安息香提取物（XCQ）聯(lián)合慶大霉素對銅綠假單胞菌的抗菌增效作用研究

唐小懿，梁迪，陳思敏

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)屬于革蘭氏陰性菌，是一種常見的獲得性條件致病菌，廣泛存在于自然界中，可作為正常菌群或致病菌存在于人類皮膚、胃腸道以及呼吸道；是最常見的院內(nèi)感染和呼吸機相關(guān)性肺炎細菌[1]，占院內(nèi)感染死亡率的10%-20%[2]。銅綠假單胞菌因極易產(chǎn)生生物被膜而降低抗生素的治療效果[3,4]。近年來，伴隨抗生素的過度使用，銅綠假單胞菌耐藥性或多藥耐藥性的層出不窮，通過遺傳或獲得性耐藥機制對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，如喹諾酮類、β‐內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類[5]。由此導(dǎo)致臨床經(jīng)驗性用藥變得困難和難以執(zhí)行。

中藥因其多成分，多靶點特性，可對抗菌效應(yīng)的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，甚至延緩和逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性的產(chǎn)生。研究表明，眾多中藥有效成分能通過抑制群體感應(yīng)(QS)[6-9]、生物膜[10,11]以及直接殺菌作用[12,13]等途徑有效控制銅綠假單胞菌感染；以及促進抗生素穿透生物膜，提高細菌對抗生素的敏感性[14]，增強抗生素對銅綠假單胞菌的抗菌作用[15-17]。安息香為芳香開竅藥，具有開竅醒神，活血行氣之功效。研究發(fā)現(xiàn)安息香提取物具有抗菌活性[18]；在研究中發(fā)現(xiàn)，安息香提取物具有通過抑制P-糖蛋白(P-gp)轉(zhuǎn)運酶活性來提高藥物穿透血腦屏障，以及降低細胞膜通透性來促進藥物內(nèi)流的特性[19,20]。

本研究通過對醫(yī)院臨床分離的銅綠假單胞菌進行多藥耐藥株篩選和最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)測定，選取多藥耐藥性菌株進行XCQ的抗菌增效研究，包括體外敏感性實驗和體內(nèi)保護性實驗。采用牛津管法考察不同劑量的XCQ溶液對抗生素抗菌增效現(xiàn)象，以及結(jié)合感染小鼠的體內(nèi)保護性試驗進一步驗證此作用。為臨床抗生素聯(lián)合XCQ對抗銅綠假單胞菌的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物與試劑

XCQ，含量>98.0%.，批號4UPIK-AU，購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；左氧氟沙星，含量>98.0%，批號F2110154，硫酸慶大霉素，批號E2128310，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗生素紙片(左氧氟沙星(5 μg/片，LVF)、頭孢曲松(30 μg/片，CRO)、頭孢噻肟(30 μg//片，CTX)、頭孢他啶(30 μg/片，CAZ)和氨曲南(30 μg/片，AZT))，均購買于比克曼生物科技有限公司；0.9%氯化鈉注射液，批號H51021158，購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司。

1.2 試驗菌株及動物

銅綠假單胞菌臨床株，由攀枝花市中心醫(yī)院提供。KM小鼠51只，8周齡，體重18-22 g，雌性，購買于成都達碩實驗動物有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

MHA、MHB培養(yǎng)基(均購自O(shè)XOID公司)，MHA瓊脂培養(yǎng)基38 g于1000 mL純水中，加熱溶解；MHB液體培養(yǎng)基21 g于1000 mL純水中，加熱溶解。高壓滅菌鍋121℃，15 min進行消毒殺菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實驗藥液的配制

電子分析天平準(zhǔn)確稱取適量的XCQ、左氧氟沙星和慶大霉素粉末，用無菌純水分別配置成高濃度的母液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，封口膠封口，保存于‐20℃冰箱，備用。實驗前稀釋成所需溶液濃度。

1.5 試驗菌液制備

將保存在‐20℃冰箱的銅綠假單胞菌臨床株紙片在MHA培養(yǎng)基上復(fù)活，挑選長勢良好的單一菌落重新接種于新的MHA平板，生長過夜。挑取一定量的過夜細菌，用無菌生理鹽水重懸，得0.5麥?zhǔn)蠞舛染海?.5 ×108CFU﹒mL-1）；再用生理鹽水稀釋10倍，即我們實驗所需菌液濃度。

1.6 體外敏感性實驗

1.6.1 銅綠假單胞菌臨床株多藥耐藥菌的篩選 采用5種含藥抗生素紙片（左氧氟沙星（5 μg）、頭孢曲松（30 μg）、頭孢噻肟（30 μg）、頭孢他啶（30 μg）和氨曲南（30 μg））對9株銅綠假單胞菌臨床株進行體外敏感性檢測。將9種銅綠假單胞菌臨床株菌液均勻涂布于MHA平板上，并放置不同含藥抗生素紙片，用鑷子輕輕按壓紙片，使其緊密貼合培養(yǎng)基，倒置于37℃培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)（18-24 h），用直尺測量抑菌圈直徑大小，以抑菌圈最長邊作為我們的測量直徑。藥物敏感度判定參考NCCLS。

1.6.2 MIC值測量 采用瓊脂對倍稀釋法[21]，將硫酸慶大霉素、左氧氟沙星、XCQ用無菌純水配置成15個不同濃度的藥液，分別取1 mL于90 mm無菌培養(yǎng)皿中，加入14 mL MHA培養(yǎng)基，混勻，使得最終濃度分別為：硫酸慶大霉素/左氧氟沙星/XCQ(128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.0.6，0.03，0.015，0.008 μg.mL-1)。

將臨床株均配置成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木海♂?0倍后，各吸取1 mL于石英小試管，并放置于多點接種儀中，在不同含藥培養(yǎng)基平板表面進行接種；為了檢驗測試菌的生長活性和在接種過程中是否被污染，在接種前和接種后分別點種一個不含抗生素的空白MHA培養(yǎng)基。待菌液吸收干燥后，將培養(yǎng)板倒置，37度培養(yǎng)過夜(18-24 h)后觀察是否有菌斑產(chǎn)生。以無菌斑生長的最低藥物濃度作為最小抑菌濃度(MIC)。

1.6 XCQ聯(lián)合慶大霉素的體外抗菌活性 按照1.5操作步驟，將所配菌液均勻涂布于MHA平板后，放置5個相同規(guī)格的已滅菌牛津管，其中一管只加200 μL慶大霉素溶液，另三管加入100 μL慶大霉素溶液和100 μL ⅩCQ藥液；根據(jù)文獻[19]，我們采用XCQ最高濃度為100 μM，再按照對倍稀釋方式，共獲取3個濃度梯度溶液，依次為100 μM、50 μM和25 μM；最后一管加入200 μL的100 μM ⅩCQ藥液。慶大霉素我們采用NCCLS藥敏實驗的推薦劑量10 μg。使得最終劑量分別為慶大霉素：10 μg， XCQ：1.5215、0.76和0.38 μg。于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24 h,觀察結(jié)果并測量抑菌圈直徑。

1.7 XCQ聯(lián)合慶大霉素的體內(nèi)保護試驗

1.7.1 MLD100感染濃度測定 將銅綠2019-32菌株配制成不同濃度菌液，分別為0.5、1、2、3、4麥?zhǔn)蠞舛?，菌濃度分別為1.5×108、3×108、6×108、9×108、12×108CFU﹒mL-1。每個菌濃度為一組，共5組，每組3只動物。分別尾靜脈注射0.2 mL菌液，觀察5 d（120 h）內(nèi)各組小鼠的存活情況，并計算菌株對感染小鼠的MLD100。

1.7.2 藥物對感染小鼠的體內(nèi)保護性 將實驗動物按照體重均勻隨機分為3組（每組12只）：模型組（M）、慶大霉素組（GM）和慶大霉素聯(lián)合XCQ（GM+XCQ）組。通過小鼠尾靜脈注射MLD100 0.2 mL進行感染，在注射前3 h GM+XCQ組通過灌胃方式給與每只小鼠XCQ 140 mg﹒kg-1，菌液注射完成后立馬灌胃給與GM溶液31.2 mg﹒kg-1，GM組在造模后灌胃給與GM溶液31.2 mg﹒kg-1，M組在造模后灌胃給與純水。定時觀察5 d（120 h）內(nèi)感染小鼠的生存率。利用GraphPad 8.0.1軟件繪制生存曲線。

2 實驗結(jié)果

2.1 多藥耐藥菌篩選結(jié)果

由表1，選擇了喹諾酮類抗生素、β‐內(nèi)酰胺類抗生素和頭孢菌類抗生素進行銅綠假單胞菌臨床株的多藥耐藥菌篩選。其中同一種藥物對不同臨床株表現(xiàn)出不同的抑菌活性?？梢钥闯觯瑢τ谧笱醴承?LVF)而言，除了銅綠2019-32之外，所有菌株都表現(xiàn)為敏感性；對于頭孢菌素類抗生素，無敏感性菌株，耐藥率達100%。對于氨曲南(AZT)，除銅綠2019-13和2019-32兩株菌表現(xiàn)為耐藥外，其余都表現(xiàn)為敏感性。綜合實驗結(jié)果，只有銅綠2019-32菌株滿足該試驗多藥耐藥菌的評選標(biāo)準(zhǔn)。

表1 5種抗菌藥物對9種銅綠假單胞菌臨床株的體外敏感性(抑菌圈直徑/mm)

2.2 抗菌藥物對9種銅綠假單胞菌臨床株的MIC

試驗抗菌藥物對9種銅綠臨床株的MIC見表2，由表可見，左氧氟沙星(LVF)對9株菌的MIC最低，在0.03‐0.125 μg﹒mL-1之間，有較好的抑菌效果；慶大霉素（GM）對9株菌的MIC均≥1 μg﹒mL-1，且對2019-13的MIC超過了128 μg﹒mL-1，對2019-32的MIC為1 μg﹒mL-1，由該試驗設(shè)計的XCQ最高濃度均未表現(xiàn)出抑菌活性。

表2 最小抑菌濃度（MIC）測量結(jié)果（μg﹒mL-1）

2.3 XCQ聯(lián)合慶大霉素的體外抗菌活性

根據(jù)前期實驗，銅綠2019-32對三類抗生素都表現(xiàn)出耐藥現(xiàn)象，且對慶大霉素的MIC最低，因此，我們選用該菌株進行后續(xù)的敏感性實驗。采用牛津管法來探討慶大霉素聯(lián)合XCQ的體外抗菌活性。由表3可知，GM對于所有試驗臨床株來說抑菌圈直徑大小存在明顯差異，范圍由12-23 mm，表現(xiàn)為敏感性不同。當(dāng)與XCQ聯(lián)合應(yīng)用后，對大多數(shù)菌株來說抑菌圈直徑明顯增大，增效作用可高達77.78%；且對銅綠2019-1、銅綠2019-13和銅綠2019-32三種菌株的抑菌作用存在明顯的量效關(guān)系（見表4）。表明XCQ在體外能加強慶大霉素的抗菌作用。

表3 XCQ聯(lián)合慶大霉素對銅綠假單胞菌臨床株的抑菌圈直徑/mm

表4 XCQ聯(lián)合慶大霉素后對銅綠假單胞菌臨床株的抗菌增效百分比（%）

?

2.4 XCQ聯(lián)合抗菌藥物對感染小鼠的體內(nèi)保護作用

2.4.1 MLD100試驗結(jié)果 5個預(yù)試菌液濃度中，在觀察時間內(nèi)9×108和12×108CFU﹒mL-1兩個濃度滿足感染要求，因此我們選擇較低的菌液濃度作為我們的MLD100，即9×108CFU﹒mL-1。

表5 MLD100預(yù)試試驗結(jié)果（n=3）

2.4.2 XCQ對感染小鼠的體內(nèi)保護作用 為了進一步了解XCQ在體內(nèi)是否也具有同樣的協(xié)同增效作用，我們選用氨基糖苷類抗生素慶大霉素聯(lián)合XCQ來進行探討。通過小鼠最小致死量MLD尾靜脈注射方式進行造模，在進行不同的藥物干預(yù)后，觀察5 d內(nèi)小鼠的生存率，并繪制生存曲線。由圖1可知，在觀察時間內(nèi)，模型小鼠死亡率達100%；與模型組相比，慶大霉素對感染小鼠的保護作用提高了16.7%，而聯(lián)用XCQ后，保護作用提高到41.7%。說明XCQ在體內(nèi)也能提高抗菌藥物的治療作用。

3 討論

藥敏實驗檢測中，針對試驗的5種抗菌藥物，銅綠2019-32的耐藥率達到100%；通過MIC值測定顯示，銅綠2019-32對慶大霉素的敏感性最高，MIC值為1 μg﹒mL-1，根據(jù)NCCLS判斷標(biāo)準(zhǔn)，判定為敏感，即具有較好的抗菌效應(yīng)。目前，從臨床感染患者中分離出來的多藥耐藥性銅綠假單胞菌越來越多，這也是治療失敗的主要原因[22]。慶大霉素屬于氨基糖苷類藥物，氨基糖苷類抗生素也是國內(nèi)外臨床常用藥之一，且對對多種革蘭氏陰性菌具有較強的抗菌活性。慶大霉素作用方式與細菌核糖體30S亞基結(jié)合從而抑制細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成有關(guān)[23,24]，但隨著長期使用，耐藥性問題也相繼出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶通過特異性甲基化A1408，造成該類抗生素與細菌核糖體的結(jié)合能力大幅度降低，從而引發(fā)致病菌對該類抗生素的高度耐藥性[25,26]。

在體外敏感性實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，對不同試驗菌株來說，僅用慶大霉素可產(chǎn)生大小不一的抑菌圈直徑，表現(xiàn)為耐藥到敏感，這可能與分離株的基因型不同有關(guān)。當(dāng)聯(lián)合XCQ作用后，對大部分菌株來說都有明顯的增效現(xiàn)象。有研究已表明，XCQ具有促進細胞膜流動性，增加膜通透性和促進藥物內(nèi)流的特性[19]。因此，我們猜測XCQ對抗菌藥物的協(xié)同增效作用可能與增加細胞壁滲透性有關(guān)，從而促進抗菌藥物的內(nèi)流。

本文選取多藥耐藥菌2019-32進行XCQ聯(lián)合抗菌藥物的體內(nèi)協(xié)同增效研究。建立小鼠血液銅綠假單胞菌感染模型，通過給與慶大霉素或慶大霉素和XCQ溶液考察藥物對感染小鼠的治療作用。本次實驗中慶大霉素31.2 mg﹒kg-1劑量相當(dāng)于臨床人體用藥240 mg。實驗結(jié)果表明，隨著藥物干預(yù)時間的延長，治療組動物存活數(shù)高于模型組；且聯(lián)用XCQ后對小鼠的保護作用進一步提高。這與體外實驗結(jié)果一致。因此我們認為芳香開竅藥安息香提取物XCQ在體內(nèi)、外均能促進慶大霉素對銅綠假單胞菌的抗菌作用。