gè)復(fù)孔。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)在美國Bio-Rad公司型號(hào)為CFX96的熒光定量PCR儀上完成，所用軟件為Bio-Rad CFX Maestro。PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s和72 ℃延伸10 s。最后進(jìn)行熔解曲線測(cè)定，程序?yàn)椋?5 °C 5 s，升高至95 °C變性DNA產(chǎn)物。

利用絕對(duì)定量的方法計(jì)算樣品目的基因拷貝值，以內(nèi)參基因16S rRNA校正PCR模板的拷貝數(shù)。研究中的基因擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

1.8 信息素的測(cè)定方法

按照1.1中方法制備接合菌液2份，其中1份加入終濃度為1 nmol·L-1的雙酚A，另1份加入等體積的雙蒸水作為對(duì)照。接合菌液放置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，迅速取出并放置于冰上20 min。離心機(jī)在12 857g、4 ℃條件下離心10 min，保留上清液，然后用0.22 μm孔徑的一次性針頭式濾器(SLGP033RB，Millipore公司，美國)過濾上清。取800 μL過濾后的上清液加入100 μL乙腈(純度≥99.9%，上海麥克林生化科技有限公司，中國)和100 μL氫氧化銨(純度≥25%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中國)，室溫1 400 r·min-1混勻15 min后，在21 ℃、20 000g條件下離心15 min。取600 μL上清液與600 μL 10%氫氧化銨水溶液(V∶V)混合，短暫離心后使用C18固相萃取柱(廣州翔博生物科技有限公司，中國)進(jìn)行萃取。首先分別將5 mL乙腈和5 mL水通過固相萃取柱，使其活化。然后將1 mL樣品通過固相萃取柱，依次用5 mL 5%乙腈水溶液(V∶V)、0.75 mL和0.5 mL 30%乙腈水溶液(V∶V)進(jìn)行洗脫，收集第2次和第3次洗脫樣品在液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(H CLASS_XEVO TQ-S micro，Waters公司，美國)上進(jìn)行檢測(cè)。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

圖1 不同基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve corresponding to the log of the copy number of each primer gene and cycle threshold

超高效液相條件：C18 (1.7 μm，2.1 mm×50 mm，Waters公司，美國)色譜柱，流動(dòng)相：乙腈(A)，0.1%甲酸(純度≥99.5%，上海麥克林生化科技有限公司，中國)、5 mmol·L-1乙酸銨的水溶液(B)。體積流量0.3 mL·min-1，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。梯度洗脫程序：0～0.5 min，96%A；0.5～1.5 min，40%A；1.5～2.5 min，40%A；2.5～3 min，96%A；3～5 min，96%A。

質(zhì)譜條件：選擇ESI正離子模式，其余條件如表2所示。

表2 質(zhì)譜條件參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并利用SPSS 26.0軟件對(duì)多因素影響接合子數(shù)量、測(cè)定ROS水平的相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄水平和信息素含量等相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05被認(rèn)為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 雙酚A濃度對(duì)糞腸球菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響

雙酚A濃度對(duì)糞腸球菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響如圖2所示。供體菌和受體菌初始濃度均為1×108CFU·mL-1，接合轉(zhuǎn)移4 h條件下，自然狀態(tài)下形成接合子數(shù)量約為6.61×105CFU·mL-1(Control組)。同時(shí)在1.1×10-2g·L-1的DMSO作用下，接合子數(shù)量為6.27×105CFU·mL-1，與空白對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(one-way ANOVA，P>0.05)，說明溶劑DMSO對(duì)pCF10質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移無影響。接合體系在1 nmol·L-1雙酚A作用4 h后接合子數(shù)量約為1.37×106CFU·mL-1，可達(dá)對(duì)照組的2倍左右。在1×10-1nmol·L-1和1×10-2nmol·L-1的雙酚A作用下，接合體系中接合子的數(shù)量也有明顯的提升(1.12～1.19×106CFU·mL-1)。1、10-1和10-2nmol·L-1的雙酚A顯著地提高了接合子的數(shù)量，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異(one-way ANOVA，P<0.05)。而在10 nmol·L-1和100 nmol·L-1濃度的雙酚A作用下，接合子數(shù)量在6.11×105CFU·mL-1，與對(duì)照組相比無明顯差異(one-way ANOVA，P>0.05)。這一結(jié)果表明，在1×10-2～1 nmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，雙酚A對(duì)pCF10質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，并且這一影響與雙酚A濃度相關(guān)。

圖2 雙酚A(BPA)濃度對(duì)接合轉(zhuǎn)移的影響(*P<0.05、**P<0.01)注：DMSO表示該組為加入終濃度為1.1×10-2 g·L-1的二甲基亞砜(DMSO)的對(duì)照組。Fig. 2 Effect of bisphenol A (BPA) concentration on conjugative transfer (*P<0.05, **P<0.01)Note: DMSO indicates that the group added with a final concentration of 1.1×10-2 g·L-1 of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a control.

為了進(jìn)一步確定雙酚A能夠促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移體系中耐藥基因tetM豐度的增加，利用熒光定量PCR的方法測(cè)定了tetM基因在接合轉(zhuǎn)移前后的豐度。如圖3所示，在接合開始時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的tetM基因相對(duì)豐度均在5×10-3左右。當(dāng)接合時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，1 nmol·L-1雙酚A作用后的接合體系中tetM基因相對(duì)豐度可達(dá)1.2×10-1左右，而自然狀態(tài)下發(fā)生接合轉(zhuǎn)移的體系中tetM基因相對(duì)豐度僅為8×10-2左右，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異(t-test，P<0.01)。在雙酚A作用下，耐藥基因tetM的相對(duì)基因豐度可提高1.5倍。這一結(jié)果表明，雙酚A可以通過接合轉(zhuǎn)移的方式使耐藥基因的相對(duì)豐度顯著提高。

圖3 雙酚A作用下，tetM基因相對(duì)豐度的變化(**P<0.01)Fig. 3 Changes in the relative abundance of tetM under the effect of BPA (**P<0.01)

2.2 雙酚A作用時(shí)間對(duì)糞腸球菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響

雙酚A作用時(shí)間對(duì)糞腸球菌耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響如圖4所示。在自然狀態(tài)下(Control組)，pCF10質(zhì)粒的接合子數(shù)量在接合時(shí)間0～4 h內(nèi)隨作用時(shí)間的延長而增加，在接合4 h時(shí)接合子數(shù)量在9.3×105CFU·mL-1左右，達(dá)到最高點(diǎn)。在接合4 h后，接合子數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。同時(shí)在1.1×10-2g·L-1的DMSO作用下，在作用時(shí)間1～8 h內(nèi)接合子數(shù)量與空白對(duì)照組相比經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無明顯差異(one-way ANOVA，P>0.05)，說明溶劑DMSO對(duì)pCF10質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移無顯著影響。在1 nmol·L-1雙酚A作用于接合體系4～6 h后，接合子數(shù)量相較于空白對(duì)照組有明顯的增加，其中雙酚A作用4 h后，接合子數(shù)量可由8.6×105CFU·mL-1升至1.5×106CFU·mL-1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異(one-way ANOVA，P<0.05)。結(jié)果表明，在雙酚A作用下，接合子數(shù)量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)與自然狀態(tài)下類似，均呈現(xiàn)出隨著作用時(shí)間的延長，接合子數(shù)量先增加后降低的規(guī)律。接合時(shí)間在4～6 h時(shí)，雙酚A對(duì)pCF10質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，且在接合4 h時(shí)，雙酚A對(duì)接合轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用最明顯。

通過進(jìn)一步觀察供受體菌的生長情況可以發(fā)現(xiàn)(圖5)，接合轉(zhuǎn)移過程中雙酚A作用下的供受體菌數(shù)量與對(duì)照組相比均無明顯變化。這一結(jié)果表明，雙酚A不是通過影響供受體菌數(shù)量從而影響接合子數(shù)量的。

圖4 雙酚A作用下，接合時(shí)間對(duì)接合轉(zhuǎn)移的影響(**P<0.01)Fig. 4 Effect of treatment time on conjugative transfer in the presence of BPA (**P<0.01)

2.3 雙酚A對(duì)細(xì)菌氧化應(yīng)激的影響

許多研究表明，ROS的產(chǎn)生會(huì)促進(jìn)RP4、RK2等質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)接[12, 29]，但是雙酚A是否也是通過促使腸球菌產(chǎn)生ROS進(jìn)而影響pCF10質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移還未可知。本文研究了雙酚A對(duì)糞腸球菌ROS產(chǎn)生的影響及ROS的產(chǎn)生對(duì)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響。研究結(jié)果表明，在作用4 h后雙酚A雖然能夠顯著促進(jìn)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，但在該時(shí)刻供、受體菌和接合體系細(xì)菌細(xì)胞中的ROS含量與對(duì)照組相比均無明顯差異(圖6(a)，one-way ANOVA，P>0.05)，說明雙酚A促進(jìn)pCF10接合轉(zhuǎn)移過程并未影響細(xì)菌的ROS的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步確證雙酚A對(duì)本接合轉(zhuǎn)移體系中ROS產(chǎn)生的影響，我們將其作用時(shí)間延長至24 h，發(fā)現(xiàn)其作用下ROS水平與對(duì)照組比較有了明顯的升高(圖6(b))，但是我們使用ROS陽性對(duì)照Rosup處理接合細(xì)菌4 h后進(jìn)行接合子計(jì)數(shù)(圖6(c))后發(fā)現(xiàn)，Rosup處理組的接合子數(shù)量相較于對(duì)照組并無明顯差異(約在5×105CFU·mL-1)。這些結(jié)果表明，雙酚A促進(jìn)糞腸球菌中的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移不是通過影響細(xì)菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激這一途徑實(shí)現(xiàn)的。

圖5 雙酚A對(duì)接合轉(zhuǎn)移過程中供體菌的影響(a)和雙酚A對(duì)接合轉(zhuǎn)移過程中受體菌的影響(b)Fig. 5 Effect of BPA on donor bacteria during conjugative transfer (a) and effect of BPA on receptor bacteria during conjugative transfer (b)

圖6 雙酚A對(duì)活性氧(ROS)水平及接合轉(zhuǎn)移的影響注：(a)接合4 h后受體菌、供體菌及接合體系中的ROS水平；(b)接合24 h后接合體系中的ROS水平；(c)雙酚A及ROS陽性對(duì)照Rosup對(duì)接合轉(zhuǎn)移的影響；**P<0.01。Fig. 6 Effect of BPA on reactive oxygen species (ROS) levels and conjugative transferNote: (a) ROS levels in recipient bacteria, donor bacteria, and conjugation after 4 h of conjugation initiation; (b) ROS levels in conjugation after 24 h of conjugation initiation; (c) Effect of BPA and ROS control Rosup on conjugative transfer; **P<0.01.

2.4 雙酚A對(duì)信息素編碼基因表達(dá)和信息素生成的影響

pCF10系統(tǒng)中，ccfA基因編碼正調(diào)控信息素cCF10[30]，prgQ基因編碼負(fù)調(diào)控信息素iCF10[26]，2種信息素互為拮抗作用，更高效地調(diào)控接合轉(zhuǎn)移過程。我們研究了雙酚A對(duì)調(diào)控信息素編碼基因ccfA和prgQ的mRNA表達(dá)的影響。在雙酚A的作用下，ccfA基因的表達(dá)量由對(duì)照組的3.5×10-3copies·(16S)-1升高至6×10-3copies·(16S)-1，prgQ基因的表達(dá)量由對(duì)照組的1.5×10-2copies·(16S)-1升高至2.5×10-2copies·(16S)-1，均具有顯著性差異(t-test,P<0.05)(圖7)。我們進(jìn)一步檢測(cè)了接合體系上清液中信息素cCF10的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在雙酚A作用下，接合體系上清液中信息素濃度由0.33 ng·mL-1提高至0.84 ng·mL-1，升高了2倍左右(圖8)。在雙酚A作用下，翻譯后水解形成成熟的信息素cCF10的濃度顯著升高，這也與ccfA基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高相對(duì)應(yīng)。雙酚A通過調(diào)控生成信息素基因的mRNA表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)信息素的生成可能是雙酚A促進(jìn)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。

圖7 雙酚A對(duì)信息素編碼基因表達(dá)的影響注：*P<0.05。Fig. 7 Effect of BPA on the expression of pheromone-encoded genesNote: *P<0.05.

圖8 雙酚A作用下，接合體系上清液中信息素含量的變化注：*P<0.05。Fig. 8 Changes in the pheromone concentration in the supernatant of the conjugative system under the effect of BPANote: *P<0.05.

3 討論(Discussion)

內(nèi)分泌干擾物雙酚A在環(huán)境中的污染問題一直廣受關(guān)注，其在自然水體中大量分布[31-32]，對(duì)人體健康構(gòu)成的嚴(yán)重威脅也不容小覷[21, 33-34]。尤其是雙酚A對(duì)生殖健康的影響已有不少研究報(bào)道[35-36]，但關(guān)于雙酚A對(duì)耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的影響和機(jī)制卻鮮有報(bào)道。糞腸球菌不但具有較強(qiáng)的天然耐藥性[37]，且極易被誘導(dǎo)而發(fā)生高效的耐藥基因水平轉(zhuǎn)移[38]。本文揭示了耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的新途徑，同時(shí)也提示我們關(guān)注環(huán)境污染物的生物效應(yīng)形式和機(jī)制，重新認(rèn)識(shí)其在環(huán)境中的作用和行為，對(duì)生態(tài)安全領(lǐng)域具有重要意義。

雙酚A對(duì)pCF10質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用且與雙酚A濃度相關(guān)(圖2)，即在一定濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)作用。當(dāng)雙酚A濃度在1×10-2～1 nmol·L-1的范圍內(nèi)時(shí)，雙酚A具有促進(jìn)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，且在1 nmol·L-1時(shí)促進(jìn)效果最強(qiáng)。雙酚A濃度影響細(xì)胞生理活動(dòng)的研究不勝枚舉，如雙酚A影響精原細(xì)胞增殖時(shí)，劑量-效應(yīng)曲線呈倒U型，當(dāng)雙酚A濃度超過特定范圍時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖的效應(yīng)顯著下降[39]。有研究報(bào)道，一些微生物可以通過活躍的化學(xué)外排或化學(xué)降解抵抗因雙酚A暴露濃度增加而升高的毒性[40]。在本研究中出現(xiàn)劑量-效應(yīng)曲線為倒U型的現(xiàn)象推測(cè)是由于高濃度雙酚A作用下，細(xì)菌的外排能力或降解能力已達(dá)到極限。過量的雙酚A對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒性，從而影響了細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移的能力。

細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性通常是通過可移動(dòng)的遺傳元件如接合質(zhì)?；蚪雍限D(zhuǎn)座子等獲得的，使接合轉(zhuǎn)移發(fā)生在病原菌或共生菌之間[41-42]。在pCF10質(zhì)粒中，四環(huán)素抗性基因tetM存在于接合轉(zhuǎn)座子Tn916中[43]。通過基因的水平轉(zhuǎn)移，四環(huán)素抗性基因可以隨轉(zhuǎn)座子擴(kuò)散到其他細(xì)菌中，使其也對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性。在雙酚A作用下，由糞腸球菌組成的接合體系中耐藥基因的相對(duì)豐度顯著提升(圖3)，意味著雙酚A能夠使體系中含有耐藥基因tetM的細(xì)菌與細(xì)菌總量的比例從8%提高到>1%。糞腸球菌作為廣泛分布于人體腸道內(nèi)，且易于在環(huán)境中存活的指示微生物，已被證明其存在與自然水體游泳者患胃腸疾病相關(guān)[44]。而每年全世界消費(fèi)雙酚A的體量也不容忽視，在自然水環(huán)境中，雙酚A含量一般在1 ng·L-1～1 μg·L-1的范圍內(nèi)[21, 23, 45]，與本研究中雙酚A影響耐藥基因轉(zhuǎn)移的濃度范圍基本重合。當(dāng)糞腸球菌與雙酚A在時(shí)間和空間上發(fā)生重疊，便極大地增加了耐藥基因擴(kuò)散的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重影響，也對(duì)生態(tài)安全構(gòu)成了極大的威脅。

雙酚A對(duì)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用與雙酚A作用下的接合時(shí)間相關(guān)(圖4)。在雙酚A作用下，接合時(shí)間為4 h時(shí)，接合子數(shù)量達(dá)到最高點(diǎn)。當(dāng)接合時(shí)間超過4 h后，接合子數(shù)量隨時(shí)間的延長逐漸下降。多肽信息素屬于革蘭氏陽性菌的群體感應(yīng)信號(hào)分子[46]，胞外的信號(hào)分子隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而累積，從而產(chǎn)生群感效應(yīng)以調(diào)節(jié)細(xì)菌的群體行為[47]。接合子數(shù)量在達(dá)到接合終點(diǎn)后隨時(shí)間推移而降低，我們分析該現(xiàn)象是由于群感效應(yīng)中細(xì)胞自身的程序性自殺機(jī)制激活了細(xì)胞死亡，接合子數(shù)量逐漸回歸初始水平。

細(xì)菌細(xì)胞中的ROS主要包括超氧陰離子自由基(O2·-)、·OH和H2O2[48]。當(dāng)ROS含量超過自身可以承載的水平時(shí)就會(huì)引起細(xì)菌的氧化應(yīng)激，從而損害細(xì)菌的各種生物大分子，例如核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等[49]。目前有研究證明了細(xì)菌耐藥性與ROS的產(chǎn)生存在一定相關(guān)性。研究者發(fā)現(xiàn)ROS可以造成細(xì)菌DNA的突變或篩選出抗氧化能力較強(qiáng)的菌株，進(jìn)而增加耐藥菌株產(chǎn)生的概率[50-51]。在細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究中，也有很多研究者認(rèn)為細(xì)菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激是其接合轉(zhuǎn)移升高的原因之一[12, 14]。因細(xì)菌中ROS主要在細(xì)胞膜上產(chǎn)生，過量的ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞膜蛋白造成影響，繼而改變其通透性，使得質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移增加[52-53]。大量實(shí)驗(yàn)證明，在RP4質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移體系中，多種影響因素如納米材料[12]、非營養(yǎng)性甜味劑[54]以及非阿片類止痛藥[55]等都可以通過產(chǎn)生ROS，誘導(dǎo)細(xì)菌的氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)質(zhì)粒在革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌中的接合轉(zhuǎn)移。本研究中雙酚A作用4 h時(shí)未引起糞腸球菌中ROS含量升高(圖6(a))，可能是由于其作為革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，雙酚A刺激在在短時(shí)間內(nèi)未能引起細(xì)菌細(xì)胞反應(yīng)。也有實(shí)驗(yàn)證明雙酚A作用24 h后可以刺激細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，引起氧化應(yīng)激[56]。本文通過實(shí)驗(yàn)證明雙酚A作用于接合體系24 h后可以引起細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)ROS含量的升高(圖6(b))，但由于接合轉(zhuǎn)移反應(yīng)較為迅速，還未達(dá)到產(chǎn)生較強(qiáng)ROS的時(shí)刻，接合轉(zhuǎn)移已經(jīng)完成。接下來通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，在產(chǎn)生大量ROS的Rosup作用下，接合轉(zhuǎn)移并未發(fā)生顯著提升(圖6(c))。故得出結(jié)論雙酚A促進(jìn)糞腸球菌中的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移不是通過影響細(xì)菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激這一途徑實(shí)現(xiàn)的。

本研究主要從雙酚A對(duì)信息素編碼基因的mRNA表達(dá)和信息素的生成等方面初步探討了雙酚A影響pCF10介導(dǎo)的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的機(jī)制。糞腸球菌OG1RF中ccfA基因編碼一種名為CcfA的脂蛋白前體，成熟的多肽信息素是由CcfA經(jīng)蛋白水解加工而成的[8]。為了防止信息素造成的自體誘導(dǎo)，供體細(xì)菌分泌抑制肽iCF10作為cCF10的競爭性抑制劑。抑制肽iCF10由pCF10質(zhì)粒上的prgQ基因編碼。雙酚A可以促進(jìn)編碼信息素cCF10的ccfA基因的表達(dá)(圖7(a))，同時(shí)誘發(fā)了接合體系中的prgQ基因高表達(dá)。通過測(cè)定雙酚A處理后接合體系上清液中信息素濃度顯著升高(圖8)，進(jìn)一步證明雙酚A可以通過促進(jìn)信息素編碼基因ccfA表達(dá)，繼而促進(jìn)信息素的生成，最終促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移的高頻發(fā)生。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了自然水體環(huán)境濃度下的雙酚A能夠促進(jìn)信息素調(diào)控質(zhì)粒pCF10介導(dǎo)的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移，并對(duì)雙酚A影響pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。目前關(guān)于雙酚A成為內(nèi)分泌干擾物的研究已有一些進(jìn)展，但多局限于臨床領(lǐng)域。而雙酚A作為環(huán)境雌激素類污染物在環(huán)境中的行為和影響抗生素抗性基因擴(kuò)散的機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究證明雙酚A除對(duì)人類健康造成直接影響外，還會(huì)影響環(huán)境中耐藥基因的豐度，使抗生素抗性基因擴(kuò)散形勢(shì)更為嚴(yán)峻。本研究將增強(qiáng)社會(huì)對(duì)環(huán)境雌激素污染物生物效應(yīng)的認(rèn)識(shí)和理解，填補(bǔ)雙酚A這一傳統(tǒng)環(huán)境污染物在生態(tài)安全領(lǐng)域的研究空缺。為人類與生態(tài)環(huán)境和諧共處提供理論基礎(chǔ)，或?qū)閷?shí)現(xiàn)對(duì)雙酚A和抗生素抗性基因傳播元件的監(jiān)測(cè)和控制這一最終目標(biāo)提供技術(shù)支持。本研究對(duì)雙酚A影響耐藥基因擴(kuò)散的機(jī)制進(jìn)行了初步的探索，但對(duì)于它的深層機(jī)制仍亟需進(jìn)一步研究。信息素調(diào)控質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移過程需要通過一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，如供、受體細(xì)菌間的粘附、質(zhì)粒的切割、組裝及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等過程。雙酚A是否對(duì)這些調(diào)控過程產(chǎn)生影響從而對(duì)質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移造成影響，還有待于我們進(jìn)一步研究。

通訊作者簡介：邱志剛(1979—)，男，博士，研究員，主要研究方向細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生、發(fā)展與控制。