雙色譜柱/雙檢測(cè)器頂空氣相色譜法檢驗(yàn)全血乙醇的性能評(píng)估

林傳俊，劉永粉，楊 浩 ，汪宏良，2b*

(1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,湖北 黃石 435000；2.湖北理工學(xué)院 a.醫(yī)學(xué)院，b.腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 黃石 435003)

過(guò)量飲酒會(huì)造成心、腦、肝、腎及周圍神經(jīng)系統(tǒng)等的損傷，人體血液乙醇含量的檢驗(yàn)對(duì)于醫(yī)療救治評(píng)估、“酒駕”和“醉駕”交通檢查等具有十分重要的意義。

臨床實(shí)驗(yàn)室主要采用酶學(xué)法、化學(xué)方法和干化學(xué)法等進(jìn)行血液乙醇的檢驗(yàn)分析，然而，這些方法在靈敏度和特異性方面存在一定不足。目前，頂空氣相色譜法是被廣泛認(rèn)可的用于檢測(cè)乙醇含量的檢驗(yàn)方法，因此，臨床實(shí)驗(yàn)室有必要引進(jìn)并建立頂空氣相色譜法檢驗(yàn)全血乙醇濃度以服務(wù)臨床和患者。

雙色譜柱/雙檢測(cè)器頂空氣相色譜法檢驗(yàn)全血乙醇是將待測(cè)樣品放在密閉系統(tǒng)中加熱到一定溫度，使乙醇在氣相和液相中達(dá)到平衡，待樣品進(jìn)入色譜柱，其乙醇在2根色譜柱上的色譜具有不同的保留行為，用2個(gè)氫火焰化離子檢測(cè)器對(duì)分離出的組分進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與乙醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，以保留時(shí)間定性，用乙醇峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值進(jìn)行定量。該技術(shù)可以有效減少儀器系統(tǒng)性誤差，使定性更加準(zhǔn)確、操作更簡(jiǎn)便、干擾更小，且在定量方面具有靈敏度高、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。

實(shí)驗(yàn)室在選擇檢測(cè)系統(tǒng)和檢驗(yàn)方法時(shí)應(yīng)對(duì)系統(tǒng)的性能進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，以保證結(jié)果的可靠性。依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)的相關(guān)性能評(píng)價(jià)文件[3-6]和相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[7-8]，對(duì)實(shí)驗(yàn)室賽默飛Trace GC 1300氣相色譜儀和 TriPlus 500頂空自動(dòng)進(jìn)樣器檢測(cè)系統(tǒng)的定性和定量分析性能進(jìn)行評(píng)估，以確定檢測(cè)系統(tǒng)的性能指標(biāo)符合行業(yè)要求。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：Trace GC 1300氣相色譜儀(ThermoFisher)；TriPlus 500頂空自動(dòng)進(jìn)樣器(ThermoFisher)。

主要試劑：乙醇、叔丁醇，色譜純，購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司。

1.2 配制溶液

乙醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取50 mg乙醇，加二級(jí)水定容至5 mL，備用。

乙醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將乙醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐漸稀釋，配成濃度分別為1，10，20，80，100，200 mg/100 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

叔丁醇內(nèi)標(biāo)工作溶液：準(zhǔn)確稱取80 mg叔丁醇，加二級(jí)水定容至100 mL，使其濃度達(dá)到80 mg/100 mL[9]。

1.3 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

取1，10，20，80，100，200 mg/100 mL的乙醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各0.10 mL，加入樣品瓶?jī)?nèi)，再取0.5 mL 80 mg/100 mL的叔丁醇內(nèi)標(biāo)工作溶液加入樣品瓶，密封、混勻后，置于頂空自動(dòng)進(jìn)樣器中進(jìn)樣測(cè)定，建立校準(zhǔn)曲線的回歸方程。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1頂空氣相色譜條件

色譜柱： Thermo ScientificTMTraceGOLDTMTG-ALC 1 30 m×0.53 mm×3.0 μm (P/N 26063-3960) 和TraceGOLDTMTG-ALC 2 30 m×0.53 mm×1.0 μm(P/N 26063-2980)；柱溫：40 ℃恒溫；檢測(cè)器類型和工作參數(shù)：FID檢測(cè)器，溫度為250 ℃；氮?dú)狻脷錃狻每諝?40∶35∶350 (mL/min)；載氣類型及流速：氮?dú)猓懔髂Ｊ?，流速?.0 mL/min；進(jìn)樣方式及體積：樣品瓶加熱平衡時(shí)間10 min，加壓時(shí)間0.1 min，輔助氣壓10 kPa，柱流量為10 mL/min，吹掃流量為10 mL/min，分流量為100 mL/min，傳輸線溫度110 ℃，定量環(huán)溫度105 ℃，樣品管路溫度105 ℃，進(jìn)樣體積為1 mL。

1.4.2比對(duì)實(shí)驗(yàn)

收集濃度在分析測(cè)量范圍內(nèi)的樣本20份，樣本隨機(jī)排列，分4批連續(xù)檢測(cè)，將Trace GC 1300前檢測(cè)器和后檢測(cè)器所測(cè)乙醇結(jié)果作比較，前檢測(cè)器為比較方法，后檢測(cè)器為實(shí)驗(yàn)方法。

1.4.3精密度驗(yàn)證

取空白全血1.80 mL和1.20 mL，分別添加濃度為200 mg/100 mL的乙醇標(biāo)準(zhǔn)液0.20 mL和0.80 mL，密封保存[10-11]。將該樣品作為精密度驗(yàn)證材料，每日分析1批，每批每個(gè)水平測(cè)定3次，連續(xù)5 d。

1.4.4回收試驗(yàn)

取空白全血1.95，1.80和1.20 mL，分別添加濃度為200 mg/100 mL的乙醇標(biāo)準(zhǔn)液0.05，0.20和0.80 mL，密封保存。將該樣品作為回收試驗(yàn)材料，在1個(gè)分析批內(nèi)檢測(cè)完畢。

1.4.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 定性結(jié)果

圖1 前檢測(cè)器乙醇及內(nèi)標(biāo)叔丁醇的色譜圖(10 mg/100 mL乙醇標(biāo)準(zhǔn)品)

圖2 后檢測(cè)器乙醇及內(nèi)標(biāo)叔丁醇的色譜圖(10 mg/100 mL乙醇標(biāo)準(zhǔn)品)

表1 前檢測(cè)器和后檢測(cè)器乙醇、叔丁醇組分的保留時(shí)間 min

2.2 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量性

前檢測(cè)器和后檢測(cè)器乙醇標(biāo)準(zhǔn)工作液線性關(guān)系分別如圖3和圖4所示。乙醇標(biāo)準(zhǔn)工作液經(jīng)頂空進(jìn)樣器進(jìn)樣后，乙醇與叔丁醇峰形良好，以乙醇峰面積與叔丁醇峰面積的比值為縱坐標(biāo)，乙醇濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，在1～200 mg/100 mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。前檢測(cè)器回歸方程為Y=0.0057X-0.0058,決定系數(shù)R2=0.9995；后檢測(cè)器回歸方程為Y=0.0057X-0.0067,決定系數(shù)R2=0.9994。以3倍信噪比表示方法的檢出限，前檢測(cè)器檢出限為0.11 mg/100 mL，后檢測(cè)器檢出限為0.10 mg/100 mL。以10倍信噪比表示方法的定量限，前檢測(cè)器定量限為0.38 mg/100 mL，后檢測(cè)器定量限為0.34 mg/100 mL。

圖3 前檢測(cè)器乙醇標(biāo)準(zhǔn)工作液線性關(guān)系

圖4 后檢測(cè)器乙醇標(biāo)準(zhǔn)工作液線性關(guān)系

2.3 比對(duì)結(jié)果

前檢測(cè)器與后檢測(cè)器結(jié)果散點(diǎn)圖如圖5所示。前檢測(cè)器與后檢測(cè)器結(jié)果比較的相對(duì)偏倚圖如圖6所示。

圖5 前檢測(cè)器與后檢測(cè)器結(jié)果散點(diǎn)圖

圖6 前檢測(cè)器與后檢測(cè)器結(jié)果比較的相對(duì)偏倚圖

將Trace GC1300前檢測(cè)器和后檢測(cè)器所測(cè)20份樣本的乙醇結(jié)果作比較，Deming線性回歸方程為Y=1.0066X-0.3473，系數(shù)R2=0.9992，相對(duì)偏倚均控制在5.0%以內(nèi)[8]。以乙醇濃度5，20和80 mg/100 mL作為監(jiān)測(cè)閾值，則其偏倚分別為6.29%，1.08%和0.23%。2組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，P>0.05(P=0.47)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 精密度結(jié)果

前檢測(cè)器和后檢測(cè)器的精密度見表2。由表2可知，前檢測(cè)器批內(nèi)變異系數(shù)和室內(nèi)變異系數(shù)分別為1.76%，0.90%，2.39%，1.38%；后檢測(cè)器批內(nèi)變異系數(shù)和室內(nèi)變異系數(shù)分別為2.12%，0.91%，2.20%，1.58%。

表2 前檢測(cè)器和后檢測(cè)器的精密度

2.5 方法回收率

前檢測(cè)器和后檢測(cè)器的回收率見表3。乙醇理論濃度為5，20和80 mg/100 mL，在該范圍內(nèi)，前檢測(cè)器和后檢測(cè)器的平均回收率為99.47%～108.10%。

表3 前檢測(cè)器和后檢測(cè)器的回收率

3 結(jié)論

雙色譜柱/雙檢測(cè)器頂空氣相色譜法檢驗(yàn)全血乙醇結(jié)果明顯好于單檢測(cè)器頂空氣相色譜法，前檢測(cè)器和后檢測(cè)的回收率表明檢測(cè)系統(tǒng)能滿足臨床檢驗(yàn)全血乙醇的需要，但需進(jìn)一步控制后檢測(cè)器系統(tǒng)誤差，確保檢驗(yàn)結(jié)果的一致性。