基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)探討黃芪治療鼻炎的作用機(jī)制

劉小敏，邱海燕，蘇楊，張樂樂，曹亞楠，陳加容，鄒亮，胡櫻凡

鼻炎（rhinitis）是一種由鼻腔粘膜炎癥引起的上呼吸道疾病，表現(xiàn)為鼻塞、流鼻涕、鼻癢和打噴嚏等癥狀。鼻炎嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，包括睡眠、工作效率等，并伴有嚴(yán)重的心理障礙，也是發(fā)展為哮喘的危險(xiǎn)因素[1]。西醫(yī)治療鼻炎主要通過化藥和手術(shù)等方式，但不良反應(yīng)較多，需長(zhǎng)期服藥，患者順應(yīng)性差，疼痛感強(qiáng)，傷害鼻腔。近年來，中醫(yī)藥在改善鼻炎患者癥狀、提高患者生活質(zhì)量等方面發(fā)揮著重要作用。

中醫(yī)理論認(rèn)為，鼻炎病機(jī)多為肺脾虛寒，衛(wèi)陽不固，風(fēng)邪趁虛而入所致。黃芪，性甘溫，歸肺、脾經(jīng)，作為傳統(tǒng)補(bǔ)益藥之一，具有補(bǔ)脾升陽、益氣固表等功效[2]。臨床研究表明，黃芪顆粒[3]、黃芪注射液[4]、黃芪桂枝五物湯[5]、脫敏湯[6]、辛芪顆粒[7]、黃芪建中湯[8]等黃芩復(fù)方，均能夠改善鼻炎患者的癥狀，在臨床上取得較好療效?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪有效成分黃芪甲苷可通過下調(diào)JAK2/STAT6信號(hào)通路及ROS水平[9]，從而達(dá)到治療鼻炎的目的；黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡改善大鼠鼻黏膜炎性癥狀[10]。目前，黃芪干預(yù)鼻炎的研究較少，對(duì)于黃芪治療鼻炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚不明確。因此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)探討黃芪治療鼻炎的潛在藥效物質(zhì)和分子作用機(jī)制，以期進(jìn)一步為黃芪治療鼻炎的中醫(yī)理論和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 黃芪活性成分及靶點(diǎn)收集

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/ tcmsp.php）檢索黃芪的化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選閾值，得到黃芪的活性成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)，利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）獲得對(duì)應(yīng)的人源靶基因。利用PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）檢索在TCMSP數(shù)據(jù)庫中無靶點(diǎn)的化合物的Canonical SMILES，通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch）、Similarity ensemble approach數(shù)據(jù)庫（http://sea.bkslab.org/）、PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）對(duì)化合物潛在的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2 鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)收集

在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）中，以“rhinitis”為關(guān)鍵詞，檢索與鼻炎相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.3 黃芪治療鼻炎潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將黃芪活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)及鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)錄入Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），獲取兩者交集，即為黃芪治療鼻炎的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 “活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

將活性成分和潛在靶點(diǎn)錄入Cytoscape 3.7.2（https://cytoscape.org/）軟件，構(gòu)建黃芪與鼻炎“活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化分析。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

將潛在靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫（http://stringdb.org/cgi/input.pl）構(gòu)建黃芪抗鼻炎的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。定義物種為人，將最低互作評(píng)分下的“high confidence”設(shè)定為0.9，同時(shí)隱藏游離的節(jié)點(diǎn)。使用R軟件，得到前30名蛋白及節(jié)點(diǎn)連接數(shù)量的柱狀圖，連接數(shù)量的大小可直接代表節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的地位。

1.6 GO功能富集和KEGG通路分析

使用Bioconductor數(shù)據(jù)庫（http://www.bioconductor.org/）、R軟件及其下屬包“clusterProfiler”對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析（BP、CC、MF）和KEGG通路分析。選取P-value靠前的分析結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的可視化處理。

1.7 “通路-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件對(duì)KEGG通路富集分析中得到的通路與整合的蛋白靶點(diǎn)構(gòu)建“通路-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.8 分子對(duì)接

采用Vina軟件對(duì)主要活性成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)的可靠性。在PubChem數(shù)據(jù)庫檢索主要活性成分2D分子結(jié)構(gòu)的SDF文件，使用ChemOffice軟件進(jìn)行優(yōu)化，獲得3D分子結(jié)構(gòu)，保存為*.mol2格式。在PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）中下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，使用PyMOL軟件刪除靶點(diǎn)配體，保存為pdb格式。運(yùn)用AutoDock Tools軟件對(duì)大分子蛋白進(jìn)行加氫，計(jì)算Gasteiger電荷，保存為pdbqt格式。設(shè)置相關(guān)參數(shù)，運(yùn)用AutoDock Vina軟件將化合物配體和靶蛋白受體對(duì)接，并使用PyMOL軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 黃芪治療鼻炎的活性成分及靶點(diǎn)的獲取

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中共檢索到黃芪相關(guān)成分87個(gè)，以DL≥0.18和OB≥30%為條件篩選，共獲得21個(gè)活性成分（表1），通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索活性成分所涉及的靶點(diǎn)并在Pubchem數(shù)據(jù)庫中檢索在TCMSP數(shù)據(jù)庫中無靶點(diǎn)的化合物的Canonical SMILES，通過Swiss Target Prediction、Similarity ensemble approach、PharmMapper數(shù)據(jù)庫對(duì)化合物潛在的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫篩選校正后，共獲得339個(gè)靶點(diǎn)。

表1 黃芪治療鼻炎潛在成分

2.2 鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)收集

以“rhinitis”為檢索詞，從Genecards數(shù)據(jù)庫中檢索到2638個(gè)與鼻炎相關(guān)的靶點(diǎn)。將黃芪活性成分的339個(gè)靶點(diǎn)與鼻炎的2638個(gè)靶點(diǎn)取交集后，共獲得147個(gè)交集靶點(diǎn)，對(duì)應(yīng)16個(gè)活性成分。

2.3 “活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將16個(gè)活性成分與147個(gè)交集靶點(diǎn)錄入Cytoscape 3.7.2軟件繪制“活性成分-潛在靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖2），紅色三角形代表活性成分，藍(lán)色方塊代表靶點(diǎn)，每條邊代表活性成分與作用靶點(diǎn)之間的關(guān)系。圖中共包含163個(gè)節(jié)點(diǎn)，280條邊。結(jié)果顯示主要活性成分有槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、芒柄花黃素（Formononetin）、異鼠李素（Isorhamnetin）、毛蕊異黃酮（Calycosin）、黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ）等，推測(cè)其可能是黃芪發(fā)揮治療鼻炎作用的主要活性物質(zhì)，體現(xiàn)了黃芪治療鼻炎多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

將147個(gè)交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建聯(lián)系緊密的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3），圓形節(jié)點(diǎn)表示不同的基因蛋白，節(jié)點(diǎn)連線代表蛋白之間的相互關(guān)系。圖中包含147個(gè)節(jié)點(diǎn)、1366條連線，連接數(shù)量的大小可直接代表節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的地位。利用R軟件對(duì)靶點(diǎn)間的連線進(jìn)行計(jì)數(shù)，繪制連接數(shù)目處于前30的柱狀圖（圖4）。結(jié)果顯示TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、JUN等處于核心地位，可能是黃芪治療鼻炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 靶點(diǎn)的GO富集分析和KEGG通路分析

使用R軟件和Bioconductor加載包，以P≤0.05對(duì)147個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，選擇排名前20的結(jié)果進(jìn)行可視化處理（圖5）。其中，生物過程（biological process）共富集到2385條，主要涉及脂多糖反應(yīng)、活性氧響應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞外刺激反應(yīng)、固有凋亡信號(hào)通路調(diào)控等。細(xì)胞組分（cellular component）共富集到75條，主要涉及細(xì)胞膜筏、胞質(zhì)、泛素連接復(fù)合物等。分子功能（molecular function）共富集到140條，主要涉及細(xì)胞因子、受體、蛋白激酶活性等。體現(xiàn)了黃芪可能通過調(diào)控多個(gè)GO功能來治療鼻炎。

KEGG通路富集分析共得到166條相關(guān)通路（P<0.001），選擇排名前20的結(jié)果（表2）進(jìn)行可視化分析（圖6、圖7），可知基因主要集中在流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、人類巨細(xì)胞病毒感染信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路等通路上。以上KEGG富集分析結(jié)果表明黃芪可通過調(diào)節(jié)不同類型的信號(hào)通路發(fā)揮治療鼻炎的作用。

表2 黃芪治療鼻炎的通路

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2.6 分子對(duì)接分析

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，選擇槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮、異鼠李素5個(gè)主要活性成分與TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA 5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接效果表現(xiàn)為結(jié)合能，結(jié)合能小于0表示配體與受體可自發(fā)結(jié)合，且結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能越低，結(jié)合能< -5.0 kcal﹒mol-1表明具有良好的結(jié)合活性，當(dāng)結(jié)合能< -7.0 kcal﹒mol-1時(shí)，有強(qiáng)的結(jié)合活性。結(jié)果顯示（表3），主要活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-5.0 kcal﹒mol-1，表明通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到的活性成分和靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合活性，預(yù)測(cè)結(jié)果較為可靠。

表3 黃芪中活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能

為明確靶點(diǎn)蛋白與對(duì)應(yīng)活性成分之間的結(jié)合活性，選擇6個(gè)對(duì)接能量較小的結(jié)果進(jìn)行展示（圖8）。結(jié)果表明，Quercetin與TNF中的ARG-32、ALA-33、ASN-34、HIS-15、LEU-93、GLY-148、GLU-146、PHE-144殘基結(jié)合，與TP53中的THR-246、GLN-248、LYS-107殘基結(jié)合，與AKT1中的LYS-179、GLY-159、GLY-162、PHE-161殘基結(jié)合；Calycosin與TNF中的VAL-150、GLY-148、ALA-33、ARG-32殘基結(jié)合；Isorhamnetin與TP53中的LEU-195、ARG-80、ASN-278、ARG-337殘基結(jié)合；Kaempferol與AKT1中的ASP-292、LYS-276、SER-7、THR-6殘基結(jié)合，可觀察到靶點(diǎn)與活性成分均具有良好的結(jié)合位點(diǎn)，并借助氫鍵等分子間作用力，形成較穩(wěn)定的構(gòu)象。

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3 討論

鼻炎是一種兒童和成人常見的異質(zhì)性慢性疾病，在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，其病機(jī)主要是肺脾虛寒。“黃芪，補(bǔ)肺健脾，衛(wèi)實(shí)斂汗，驅(qū)風(fēng)運(yùn)毒之藥也...”（《本草匯言》），藥用歷史長(zhǎng)達(dá)2000多年?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪可有效減輕鼻黏膜炎性癥狀[11-13]，從而發(fā)揮治療和預(yù)防鼻炎的作用，但具體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制仍不明確。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討黃芪治療鼻炎的主要活性物質(zhì)及其作用機(jī)制，體現(xiàn)了黃芪可“多成分，多靶點(diǎn)，多通路”共同作用治療鼻炎。

從“活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖可知，槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮、異鼠李素、黃芪甲苷等可能是黃芪治療鼻炎的主要活性成分。研究表明，槲皮素可通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡[14]、降低總IgE和卵清蛋白特異性IgE水平[15]改善大鼠鼻黏膜炎癥程度，減輕鼻炎癥狀；山奈酚是一種有效的抗炎活性物質(zhì)，可通過抑制IL-32、TSLP以及caspase-1的活性發(fā)揮抗鼻炎作用[16]；毛蕊異黃酮[17]和異鼠李素[18]可抑制TNF‐α、IL-6、ⅠL‐1β等炎癥細(xì)胞因子的水平以增強(qiáng)抗炎作用；芒柄花黃素可提高小鼠免疫細(xì)胞的吞噬功能及溶菌酶的殺菌活性，提高小鼠的適應(yīng)性體液免疫功能[19]；黃芪甲苷可通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡，調(diào)節(jié)T-bet、GATA-3、Foxp3和RORγt的表達(dá)[20]，抑制HMGB1/TLR4/NF‐κB通路減少促炎因子的產(chǎn)生[21]來緩解鼻炎癥狀。PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明，黃芪治療鼻炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)有TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA等。研究表明，TP53是鼻炎、哮喘發(fā)病過程中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因[22]；IL-6、TNF‐α作為炎癥細(xì)胞因子與鼻炎的發(fā)生有著密切聯(lián)系[23]；VEGFA可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，通過促進(jìn)血管通透性調(diào)節(jié)鼻粘膜組織的炎癥反應(yīng)[24]；PI3K/AKT信號(hào)通路在鼻炎發(fā)病機(jī)理中具有重要作用，而AKT是該途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[25]。如上所述，槲皮素、山奈酚、異鼠李素等黃芪中的主要活性成分可能通過作用于TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA等關(guān)鍵靶點(diǎn)，發(fā)揮改善炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)免疫功能的作用以治療和改善鼻炎。

通過GO功能富集和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，黃芪可能通過參與脂多糖反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、固有凋亡信號(hào)通路調(diào)控等生物學(xué)過程，在細(xì)胞膜筏、胞質(zhì)等部位，發(fā)生酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等分子反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、人類巨細(xì)胞病毒感染信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等發(fā)揮治療鼻炎的作用。流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路主要與血液流變學(xué)有關(guān)，較低的血流剪切力易導(dǎo)致動(dòng)脈硬化形成或斑塊破裂、內(nèi)皮損傷，較高的血流剪切力有利于維持血管內(nèi)皮的正常功能，保護(hù)血管內(nèi)膜[26]；在TNF信號(hào)通路中，TNF‐α可以使NF‐κB等上調(diào)而誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥的發(fā)生，與鼻炎的發(fā)生機(jī)制有一定的聯(lián)系[27,28]；IL-17信號(hào)通路在鼻炎的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，IL-17是一種主要由輔助性T細(xì)胞等分泌的促炎性細(xì)胞因子，在鼻炎患者血清中高度表達(dá)[29]；AGE/RAGE信號(hào)傳導(dǎo)的引發(fā)涉及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶、蛋白激酶C和MAPK的多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活，以及促進(jìn)IL-6、TNF‐α等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，與鼻炎的發(fā)生有著密切的聯(lián)系[30]。

分子對(duì)接結(jié)果顯示黃芪的5個(gè)主要活性化合物槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮、異鼠李素與TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA5個(gè)核心靶點(diǎn)均表現(xiàn)出良好的結(jié)合活性，結(jié)合位點(diǎn)具有穩(wěn)定的氫鍵，構(gòu)象穩(wěn)定，從而驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的篩選結(jié)果。

綜上所述，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)系統(tǒng)地分析了黃芪治療鼻炎的作用機(jī)制，證明了黃芪對(duì)治療鼻炎具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)，揭示了黃芪中槲皮素、山奈酚、異鼠李素等潛在藥效成分，通過作用于AKT1、TNF、IL-6、TP53、VEGFA等多個(gè)靶點(diǎn)，調(diào)控流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等，參與炎癥反應(yīng)、糖脂代謝、氧化應(yīng)激等發(fā)揮治療鼻炎的作用，為深入探討其發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供參考與研究思路。后續(xù)可通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)活性成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，以進(jìn)一步明確黃芪治療鼻炎的作用機(jī)制。