基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究寬筋藤治療特異性皮炎的作用機(jī)制

龔娟，楊華，唐雪勇，戚東衛(wèi)

特異性皮炎（Atopic dermatitis，AD）是一種常見的慢性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，表現(xiàn)為炎性、滲出性皮損、苔蘚化及皮膚干燥，部分患者病情遷延終生嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。AD發(fā)病于各個(gè)年齡段，常見于嬰兒、青少年以及成年人，多發(fā)于嬰幼兒。30%的兒童與8%的成年AD患者常伴有焦慮、睡眠障礙以及抑郁，對(duì)其生活質(zhì)量造成要重影響[2]。高昂的醫(yī)療費(fèi)用、患者生活質(zhì)量的下降以及一定的死亡率使AD成為了一個(gè)全球性的健康問題。相關(guān)研究表明：遺傳、環(huán)境、皮膚屏障破壞以及免疫功能障礙是目前AD公認(rèn)的病因[3]。近年來，隨著研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)AD發(fā)病與Th1/Th2失衡密切相關(guān)[4]。

寬筋藤（Tinospora sinensis (Lour.) Merr.），別名松根藤、大松身、中華青牛膽以及牛掙藤等，是防己科青牛膽屬植物中華青牛膽的藤莖，主產(chǎn)于西藏、四川云南以及兩廣地區(qū)，其藥用部位為藤莖，全年均可采收，其味苦、性涼，歸肝經(jīng)，具有舒筋活絡(luò)，祛風(fēng)止痛之效，在臨床上主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛、骨折等[5]。寬筋藤最早出現(xiàn)在清代的《生草藥性備要》，書中記載：“一名火炭葛”。在《陸川本草》中曰：“一名青寬筋藤，一名四方藤”，書中首次出現(xiàn)寬筋藤藥名。民國(guó)的《嶺南采藥錄》曰：“…酒浸舒經(jīng)絡(luò)…治氣節(jié)疼痛…”，該書對(duì)其功效有較為詳細(xì)描述?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：寬筋藤具有抗寄生蟲、抗輻射、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、保肝、調(diào)節(jié)免疫等作用，在臨床上廣泛用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腰腿疼痛，關(guān)節(jié)僵硬，骨折等[6-8]。寬筋藤是重慶市中醫(yī)院皮膚科協(xié)定處方抗炎2號(hào)的主要藥物之一，在臨床上廣泛用于AD的治療，月使用量在1000副以上，收獲較為理想的治療效果?，F(xiàn)代植化研究結(jié)果提示：生物堿、黃酮、木脂素、苯丙素、倍半萜及二萜、酚苷等是其主要的化學(xué)成分[9,10]。然而，寬筋藤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及藥理學(xué)分子作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。中藥的多成分、多靶點(diǎn)、低選擇及協(xié)同作用是中藥藥理研究面臨的最大難題，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過計(jì)算機(jī)的強(qiáng)大運(yùn)算能力，結(jié)合藥學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)及多層次網(wǎng)絡(luò)分析的新技術(shù)，以小分子化合物、靶點(diǎn)、信號(hào)通路等多角度著手，能夠有效預(yù)測(cè)中藥的有效成分與作用靶點(diǎn)，闡釋中藥的作用機(jī)制[11]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥研究中已經(jīng)凸顯出具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)以及較大的潛力。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究寬筋藤治療AD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活性成分的篩選

以“寬筋藤”為關(guān)鍵詞檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以及BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batmantcm/），收集寬筋藤的有效成分及靶點(diǎn)。以生物利用度（oral bioavailability，OB），類藥性（drug-like）分別大于等于30%，0.18，并適當(dāng)補(bǔ)充文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)的新化合物。

1.2 AD相關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)的獲得

通過疾病數(shù)據(jù)庫（GenneCaeds，OMIM）查找與“特異性皮炎”（Atopic dermatitis，AD）具有密切聯(lián)系的基因，獲得與AD相關(guān)的基因。

1.3 活性小分子---靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將收集到的寬筋藤活性小分子靶點(diǎn)及AD相關(guān)靶點(diǎn)交集,獲取潛在寬筋藤治療AD的靶點(diǎn)。梳理“寬筋藤-活性小分子-靶點(diǎn)-AD”的相關(guān)信息，使用Cytoscape 3.7.0軟件獲得“寬筋藤-活性小分子-靶點(diǎn)-AD”網(wǎng)絡(luò)。使用插件（network analyzer）分析“活性小分子-靶點(diǎn)-網(wǎng)絡(luò)圖”。在構(gòu)建好的網(wǎng)絡(luò)中，活性小分子、靶點(diǎn)及通路使用節(jié)點(diǎn)（node）表示。某一些基因?yàn)槟硞€(gè)活性小分子的潛在作用靶點(diǎn)，則用邊（edge）相連接表示。

1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

為了闡明寬筋藤治療AD潛在靶基因的相互作用，把1.3項(xiàng)下獲得的交集靶點(diǎn)輸入STRING（https://string-db.org/）平臺(tái)構(gòu)建構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Proteinprotein-interaction，PPI），把最低互作閾值設(shè)為中等，其它參數(shù)保持不變。把構(gòu)建好的PPI導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件,使用network analyzer插件進(jìn)行功能分析,確定寬筋藤治療AD的關(guān)鍵基因。

1.5 功能分析

運(yùn)用Bioconductor軟件及R語言進(jìn)行寬筋藤治療AD的GO富集分析以及KEGG信號(hào)通路富集分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 寬筋藤有效成分及其靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP，BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，以及文獻(xiàn)分析，篩選獲得符合1.1項(xiàng)下12個(gè)有效成分（quercetin，rutin，prolinum，DTY，tinosineside B，tinosinen，syringaresinol，dimethoxyglucopyranoside，benzyl Oglucopyranoside，cycloIleAla，cycloValTyr），同時(shí)獲取了這些化合物靶點(diǎn)228個(gè)。

2.2 AD靶點(diǎn)的獲取以及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過GenneCaeds，OMIM疾病數(shù)據(jù)庫查找與AD具有密切聯(lián)系的基因，篩選出2301個(gè)基因。使用R語言將寬筋藤12個(gè)活性小分子的228靶點(diǎn)與AD疾病相關(guān)的2301個(gè)基因交聯(lián)，獲得寬筋藤有效成分治療AD的潛在靶點(diǎn)，結(jié)果通過Venn圖表示，如圖1所示，結(jié)果顯示共有113個(gè)靶點(diǎn)重合。將寬筋藤活性小分子靶點(diǎn)及AD疾病相關(guān)靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)區(qū)，將收集到的寬筋藤活性小分子靶點(diǎn)及AD相關(guān)靶點(diǎn)交集，獲取潛在寬筋藤治療AD的靶點(diǎn)。梳理“寬筋藤-活性小分子-靶點(diǎn)-AD”的相關(guān)信息，使用Cytoscape 3.7.0軟件獲得“寬筋藤-活性小分子-靶點(diǎn)-AD”網(wǎng)絡(luò)。使用network analyzer分析“活性小分子-靶點(diǎn)-網(wǎng)絡(luò)圖”，結(jié)果見圖2。

2.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

把1.2項(xiàng)下Venn圖中小分子---靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)重合的交集中的113個(gè)基因，錄入STRING蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫中，研究這些主要靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，并篩選主要的靶點(diǎn)信息。把STRING數(shù)據(jù)庫中得到的蛋白互作信息輸入Cytoscape 3.7.0軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，如圖3所示。隨后對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化以及拓?fù)浞治龅玫?0個(gè)核心靶點(diǎn)，它們分別是IL6，ALB，INS，VEGFA，AKT1，MMP9，IL1B，CXCL8，IL10，PTGS2，JUN，CCL2，ICAM1，CASP3，MAOK1，EGFR，MMP2，MYC，SRC，ESR1，IL2，VCAM1，CAT，HMOX1，MPO，ANXA5，CRP，IFNG，RELA，MMP1。這些靶基因相互作用較為緊密，在網(wǎng)絡(luò)中起到了關(guān)鍵作用，詳見圖 4.

2.4 GO功能富集分析

對(duì)寬筋藤的30個(gè)核心藥效靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體、蛋白激酶、蛋白磷酸化以及抗氧化活性主要參與了其生物學(xué)進(jìn)程。生物進(jìn)程包括了20條（圖5A，B），包括cytokine receptor binding，cofactor biding，receptor ligand activity，receptor regulator activity，cell adhesion molecule binding，protein heterodimerizationactivity，endopeptidase activity，integrin binding，cytokine activity，heme binding，tetrapyrrole binding，phosphatase binding，protease binding，growth factor binding，growth factor receptorbinding，protein phosphatase binding，serine-type endopeptidase activity，oxidoreductase activity，antioxidant activity，transmembrance receptor protein kinase activity。

2.5 寬筋藤治療AD的KEGG通路分析

將對(duì)寬筋藤的30個(gè)核心藥效靶點(diǎn)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行KEGG通路分析。通過對(duì)交集靶點(diǎn)分析得到20條KEGG通路（圖6 A，B），這些通路之間聯(lián)系較為密切，并且每條KEGG通路均有多個(gè)靶點(diǎn)富集。AGE---RAGE signal pathway，F(xiàn)luid shear stress and atherosclerosis，IL-17 signal pathway，TNF signal pathway，Chagas disease，C-type lectin receptor signaling pathway，Relaxin signaling pathway，Hepatitis B，Malaitis，Prostate cancer，Kaposi sarcoma-associated herpersvirus inferction，Bladder cancer，Leishmaniasis，Ⅰnfluenza A，Toll-like receptor signaling pathway，Th17 cell differentiation，Osteoclast differentiation，Proteglycans incancer，Tuberculosis，Toxoplasmosis。

3 討論

目前，AD被認(rèn)為是一種易復(fù)發(fā)的炎癥性皮膚病，對(duì)患者生活質(zhì)量造成了較大的影響?，F(xiàn)階段AD治療藥物有局部以及口服藥物，主要包括糖皮質(zhì)激素、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑與免疫抑制劑[12]。糖皮質(zhì)激素主要用于治療中重度AD，與口服糖皮質(zhì)激素相比，糖皮質(zhì)激素軟膏可有效的緩解AD相關(guān)癥狀，并能獲得更高的安全性及有效性。與此同時(shí)，免疫抑制劑也收獲了較為理想的療效[13]。然而，糖皮質(zhì)激素與免疫抑制劑造成了許多副作用以及耐藥性問題。因此，副作用更小的治療方案對(duì)提高AD患者的生活質(zhì)量尤為重要。目前，中醫(yī)藥在在AD治療上擁有一定的優(yōu)勢(shì)。多成分、多靶點(diǎn)、多通路是中藥發(fā)揮治療作用的重要特征，因此，這給闡釋中藥作用機(jī)制帶來了許多困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于組學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)的技術(shù)，對(duì)系統(tǒng)全面闡釋中藥作用機(jī)制有較大的幫助。

本研究通過TCMSP，BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫以及文獻(xiàn)挖掘查找了寬筋藤的活性成分以及潛在作用靶點(diǎn)，并使用GeneCards，OMIM數(shù)據(jù)庫查找了AD疾病相關(guān)靶點(diǎn)，通過R語言將寬筋藤的活性成分潛在作用靶點(diǎn)與AD疾病關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)取交集，共發(fā)現(xiàn)113個(gè)交集靶點(diǎn)因子。將獲得的113個(gè)交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，使用Cytoscape 3.7.0軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化以及拓?fù)浞治龅玫?0個(gè)寬筋藤治療AD的核心靶點(diǎn)。對(duì)這30個(gè)主要靶點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子（IL-1B，IL-2，IL6和IL-10）主要參與了寬筋藤治療AD。然而，AD現(xiàn)在被認(rèn)為是Th2/Th1細(xì)胞失衡引起疾病，在AD急性發(fā)病期Th2細(xì)胞激活，Th2向Th1轉(zhuǎn)變發(fā)生在AD的慢性期[14]。IL-4，IL-5，IL-10，IL-15，IL-15以及IL-25與急性期Th2細(xì)胞密切相關(guān)， IL-2，ⅠFN‐γ與AD慢性期Th1細(xì)胞密切相關(guān)。與此同時(shí)，研究者認(rèn)為IL-4，IL-5，IL-10，TNF‐α，IL-1B和IgE與AD進(jìn)程具有密切關(guān)系。本研究結(jié)果提示寬筋藤可能通過調(diào)控IL-1B，IL-2，IL6和IL10等細(xì)胞因子治療AD。這些結(jié)果表明寬筋藤可能通過調(diào)控Th2/Th1細(xì)胞失衡發(fā)揮其治療作用。同時(shí)，CCL2，CXCL8等參與T淋巴細(xì)胞募集到炎癥部位[15]，本研究結(jié)果表明寬筋藤可能調(diào)節(jié)CCL2，CXCL8等趨化因子招募T淋巴細(xì)胞到炎癥部位調(diào)節(jié)局部炎癥。INS，VEGFA，AKT1，MMP9，JUN，MAPK1，EGFR，MMP2，IFNG等靶點(diǎn)均參與了調(diào)控趨化因子（CCL2，CXCL8）以及細(xì)胞因子表達(dá)（IL-1B，IL-2，IL6和IL10）。因此，這些富集到的核心靶點(diǎn)初步構(gòu)成了寬筋藤的藥效作用網(wǎng)絡(luò)。GO功能富集分析表明細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體、蛋白激酶、蛋白磷酸化以及抗氧化活性主要參與了寬筋藤治療AD的生物進(jìn)程。對(duì)KEGG通路富集結(jié)果分析表明寬筋藤最有可能通過調(diào)控AGE---RAGE signal pathway，IL-17 signal pathway，Toll-like receptor signaling pathway，Th17 cell differentiation，發(fā)揮其治療作用。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法闡釋寬筋藤治療AD的潛在作用機(jī)制，闡述了寬筋藤多成分與多靶點(diǎn)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)相互作用關(guān)系，為進(jìn)一步開展寬筋藤治療AD的實(shí)驗(yàn)研究以及為其臨川應(yīng)用提供了理論依據(jù)。