納米二硫化鉬促進(jìn)糞腸球菌中信息素誘導(dǎo)質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移

周宏瑞，楊雨桐，楊曉波，王尚，薛斌，李辰宇，趙辰，張曦，諶志強(qiáng)，王景峰，邱志剛

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050

細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為人類健康的一大威脅，具有抗生素抗性的細(xì)菌引起的感染每年導(dǎo)致全球約70萬(wàn)人死亡，估計(jì)到2050年，每年有超過(guò)1 000萬(wàn)人死亡[1]。耐藥問(wèn)題之所以發(fā)展得如此迅速，主要原因之一是抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes, ARGs)可以通過(guò)水平轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)行傳播。水平轉(zhuǎn)移可以發(fā)生在任何環(huán)境中，特別是當(dāng)細(xì)菌密度較高時(shí)，例如，在土壤、污水處理廠以及人和動(dòng)物的腸道微生物群中[2-7]。水平轉(zhuǎn)移方式包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合轉(zhuǎn)移[8]，其中接合轉(zhuǎn)移是水平轉(zhuǎn)移的主要方式[9]。

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，由于糞腸球菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，糞腸球菌菌株越來(lái)越多地與醫(yī)院獲得性感染有關(guān)[10-12]。糞腸球菌在環(huán)境中分布也十分廣泛，養(yǎng)殖場(chǎng)廢水、生活污水、自然水源、土壤、飼料和糞便中都有分布[13]，其對(duì)多種抗菌藥物具有耐藥性，也容易被誘導(dǎo)產(chǎn)生獲得性耐藥[14]。糞腸球菌間的ARGs主要通過(guò)信息素誘導(dǎo)的接合質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)移傳播，典型的信息素響應(yīng)質(zhì)粒有pCF10、pAD1、pAM373和pMG2200，其中pCF10質(zhì)粒是最有代表性的一種[15]。其轉(zhuǎn)移機(jī)制是由受體菌分泌一種cCF10信息素，供體菌識(shí)別到信息素后開始啟動(dòng)質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移過(guò)程[16]。pCF10質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移頻率可以達(dá)到10-2～10-1[17]，主要發(fā)生在可引起嚴(yán)重院內(nèi)感染的腸球菌間，能夠使腸球菌獲得對(duì)被稱為最后一種抗生素的萬(wàn)古霉素的耐藥性[15]。糞腸球菌耐藥性的傳播不僅給臨床中細(xì)菌感染的治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，也嚴(yán)重影響到生態(tài)安全。經(jīng)過(guò)抗生素治療的動(dòng)物的污水和糞便污染水源，可導(dǎo)致ARGs傳播，可以傳播到水產(chǎn)生物，并通過(guò)食物鏈逐級(jí)傳遞，最終影響整個(gè)生態(tài)環(huán)境[18]。

水環(huán)境是ARGs的巨大儲(chǔ)存庫(kù)[19]，在水環(huán)境中還會(huì)有一些納米材料[20]。已有研究表明納米材料可以促進(jìn)ARGs的傳播[21]。一些新興納米材料的生物效應(yīng)和生態(tài)安全性有待深入研究。納米二硫化鉬(molybdenum disulfide, MoS2)是一種新興的過(guò)渡金屬二硫化物，由1層鉬和2層硫組成，是類似石墨烯的二維材料。因其具有高的比表面積、優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換性能、易于功能化等優(yōu)點(diǎn)，已在催化、傳感、載藥和疾病治療等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[22]。隨著納米MoS2應(yīng)用的增多，其在環(huán)境中的殘留水平可能增加，與其他納米粒子一樣，納米MoS2的積累對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成了威脅。本文研究了納米MoS2對(duì)糞腸球菌中信息素誘導(dǎo)的耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響，并初步研究了其機(jī)制。為研究納米MoS2的生物效應(yīng)及其安全應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)中用到的糞腸球菌OG1RF[23](ATCC 47077，NCBI:txid474186)購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，信息素誘導(dǎo)質(zhì)粒pCF10由美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)Gary Dunny教授惠贈(zèng)。受體菌為糞腸球菌OG1RS，由糞腸球菌OG1RF經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)獲得鏈霉素抗性，并命名為OG1RS；供體菌為糞腸球菌OG1RF(pCF10)，其攜帶信息素調(diào)控質(zhì)粒pCF10[24]，該質(zhì)粒編碼四環(huán)素抗性基因。供體菌、受體菌均利用BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，并添加相應(yīng)的抗生素(受體菌：3 000 μg·mL-1鏈霉素(S8290，Solarbio)，供體菌：10 μg·mL-1四環(huán)素(A500731，Sangon Biotech))。菌液在37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h后，將菌液按1∶10的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的BHI培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中4～5 h生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后備用。

1.2 接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

菌液在4 ℃條件下6 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min(Eppendorf Centrifuge 5804R，Eppendorf，德國(guó))，棄上清后用含2 mmol·L-1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)重懸菌液并洗滌3次，最后用LB液體培養(yǎng)基重懸菌液并調(diào)整菌液濃度至1.5×108CFU·mL-1。供、受體菌按1∶1的比例混合后加入納米MoS2懸液(NM000310，Solarbio)，使其終濃度為1、5、10、25、50、100和200 mg·L-1，并用振蕩器振蕩混勻，每組3個(gè)重復(fù)。將接合菌液放入37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2 h后取100 μL菌液利用含2 mmol·L-1EDTA的PBS溶液梯度稀釋，取合適稀釋梯度的10 μL菌液分別滴在含有10 μg·mL-1四環(huán)素和3 000 μg·mL-1鏈霉素的雙抗BHI瓊脂培養(yǎng)基上篩選接合子，含有3 000 μg·mL-1鏈霉素BHI瓊脂培養(yǎng)基上篩選受體菌、含有10 μg·mL-1四環(huán)素的BHI瓊脂培養(yǎng)基上篩選供體菌，37 ℃倒置培養(yǎng)36 h左右計(jì)數(shù)形成的單菌落，并計(jì)算接合頻率(接合頻率=接合子數(shù)量/受體菌數(shù)量)。

1.3 不同因素對(duì)接合轉(zhuǎn)移的影響

分別研究不同時(shí)間、不同溫度和不同pH條件下的接合轉(zhuǎn)移規(guī)律。將納米MoS2加入接合體系中，使終濃度為25 mg·L-1，在培養(yǎng)箱放置不同時(shí)刻然后對(duì)接合子計(jì)數(shù)，計(jì)算接合頻率；將接合體系在不同溫度下(16、26、30和37 ℃)接合2 h，計(jì)算接合頻率；用NaOH溶液和HCl溶液調(diào)節(jié)接合體系的初始pH，使pH分別為6、7和8，在37 ℃條件下接合2 h，計(jì)算接合頻率。

1.4 納米MoS2作用后活性氧水平檢測(cè)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液用PBS洗滌2次，再用液體LB培養(yǎng)基重懸，并稀釋至108CFU·mL-1。裝載DCFH-DA探針(CA1410，Solarbio)終濃度為2 μmol·mL-1，37 ℃放置20 min后用PBS洗掉多余探針，加入納米MoS2使終濃度為25 mg·L-1，作用2 h，用酶標(biāo)儀(Molecular Devices，SpectraMax M5，美國(guó))檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm)。

1.5 納米MoS2作用后細(xì)胞膜通透性檢測(cè)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液用PBS洗滌2次，再用液體LB培養(yǎng)基重懸，并稀釋至108CFU·mL-1。供、受體菌按1∶1的比例混合后加入納米MoS2懸液，使終濃度為25 mg·L-1(空白對(duì)照組加入等量雙蒸水)，作用2 h后，稀釋至107CFU·mL-1。取1 mL加入5 μL的PI染液(E607306，Sangon Biotech)，37 ℃培養(yǎng)箱避光放置20 min，用流式細(xì)胞儀(Cell Sorter S3e，BioRad，美國(guó))檢測(cè)。

1.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)定量基因表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組接合2 h后收集菌體用RNA提取試劑盒(DP430，天根)提取總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR116-02，天根)將RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA作為模板，用PowerUp SYBR Master Mix(A25742，Thermo)在CFX96 BioRad qPCR系統(tǒng)(CFX96 Optics Module，BioRad，新加坡)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)，定量基因的表達(dá)。qPCR反應(yīng)體系如下：10 μL PowerUp SYBR Master Mix，7 μL ddH2O，上下游引物各1 μL，模板1 μL；qPCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，40個(gè)循環(huán)的95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸10 s，72 ℃終止10 min，熔解曲線65 ℃升至95 ℃。qPCR中所有引物使用DNAStar 7.1設(shè)計(jì)，由上海生工合成，序列如表1所示。

實(shí)驗(yàn)中基因的表達(dá)量由絕對(duì)定量的方法計(jì)算獲得，并利用16SRNA作為內(nèi)參基因修正體系中的細(xì)胞含量。相關(guān)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

1.7 掃描電鏡觀察細(xì)菌形態(tài)

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組接合2 h后在4 ℃條件下6 000 r·min-1離心5 min，棄上清后加入2.5%戊二醛(PH9003，Phygene)在4 ℃條件下固定48 h，PBS離心洗滌3次，依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%無(wú)水乙醇梯度脫水，其中100%無(wú)水乙醇脫水2次。每次脫水10 min，然后6 000 r·min-1下離心3 min，最后置于冷凍干燥機(jī)(FDU-1200，EYELA，上海，中國(guó))中凍干，用掃描電鏡(Sigma300，ZEISS，德國(guó))觀察并用能譜儀(Xplore 30，OXFORD，英國(guó))進(jìn)行元素掃描分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 納米MoS2濃度對(duì)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響

接合2 h后，空白對(duì)照組的接合頻率為3.7×10-3，與空白對(duì)照組比較，經(jīng)過(guò)納米MoS2處理后接合頻率都有所提高，最高可以達(dá)到2.4×10-2。納米MoS2的作用具有濃度效應(yīng)，促進(jìn)效果呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢(shì)，其中25 mg·L-1納米MoS2的促進(jìn)效果最明顯，接合頻率可以達(dá)到空白對(duì)照組的5倍～8倍(圖2(a))。但對(duì)供、受體菌的生長(zhǎng)無(wú)影響(圖2(b))，說(shuō)明納米MoS2只影響了接合轉(zhuǎn)移過(guò)程。

2.2 納米MoS2作用時(shí)間對(duì)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響

將納米MoS2加入接合體系中，使終濃度為25 mg·L-1，對(duì)不同時(shí)刻的接合子計(jì)數(shù)，計(jì)算接合頻率。空白對(duì)照組在4 h到達(dá)接合終點(diǎn)，接合頻率最高，達(dá)到1.4×10-2。納米MoS2作用后與對(duì)照組比較，1～8 h的接合頻率都有所提高，最高可以達(dá)到3.7×10-2，并且將接合終點(diǎn)由4 h提前到2 h。綜合來(lái)看納米MoS2在不同時(shí)刻的促進(jìn)效果不同，其中2 h時(shí)促進(jìn)效果最明顯，可以將接合頻率提高6倍(圖3)。

2.3 納米MoS2作用下溫度對(duì)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響

將接合體系在不同溫度下接合2 h，計(jì)算接合頻率。對(duì)照組在16 ℃的接合頻率較低為7×10-6，26 ℃接合頻率提高到1.3×10-3，26～37 ℃溫度升高后接合頻率基本不變。納米MoS2作用后隨著溫度升高接合頻率增加，37 ℃接合頻率最高，達(dá)到4×10-3。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，37 ℃時(shí)促進(jìn)效果最顯(圖4)。

2.4 納米MoS2作用下pH對(duì)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響

調(diào)節(jié)接合體系的pH，在37 ℃條件下接合2 h，pH=6～8范圍內(nèi)，隨著pH的升高，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的接合頻率都增加，分別為2.3×10-3和3.7×10-3。pH為8.0時(shí)促進(jìn)效果最明顯(圖5)。

2.5 納米MoS2對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移需要供體菌和受體菌細(xì)胞膜間的接觸融合，這一過(guò)程與細(xì)胞膜狀態(tài)直接相關(guān)。為了確定納米MoS2影響接合轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對(duì)納米MoS2處理后的細(xì)胞膜通透性進(jìn)行了測(cè)定。PI染液是一種細(xì)胞核染色試劑，不能通過(guò)完整的細(xì)胞膜，但可以通過(guò)破損的細(xì)胞膜對(duì)核染色。通過(guò)檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的熒光細(xì)胞的比例，可以反映細(xì)胞膜通透性的變化。經(jīng)檢測(cè)，空白對(duì)照組中熒光細(xì)胞比例為0.55%；MoS2作用2 h后熒光細(xì)胞比例為0.66%(圖6)。熒光細(xì)胞比例只發(fā)生微小變化，二者沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明納米MoS2沒(méi)有對(duì)細(xì)胞膜通透性產(chǎn)生明顯影響。

2.6 納米MoS2對(duì)細(xì)胞活性氧水平的影響

納米材料的小粒徑及高生物活性，可以使細(xì)菌產(chǎn)生羥基自由基(·OH)，進(jìn)而產(chǎn)生活性氧(ROS)反應(yīng)，利用DCFH-DA探針可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。DCFH-DA探針進(jìn)入細(xì)胞后，在活性氧存在的條件下，被氧化生成熒光物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度，可以反映細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。經(jīng)檢測(cè)，MoS2作用2 h后，供體菌和受體菌中熒光強(qiáng)度值都在800左右(圖7)，說(shuō)明納米MoS2沒(méi)有對(duì)細(xì)胞活性氧水平產(chǎn)生明顯影響。

2.7 納米MoS2對(duì)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移調(diào)控基因表達(dá)的影響

納米MoS2可以促進(jìn)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生，濃度為25 mg·L-1的納米MoS2，在37 ℃、pH=8.0的條件下作用于接合體系2 h后pCF10質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移頻率可升高5倍～8倍。因?yàn)榻雍限D(zhuǎn)移過(guò)程受到一系列基因的調(diào)控，用熒光定量PCR的方法對(duì)調(diào)控基因的表達(dá)情況進(jìn)行定量。ccfA和prgQ分別是編碼信息素cCF10和iCF10的基因，prgA和prgB是編碼黏附蛋白的基因，prgZ是負(fù)責(zé)信息素導(dǎo)入的基因，prgY是供體自誘導(dǎo)的調(diào)控基因。25 mg·L-1的納米MoS2作用于接合體系2 h后，與空白對(duì)照組比較，這些基因的表達(dá)都無(wú)明顯變化(圖8)，說(shuō)明納米MoS2不會(huì)影響基因的表達(dá)，這是因?yàn)榧{米MoS2是惰性材料，有良好的生物相容性。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖1 qPCR實(shí)驗(yàn)中基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線注：CT值表示擴(kuò)增程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(cycle threshold)。Fig. 1 Standard curves of genes in qPCR experimentsNote: CT represents the corresponding amplification cycle threshold when the fluorescence signal of the amplification product reaches the set fluorescence threshold during the amplification process.

圖2 納米MoS2對(duì)接合轉(zhuǎn)移的影響注：(a)不同濃度納米MoS2對(duì)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響規(guī)律；(b)納米MoS2對(duì)供體菌和受體菌的影響；MoS2表示二硫化鉬，*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 2 Effect of nano-MoS2 on conjugation transferNote: (a) Effects of different concentrations of nano-MoS2 on pCF10 plasmid conjugation and transfer; (b) Effects of nano-MoS2 on donor bacteria and recipient bacteria; MoS2 stands for molybdenum disulfide, *represents P<0.05, **represents P<0.01.

圖3 納米MoS2作用時(shí)間對(duì)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響注：*表示P<0.05。Fig. 3 Effect of MoS2 action time on pCF10 plasmid conjugation transferNote: *represents P<0.05.

圖4 納米MoS2作用下溫度對(duì)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 4 Effect of temperature on pCF10 plasmids conjugation transfer under nano-MoS2Note: *represents P<0.05, **represents P<0.01.

圖5 納米MoS2作用下pH對(duì)pCF10質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 5 Effect of pH on pCF10 plasmids conjugation transfer under nano-MoS2Note: *represents P<0.05, **represents P<0.01.

圖6 納米MoS2對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響Fig. 6 Effect of nano-MoS2 on cell membrane permeability

圖7 納米MoS2對(duì)細(xì)胞活性氧水平的影響Fig. 7 Effect of nano-MoS2 on the level of reactive oxygen species in cells

2.8 納米MoS2促進(jìn)細(xì)菌聚集

細(xì)菌聚集是接合轉(zhuǎn)移發(fā)生的重要前提，糞腸球菌自身的黏附蛋白可以促進(jìn)細(xì)菌的黏附和聚集，但納米MoS2作用后并沒(méi)有使黏附蛋白編碼基因上調(diào)。通過(guò)掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，納米MoS2加入到接合體系中會(huì)附著在細(xì)菌表面(圖9)，能譜儀元素分析的結(jié)果也顯示在團(tuán)聚的細(xì)菌表面有鉬(molybdenum, Mo)元素和硫(sulfur, S)元素分布(圖10)。因?yàn)榧{米MoS2本身具有吸附性能，而且MoS2是片層狀的結(jié)構(gòu)，不容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，這使得納米MoS2會(huì)吸附在細(xì)菌表面。與空白對(duì)照組比較，表面吸附了納米MoS2的細(xì)菌會(huì)變得更加聚集(圖9)，進(jìn)而促進(jìn)了接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生，使接合頻率提高。

圖8 納米MoS2對(duì)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移調(diào)控基因表達(dá)的影響注：(a) 納米MoS2對(duì)編碼cCF10信息素的ccfA基因的影響；(b) 納米MoS2對(duì)編碼iCF10信息素的prgQ基因的影響；(c) 納米MoS2對(duì)編碼黏附蛋白的prgA基因的影響；(d) 納米MoS2對(duì)編碼黏附蛋白的prgB基因的影響；(e) 納米MoS2對(duì)供體自誘導(dǎo)調(diào)控基因prgY的影響；(f) 納米MoS2對(duì)負(fù)責(zé)信息素導(dǎo)入的prgZ基因的影響。Fig. 8 Effect of nano-MoS2 on gene expression of plasmid conjugation transferNote: (a) Effect of nano-MoS2 on ccfA gene encoding cCF10 pheromone; (b) Effect of nano-MoS2 on prgQ gene encoding iCF10 pheromone; (c) Effect of nano-MoS2 on prgA gene encoding adhesive protein; (d) Effect of nano-MoS2 on prgB gene encoding adhesive protein; (e) Effect of nano-MoS2 on donor self-induced regulatory gene prgY; (f) Effect of nano-MoS2 on prgZ gene responsible for pheromone import.

3 討論(Discussion)

糞腸球菌是一種通常生活在人類和其他動(dòng)物胃腸道中的細(xì)菌，也會(huì)作為益生菌添加到飼料中[25]。由于糞便污染和飼料浪費(fèi)，最終會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中糞腸球菌的數(shù)量增加。同時(shí)革蘭氏陽(yáng)性菌中的腸球菌、鏈球菌和葡萄球菌是引起醫(yī)院感染最常見的病原體，在公共衛(wèi)生方面需要特別關(guān)注致病性革蘭氏陽(yáng)性菌中耐藥性的傳播。例如萬(wàn)古霉素的耐藥性，這在腸球菌中很常見，雖然腸球菌感染一般不會(huì)危及生命，但萬(wàn)古霉素耐藥基因一旦傳播給金黃色葡萄球菌等細(xì)菌就會(huì)導(dǎo)致致命疾病[26]。臨床上腸球菌已成為引起醫(yī)院感染的第二大致病菌[27]，并可以通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方式傳播ARGs[16]，使其對(duì)人類健康和環(huán)境安全的風(fēng)險(xiǎn)日益增加。然而，目前人們往往關(guān)注于革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌中耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移研究，而忽視了革蘭氏陽(yáng)性菌中耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移。因此本研究中建立了革蘭氏陽(yáng)性菌糞腸球菌中pCF10質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移模型。

圖10 納米MoS2附著在細(xì)菌表面 注：(a) SEM圖像；(b) Mo元素分布；(c) S元素分布；Mo表示鉬元素，S表示硫元素。Fig. 10 Nano-MoS2 attached to the surface of bacteria Note: (a) SEM images; (b) Distribution of Mo element; (c) Distribution of S element; Mo stands for molybdenum element, and S stands for sulfur element.

pCF10質(zhì)粒是信息素誘導(dǎo)質(zhì)粒，接合轉(zhuǎn)移過(guò)程受到信息素的調(diào)節(jié)[16]，對(duì)編碼信息素的ccfA和prgQ基因，以及與信息素相關(guān)的prgY和prgZ基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)納米MoS2并沒(méi)有對(duì)這些基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，說(shuō)明納米MoS2沒(méi)有影響信息素的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運(yùn)。另外黏附蛋白在pCF10質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，它使供體菌與受體菌可以緊密地結(jié)合在一起。對(duì)編碼黏附蛋白的prgA和prgB基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)納米MoS2同樣沒(méi)有對(duì)這些基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。

一些納米材料會(huì)通過(guò)影響活性氧系統(tǒng)和改變細(xì)胞膜的通透性影響質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。例如納米氧化鋁可以使革蘭氏陰性菌中羥基自由基的生成增加，同時(shí)細(xì)菌的總抗氧化能力、過(guò)氧化氫酶活性、超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽還原酶活性也隨著納米氧化鋁水平的升高而升高。另外還會(huì)破化細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞[21]。對(duì)本實(shí)驗(yàn)中納米MoS2作用后糞腸球菌的活性氧水平和細(xì)胞膜的通透性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)納米MoS2對(duì)活性氧系統(tǒng)和細(xì)胞膜的通透性均沒(méi)有影響，這一結(jié)果與基因表達(dá)的結(jié)果一致。這可能是由于糞腸球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁較厚，納米材料不易進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，另外納米MoS2是片層狀的二維結(jié)構(gòu)，比納米顆粒更難進(jìn)入細(xì)胞；納米MoS2還具有良好的生物相容性，這些性狀使得納米MoS2不會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)和細(xì)菌結(jié)構(gòu)，因此分子水平和細(xì)胞膜水平?jīng)]有發(fā)生變化。

掃描電鏡和能譜分析結(jié)果表明，納米MoS2會(huì)黏附在細(xì)菌表面，促進(jìn)細(xì)菌聚集，為細(xì)菌之間的接合轉(zhuǎn)移提供良好的條件，最終導(dǎo)致接合轉(zhuǎn)移頻率增加。也有報(bào)道稱在轉(zhuǎn)化過(guò)程中細(xì)菌的黏附和運(yùn)動(dòng)會(huì)使細(xì)菌攝入外界DNA[28]，接合過(guò)程也是受體菌獲取受體菌之外的DNA，而且接合過(guò)程需要供體菌與受體菌接觸，然后通過(guò)Ⅳ型分泌系統(tǒng)將供體中的質(zhì)粒傳遞給受體[29]，所以細(xì)菌的聚集為接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生提供了很好的環(huán)境。納米MoS2正是因?yàn)榇龠M(jìn)了細(xì)菌聚集才導(dǎo)致接合轉(zhuǎn)移頻率增加。

作為一種類石墨烯材料，MoS2的規(guī)?；a(chǎn)和市場(chǎng)化發(fā)展迅速[30]?？赡軙?huì)有大量的MoS2從實(shí)驗(yàn)室中排出，此外，清潔產(chǎn)品和潤(rùn)滑劑的應(yīng)用會(huì)將數(shù)以噸計(jì)的納米MoS2釋放到環(huán)境中[31]，MoS2在環(huán)境中的釋放將對(duì)生物體和人類健康構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)[32]。雖然納米MoS2具有良好的生物相容性，但是較高的濃度會(huì)對(duì)生物體表現(xiàn)出顯著的毒性。目前關(guān)于納米MoS2的環(huán)境殘留濃度還未見報(bào)道，有一些關(guān)于納米MoS2生物毒性的研究發(fā)現(xiàn)：50 mg·L-1的MoS2對(duì)A549細(xì)胞活力的抑制率為25.6%[33]；>25 mg·L-1的MoS2納米片通過(guò)干擾細(xì)胞表面受體和mTOR途徑誘導(dǎo)LC3-GFP U87細(xì)胞自噬[34]；飼料中150 mg·kg-1MoS2可引起腸道炎癥，擾亂小鼠腸道氨基酸代謝和腸道微生物群落[31]。本研究通過(guò)研究納米MoS2對(duì)糞腸球菌中接合轉(zhuǎn)移的影響，進(jìn)一步完善了納米MoS2的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，為納米MoS2的應(yīng)用提供了更豐富的理論指導(dǎo)。

通訊作者簡(jiǎn)介：邱志剛(1979—)，男，博士，研究員，主要研究方向?yàn)榧{米材料生物安全性及細(xì)菌耐藥基因。