納米銀誘導細胞自噬的分子機制和生物效應

侯巧利，汪毅寧，趙曉旭，呂源財

1. 福州大學環(huán)境與資源學院，福州 350108 2. 莆田學院環(huán)境與生物工程學院，莆田 351100 3. 福建省新型污染物毒理效應與控制重點實驗室，莆田 351100 4. 生態(tài)環(huán)境及其信息圖譜福建省高等學校重點實驗室，莆田 351100

隨著納米技術的迅速發(fā)展，具有高效抗菌性能的納米銀(silver nanoparticles, AgNPs)在食品包裝、紡織品、化妝品和生物醫(yī)學等領域有著較為廣泛的應用[1-3]。然而大量研究表明，AgNPs能誘導細胞產生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，導致細胞引發(fā)線粒體損傷、DNA損傷乃至細胞凋亡[4-6]。隨著對AgNPs生物毒性的深入研究，越來越多的報道表明細胞的自噬過程可能在AgNPs誘導細胞毒性中扮演著重要角色[7-8]。

細胞自噬是指消化發(fā)生錯誤折疊的蛋白質、損傷的細胞器以及病原體等物質的一種細胞生理現(xiàn)象，能夠實現(xiàn)細胞自身的新陳代謝和抵抗外界因素的刺激[9]。細胞自噬在AgNPs誘導的毒性作用中，扮演著“雙刃劍”作用，細胞自噬可通過抑制細胞凋亡來促進AgNPs染毒細胞存活[8]，也可以促進AgNPs誘導的細胞凋亡[10]。深入了解AgNPs誘導的細胞自噬效應有助于其在醫(yī)藥領域的進一步應用，也能為全面評估AgNPs的納米毒性提供科學依據(jù)。本文通過綜述AgNPs誘導細胞自噬的潛在機制及其涉及的主要信號通路，分析AgNPs誘導細胞自噬的生物學效應，以期為全面認識AgNPs的生物安全性提供科學依據(jù)。

1 細胞自噬(Autophagy)

自噬現(xiàn)象廣泛存在于真核細胞中，是一種通過溶酶體在細胞內部降解功能失調的細胞組分的過程。自噬可以降解和消化受損、變性的細胞器、蛋白質與核酸等生物大分子，為細胞的再生和修復提供原料，實現(xiàn)細胞內物質的循環(huán)利用。自噬細胞通過自身自噬作用保護其避免凋亡或壞死稱為細胞保護性自噬(protective autophagy)；而對細胞生理產生不利影響的自噬過程稱為細胞破壞性自噬(destructive autophagy)[11-13]。常見的自噬類型有巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)以及分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy)3種。大分子物質主要通過巨自噬降解，此過程需要形成自噬體；而小分子物質直接被溶酶體吞噬降解，不需要自噬體參與；分子伴侶介導的自噬則需要依賴分子伴侶蛋白，使其被溶酶體膜上溶酶體膜蛋白1及2 (lysosomal membrane protein 1 and 2, LAMP1/2)識別，最后在溶酶體區(qū)室被降解[9]。

大量研究表明，AgNPs可以誘導細胞巨自噬[7-8,10]。細胞巨自噬形成的過程涉及自噬小體(autophagosome)的成核(nucleation)、延伸(elongation)、成熟(maturation)和降解(degradation)。在巨自噬早期階段，unc-51樣激酶(unc-51 like kinase 1, ULK1)復合物和Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(class Ⅲ phosphoinositide 3-kinase, PI3KC3)復合物負責自噬前體雙膜的形成。ULK1復合物與PI3KC3復合物結合能局部激活磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphoinositide 3-phosphate, PI3P)，誘導自噬前體膜上自噬相關蛋白9 (autophagy protein 9, ATG9)募集2個和自噬體膜延伸與自噬體形成的關鍵泛素樣系統(tǒng)，即ATG12系統(tǒng)以及微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3 (microtuble-associated protein Ⅰ light chain 3, LC3)系統(tǒng)。ATG12系統(tǒng)由ATG5/ATG12/ATG16L1組成，具有類E3泛素酶活性，能誘導轉錄因子EB (transcription factor EB, TFEB)與自噬體耦合，促進LC3驅動自噬體的生長，并調控自噬體與溶酶體結合，最終使微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3Ⅰ (microtuble-associated protein Ⅰ light chain 3Ⅰ, LC3-Ⅰ)轉化為微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3Ⅱ (microtuble-associated protein Ⅰ light chain 3Ⅱ, LC3-Ⅱ)[14-15](圖1)。

2 納米銀誘導細胞巨自噬的潛在機制(Potential mechanism of AgNPs-induced macroautophagy)

2.1 氧化應激反應

大量研究表明，AgNPs可通過誘導細胞氧化應激反應激活細胞巨自噬過程[16-18]。眾所周知，自噬發(fā)生過程中，LC3合成后立即在其羧基端被ATG4所剪切，生成胞質LC3-Ⅰ。同時，在自噬過程中，LC3-Ⅰ會被包括ATG7和ATG3在內的泛素蛋白酶體系所修飾，產生分子量為14 kD的LC3-Ⅱ，并定位到自噬小體中。LC3-Ⅱ的含量和發(fā)生自噬的程度成正比，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估計自噬水平的高低。Lee等[16]的研究表明，在小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3中，AgNPs顯著誘導ROS的產生，從而導致細胞溶酶體數(shù)量增加、囊泡出現(xiàn)、LC3-Ⅱ及選擇性自噬接頭蛋白P62表達水平上調等一系列反應。在小鼠原B淋巴細胞Ba/F3中觀察到了同樣的現(xiàn)象[17]。另外，一些報道指出，氧化應激反應導致的線粒體裂變也是AgNPs誘導細胞巨自噬可能的要因之一[18]。

圖1 細胞自噬過程注：ULK1表示unc-51樣激酶，F(xiàn)IP200表示黏著斑激酶家族相互作用蛋白200，ATG3/4/5/7/9/10/12/13/14/16/101分別表示自噬蛋白3/4/5/7/9/10/12/13/14/16/101，BECN1表示Beclin1蛋白，VPS15/34分別表示液泡蛋白分選15和34，PI3P表示磷脂酰肌醇3-磷酸，LC3表示微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3，LC3-Ⅰ表示微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3Ⅰ，LC3-Ⅱ表示微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3Ⅱ。Fig. 1 The process of autophagyNote: ULK1 stands for unc51-like kinase 1; FIP200 stands for focal adhesion kinase family interacting protein of 200; ATG3/4/5/7/9/10/12/13/14/16/101 stands for autophagy protein 3/4/5/7/9/10/12/13/14/16/101; BECN1 stands for Beclin1 protein; VPS15/34 stands for vacuolar protein sorting 15 and 34; PI3P stands for phosphoinositide 3-phosphate; LC3 stands for microtuble-associated protein Ⅰ light chain 3; LC3-Ⅰ stands for microtuble-associated protein Ⅰ light chain 3Ⅰ; LC3-Ⅱ stands for microtuble-associated protein Ⅰ light chain 3Ⅱ.

2.2 內質網應激反應

內質網應激反應能激活細胞保護性自噬。內質網是細胞中合成蛋白質、脂質以及儲存鈣離子(Ca2+)的主要場所[19]。當內質網出現(xiàn)缺氧、Ca2+耗竭以及蛋白質錯誤折疊等情況時，即可能引發(fā)細胞發(fā)生內質網應激反應。研究表明AgNPs處理人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y后，細胞內Ca2+的穩(wěn)態(tài)被破壞引起內質網應激反應激活了自噬過程[20]。

2.3 溶酶體功能損傷

溶酶體功能損傷可能是細胞自噬的另一原因。溶酶體在細胞自噬過程中負責與自噬小體融合并在溶酶體區(qū)室組織蛋白酶的作用下促進自噬溶酶體降解。AgNPs染毒人胚胎腎細胞HEK293T、人腎癌細胞A498和人前列腺癌細胞PC3后，細胞內ROS水平沒有顯著變化，但依然檢測到LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值升高以及ATG3、ATG5、ATG6等自噬蛋白的表達上調，說明在不引起氧化應激反應時，AgNPs依然可以誘導細胞自噬過程。其主要原因是AgNPs暴露引起了細胞內缺氧狀態(tài)，導致溶酶體區(qū)室的組織蛋白酶D活性以及維持溶酶體功能的相關基因(csta、cstd、clcn7和mcoln)受到抑制[8,21]。

3 納米銀誘導細胞自噬涉及的主要信號通路(The main signaling pathways involved in AgNPs-induced macroautophagy)

與細胞巨自噬相關的一個核心蛋白是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapamycin target protein, mTOR)。mTOR被認為是細胞的營養(yǎng)感受器，是一種分子大小為289 kD的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[22]。mTOR的磷酸化對細胞自噬過程起著負反饋調節(jié)作用。通常，mTOR位于溶酶體膜上，當細胞處于正常狀態(tài)時，細胞質中的核轉錄因子TFEB被mTOR磷酸化，誘導mTOR激活[23]。反之，當細胞處于異常狀態(tài)時，TFEB可從胞質轉移到細胞核，引起腺苷磷酸依賴性蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)、腫瘤抑制蛋白(tumor suppressor P53, P53)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)等相關自噬蛋白過表達[24]，而mTOR則從溶酶體膜上被釋放出來，mTOR活性被抑制后能促進細胞自噬。

3.1 AMPK/mTOR信號通路

AMPK對維持細胞的能量穩(wěn)態(tài)有重要作用，常被稱為“細胞能量感受器”[25]。當細胞出現(xiàn)能量匱乏，即腺苷磷酸(adenosine monophosphate, AMP)或二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)相對升高時，AMPK將被激活[26]。AgNPs能破壞電子呼吸鏈導致ROS顯著增加，引起線粒體損傷，使三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)合成中斷[27]。長時間暴露在AgNPs的細胞還可能出現(xiàn)缺氧情況。Chen等[21]的研究表明，亞致死劑量AgNPs染毒PC3細胞24 h后導致細胞處于缺氧以及能量匱乏狀態(tài)、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加、mTOR及其下游靶點蛋白核糖體S6激酶(ribosomal protein S6 kinase, S6K)活性被抑制，AMPK下游靶點乙酰輔酶A羧化酶1 (acetyl CoA carboxylase 1, ACC1)的磷酸化呈劑量依賴性降低，說明AgNPs通過AMPK/mTOR途徑激活了細胞自噬。同樣，在低劑量AgNPs誘導腎細胞系自噬的過程中，AMPK/mTOR被證明是自噬啟動過程的關鍵信號通路[8]。在該過程中，細胞溶酶體結構與功能受到損傷，LAMP1表達減少、組織蛋白酶D活性下降。另外，AMPK的激活還受到細胞內Ca2+調節(jié)，當胞質Ca2+超負荷時，Ca2+/鈣調蛋白激酶可通過激活死亡相關蛋白激酶(death-associated protein kinase, DAPK)活化AMPK，從而引起細胞自噬[28]。最近，Li等[20]的研究表明，AgNPs導致SH-SY5Y細胞內質網中的Ca2+外流，引發(fā)內質網應激，從而激活了AMPK/mTOR自噬信號通路。

3.2 PI3K/AKT/mTOR信號通路

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)信號通路能夠調節(jié)細胞生長、細胞周期等相關蛋白基因的表達來調控細胞功能[29]。PI3K可以被表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors-1, IGF-1)等多種細胞因子激活。研究表明，AgNPs也可以通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導Ba/F3細胞、肝癌細胞HepG2和小鼠乳腺上皮細胞HC11等的自噬過程[17,30-31]。但是，PI3K選擇性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)預處理或沉默ATG5后，AgNPs染毒的Ba/F3細胞活力明顯上升[17]，而HC11細胞活力明顯下降[31]。顯示PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活對細胞存活的影響具有明顯的兩面性。

3.3 P53途徑

p53基因是腫瘤抑制基因，在DNA損傷時能夠激活p21阻滯細胞周期，具有修復受損DNA或誘導細胞凋亡的功能。一直以來，P53蛋白被認為與細胞凋亡等的聯(lián)系更為密切。然而最近的研究表明，P53也與細胞自噬高度相關[32]。細胞在正常狀態(tài)下，P53通過泛素降解途徑在細胞質中保持低水平從而抑制細胞自噬[33]，當受損DNA數(shù)量超過DNA修復能力時，P53能夠通過損傷調節(jié)自噬調控基因dram1等激活細胞自噬[34]。一項體內研究也證實，大鼠灌胃90 d AgNPs后，大鼠肝臟組織LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯升高，其主要涉及P53途徑[35]。

3.4 其他相關途徑

除上述信號通路外，MAPK家族中的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK)和磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)誘導的激酶1 (PTEN-induced kinase 1, PINK1)/Parkin等都被報道涉及細胞自噬過程[33,36-39]。通過生物合成的AgNPs可能經由JNK途徑促進人骨肉瘤細胞激活細胞保護性自噬[37]。另外，AgNPs處理宮頸癌HeLa細胞后所引起的自噬信號通路可能以獨立于mTOR的方式激活完整自噬過程[40]。迄今為止，溶酶體Ca2+信號傳導等經典自噬機制及其他更多轉錄因子或信號分子是否參與AgNPs誘導的細胞自噬調控仍然存在爭議，這些途徑有待進一步深入研究。

4 納米銀誘導細胞自噬的生物效應(Biological effects of AgNPs induced-autophagy)

線粒體、內質網和溶酶體是調節(jié)細胞生長代謝的關鍵細胞器，它們在細胞中相互調節(jié)、相互作用，對維持細胞正常的生理狀態(tài)具有重要意義。然而，AgNPs可以直接或間接地損傷線粒體、內質網和溶酶體，并通過一系列反應激活自噬。

自噬對細胞具有兩面性，一方面細胞自噬可以抵抗AgNPs誘導氧化應激反應帶來的負面影響。線粒體自噬能減輕AgNPs引起的ROS積累和線粒體DNA的釋放，減少細胞凋亡、減輕炎癥反應[41-42]。AMPK/mTOR信號通路對減輕細胞炎癥反應、抵抗細胞溶酶體損傷和能量缺乏起關鍵作用[31,43-44]。另外，細胞自噬也可以抵抗內質網應激反應促進細胞存活。AgNPs能誘導Ca2+在細胞質中過載，這對細胞的生長代謝往往具有不利影響，如引起細胞凋亡或壞死。細胞自噬在某種程度上能夠抵消因內質網應激引起的內質網擴張，這可能是細胞抵抗內質網應激促進細胞存活的關鍵[19-20,45-46]。在缺氧條件下，自噬可以降低細胞內的耗氧率。AMPK激活后通過磷酸化脂肪分解的限速酶促進脂肪分解；通過磷酸化線粒體裂變因子(mitochondrial fission factor, MFF)促進線粒體自噬來恢復細胞內部的能量穩(wěn)態(tài)[44]。另一方面細胞自噬可能加重AgNPs對細胞損傷的程度。過度自噬可能促進細胞吸收并蓄積AgNPs，最終導致細胞凋亡或壞死[38]。當細胞處于長時間應激狀態(tài)，細胞可能發(fā)生非凋亡性死亡，從而促進了AgNPs對細胞的毒性作用。同時，細胞在持續(xù)處于氧化還原狀態(tài)失衡的情況下，內質網應激誘導的自噬可能是細胞凋亡的上游事件。蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、激活轉錄因子(activating transcription factor 6, ATF6)和肌醇依賴酶(inositol-requiring enzyme-1, IRE1)是3種已知的響應內質網應激的蛋白。當細胞出現(xiàn)內質網應激時，葡萄糖調節(jié)蛋白(glucose regulated protein 78, GRP78)將從PERK上解離使其活化。PERK活化后將導致C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)被激活。CHOP在內質網應激中起著介導細胞凋亡的作用。AgNPs可以誘導HepG2細胞內CHOP過表達，最終通過Caspase3途徑誘導細胞凋亡[47]。

AgNPs的染毒濃度、粒徑、形狀、分散性和表面涂層等均對誘導細胞自噬水平產生影響。1 mg·mL-1的AgNPs染毒HepG2細胞后，觀察到細胞自噬被激活、促進了細胞的生存能力，而染毒濃度達到50 mg·mL-1時，卻誘導了細胞凋亡[47]。AgNPs染毒HeLa細胞后，可以觀察到TFEB核易位、LC3-Ⅱ、p62和LAMP1等顯著升高[24]。但檸檬酸鹽涂層的AgNPs染毒腺癌人類肺泡基底上皮細胞A549后并未觀察到TFEB核易位，只是在轉錄水平上抑制了其表達[10]。AgNPs還可能通過破壞溶酶體結構與功能的穩(wěn)定性，減少自噬溶酶體的降解，阻滯自噬通量完整性。經由胺修飾的AgNPs可引起NIH-3T3細胞自噬和凋亡，且20 nm比80 nm的胺修飾AgNPs能引起更多的溶酶體腫脹[45]。此外，AgNPs可以破壞A498、HEK293和A549細胞內溶酶體結構與功能的穩(wěn)定性，減少自噬溶酶體的降解，阻滯自噬通量完整性[8,10]。Fageria等[38]的研究表明，9 nm和19 nm的AgNPs可由不同的內在化途徑被人乳腺癌細胞MCF-7及MDA-MB-468攝取，在短時間內觀察到LC3-Ⅱ、Beclin-1和ATG3蛋白水平增加，但在24 h后，細胞內溶酶體出現(xiàn)功能性障礙，細胞自噬通量被阻滯[38]。今后，探究AgNPs的自噬效應時，其理化性質、分散狀態(tài)及其作用環(huán)境等都是需要考慮的影響因素。

5 總結與展望(Summary and outlook)

伴隨著AgNPs的廣泛應用，其帶來的健康風險不容忽視。揭示AgNPs誘導細胞自噬作用對AgNPs材料在生物醫(yī)學領域的應用及評估其潛在風險有著重要的意義。迄今為止的研究表明，AgNPs主要通過氧化應激反應、內質網應激反應以及溶酶體功能損傷激活細胞自噬過程。另一方面，細胞自噬也能夠某種程度上減輕AgNPs對細胞的毒性作用(圖2)，而AgNPs的持續(xù)作用可能導致過度自噬，并引起細胞凋亡甚至壞死。此外，AgNPs也可能引起溶酶體功能障礙，阻滯細胞自噬通量的完整性，影響受損細胞器或錯誤翻譯蛋白質的降解等過程。AgNPs誘導細胞自噬信號通路的不同似乎與細胞生存命運有關。不同理化性質的AgNPs以及細胞類型對AgNPs激活細胞的自噬信號通路具有選擇性。因此，進一步闡明不同AgNPs誘導自噬過程的分子機制，控制和調節(jié)AgNPs引起的自噬活化，并且在分子水平上調控自噬發(fā)生過程，降低AgNPs自身的毒性，是AgNPs在生物醫(yī)學領域發(fā)揮作用的關鍵。

未來，隨著納米科學技術的不斷發(fā)展，AgNPs在其他領域的應用也必將逐漸增多。隨著AgNPs的廣泛應用，其極有可能因為處置不當而被環(huán)境生物所富集，并可能對生物造成長期影響。已經有學者對AgNPs是否具有跨代傳遞特性進行研究，而AgNPs誘導的細胞自噬信號通路通常涉及細胞激酶的激活與失活，對其是否會引起表觀遺傳效應和二者之間的聯(lián)系還未可知。未來需要在研究AgNPs誘導細胞自噬的信號通路的基礎上，進一步了解其誘導的細胞自噬信號通路與表觀遺傳的關系，為評估AgNPs的生物毒性提供新見解。

圖2 納米銀誘導細胞自噬的分子機制及生物效應注：ROS表示活性氧；ATP表示三磷酸腺苷；AMPK表示腺苷磷酸依賴性蛋白激酶；PI3K表示磷脂酰肌醇3-激酶；AKT表示蛋白激酶B；P53表示腫瘤抑制蛋白；mTOR表示哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；PINK1/Parkin表示磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)誘導的激酶1/Parkin；JNK表示c-Jun氨基末端激酶；ERK表示胞外調節(jié)激酶。Fig. 2 Molecular mechanism and biological effects of autophagy induced by AgNPsNote: ROS stands for reactive oxygen species; ATP stands for adenosine triphosphate; AMPK stands for adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase; PI3K stands for phosphoinositide 3-kinase; AKT stands for protein kinase B; P53 stands for tumor suppressor protein; mTOR stands for mammalian rapamycin target protein; PINK1/Parkin stands for PTEN-induced kinase 1/Parkin; JNK stands for c-Jun N-terminal kinase; ERK stands for extracellular regulated protein kinase.

通訊作者簡介：趙曉旭(1984—)，男，博士，講師，主要研究方向為環(huán)境毒理學。

共同通訊作者簡介：呂源財(1986—)，男，博士，講師，主要研究方向為納米材料的環(huán)境風險。