生脈飲中五味子醇乙在正常和心肌缺血模型大鼠中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

楊苛，周瑋玲，劉心煜，張迎，樊瑜歆，胡慧玲，游宇

心肌缺血（Myocardial Ischemia）是由于心臟的血液灌流不足從而造成了心肌缺血缺氧，導(dǎo)致其不能維持心肌細(xì)胞進(jìn)行正常工作狀態(tài)的一種病理現(xiàn)象，根據(jù)個(gè)人身體情況的不同會(huì)表現(xiàn)為心前區(qū)或胸骨后的疼痛、心律失?；蚝粑щy等癥狀[1]。心肌缺血屬于心血管疾病中的一種類型，最近公布的《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2020》發(fā)現(xiàn)，由于現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)水平的提高，人們的生活方式和生活標(biāo)準(zhǔn)也隨之發(fā)生變化，中國(guó)心血管疾病的患病人數(shù)逐年增長(zhǎng)，并愈加傾向于年輕化和低齡化轉(zhuǎn)變[2]。

生脈飲為“益心復(fù)脈”的經(jīng)典名方，全方由人參、麥冬和五味子三藥組成，一補(bǔ)一潤(rùn)一斂，有滋陰補(bǔ)氣、潤(rùn)肺清心、收斂固澀之效，在臨床上被廣泛用于治療各種心系疾病[3,4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，生脈飲具有保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，從而能夠改善心臟功能[3]。生脈飲能改善氣陰兩虛型心肌缺血病癥結(jié)合大鼠模型心肌的缺血狀況，從而保護(hù)心肌細(xì)胞[5]。對(duì)五味子抗心血管疾病的研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎等是其主要機(jī)制[6]。而五味子醇乙作為五味子中的主要藥效成分，也具有很強(qiáng)的抗氧化[7]、抗細(xì)胞凋亡[8]、抗炎[9]等作用，但對(duì)其抗心肌缺血的研究較少。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠尾靜脈注射垂體后葉素建立心肌缺血模型，灌胃生脈飲后，比較正常和心肌缺血大鼠五味子醇乙的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試藥

UltiMate 3000超快速液相色譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；BL-420N生物信號(hào)分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；電子天平；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；RG-160AT型臺(tái)式高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；干式氮吹儀（杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司）。

紅參、麥冬、五味子飲片均購(gòu)自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)依次為2003105、2006071、2001087。五味子醇乙對(duì)照品（CHB190121）、地高辛對(duì)照品（CHB200514）均購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均>98%；垂體后葉素注射液（6 U﹒mL-1, 安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：191135）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性健康SPF級(jí)SD大鼠（體重220±20 g），購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川） 2015-30。

大鼠于溫度24～26 ℃、相對(duì)濕度55～75 %、12 h/12 h晝夜交替的適宜環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料與自由飲水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 生脈飲灌胃液的制備

按照生脈飲處方劑量稱取紅參25 g，麥冬50 g，五味子25 g，加水煎煮2次。第一次加8倍量水武火煎煮至微沸，再轉(zhuǎn)文火慢煎30 min，藥液濾過(guò)備用；第二次加6倍量水以同樣步驟煎煮30 min，過(guò)濾后與第一次濾液合并，濃縮至含原藥材1 g﹒mL-1的灌胃液。

2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱取一定量的地高辛對(duì)照品，用甲醇溶解，配制成1 mg﹒mL-1的內(nèi)標(biāo)母液，于4 ℃保存，臨用前稀釋成20 μg﹒mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

五味子醇乙對(duì)照品母液的配制：精密稱取一定量五味子醇乙對(duì)照品，用甲醇溶解，并定容于25mL容量瓶中，得到各對(duì)照品儲(chǔ)備液（1 mg﹒mL-1），‐4℃保存。

五味子醇乙的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的配制：取一定量五味子醇乙對(duì)照品母液，用大鼠空白血漿將其稀釋，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（25.0、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 μg﹒L-1）。同時(shí)，用大鼠空白血漿稀釋制備得到高、中、低濃度為20.00、5.00、0.625 μg﹒L-1的質(zhì)控工作液，‐80 ℃保存待用。

2.4 急性心肌缺血模型制備

2.4.1 正常心功能大鼠篩選 SD大鼠腹腔注射10%

水合氯醛溶液(0.38ml﹒kg-1)，麻醉后連接BL-420N生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，平衡后以大鼠心電圖ST段未見(jiàn)異常（<0.1 mV），J點(diǎn)（QRS波群與ST段交界處后20 ms左右）明顯，心律整齊為特征，剔除心電圖異常者。

2.4.2 動(dòng)物分組與急性心肌缺血大鼠模型制備 將篩選出的12只正常心功能大鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只，實(shí)驗(yàn)組尾靜脈勻速注射垂體后葉素2.00 U﹒kg-1（3 U﹒mL-1），對(duì)照組尾靜脈勻速注射生理鹽水0.66 mL﹒kg-1，記錄注射后1、3、5、10、15、30分鐘時(shí)的心電圖，以ST水平下降或抬高幅度值大于0.10 mV且T波下降值大于50 %雙向、倒置、拉直線為造模成功的判斷指標(biāo)。

2.5 給藥方案及血液樣品收集

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠在灌胃前，禁食不禁水12 h，在造模給藥結(jié)束后30 min，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠口服灌胃給予1 g﹒mL-1生脈飲灌胃液（10 g﹒kg-1），給藥前0 h和給藥后0.083，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，4.0，8.0，12.0，24.0 h進(jìn)行尾靜脈采血0.3 ml，置1.5 mL肝素化離心管中，離心（4 ℃，12000 rpm，10 min），取上清液，‐80 ℃保存。

2.6 血漿樣品處理

精密吸取2.2.5項(xiàng)下血漿100 μL，加入20 .0 μL地高辛內(nèi)標(biāo)液（20 μg﹒L-1），先加入100.0 μL甲醇沉淀蛋白質(zhì)，再加入1.0 mL乙酸乙酯，2000 r﹒min-1渦旋萃取3 min，12000 r﹒min-1離心10 min，吸取上清液37 ℃氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镆?0.0 μL甲醇復(fù)溶，取上清液進(jìn)樣分析。

2.7 色譜條件

流動(dòng)相為0.1 %甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～2 min，23 %B；2～4 min，23 %～35%B；4～8 min，35 %～60 %B；8～15 min，80%～90 %B）；流速0.8 mL﹒min-1；進(jìn)樣量為8.0 μL；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

表1 洗脫程序

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 專屬性 在選定的條件下，分別取空白大鼠血漿、空白大鼠血漿＋五味子醇乙、灌胃后1 h血漿樣品，通過(guò)對(duì)比分析得出血漿中的內(nèi)源性成分和待測(cè)成分不會(huì)相互影響，專屬性良好。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取不同濃度的五味子醇乙標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以五味子醇乙的理論濃度為橫坐標(biāo)，五味子峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸擬合，得到五味子醇乙的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程。擬合出的五味子醇乙標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.1676+0.1224（R2=0.994），在線性范圍0.39～25 μg﹒L-1內(nèi)線性關(guān)系良好，該方法下的定量下限LLQQ為0.39 μg﹒L-1。

3.1.3 精密度和準(zhǔn)確度 取高、中、低濃度（20.00、5.00、0.625 g﹒mL-1）五味子醇乙QC樣品，每個(gè)濃度平行制備5份，每個(gè)樣品在一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定三次，計(jì)算日內(nèi)（Intra-day）的精密度和準(zhǔn)確度；再同一時(shí)間連續(xù)三天重復(fù)測(cè)定，相同方法計(jì)算日間（Inter-day）的精密度和準(zhǔn)確度。五味子醇乙的日內(nèi)和日間的精密度RSD范圍為10.85～15.08%，五味子醇乙的日內(nèi)和日間的準(zhǔn)確度RE均小于7.79 %，表明該方法測(cè)定精密度和準(zhǔn)確度良好。

3.1.4 穩(wěn)定性 血漿樣品中五味子醇乙的穩(wěn)定性采用以下方法來(lái)驗(yàn)證：高、中、低濃度（20.00、5.00、0.625 μg﹒L-1）五味子醇乙QC樣品分別在室溫下放置12 h、‐80 ℃下凍存5天以及‐20 ℃反復(fù)凍融5次，通過(guò)以上三種不同的儲(chǔ)藏條件，驗(yàn)證該方法血漿樣品中五味子醇乙的穩(wěn)定性。

高、中、低濃度（20.00、5.00、0.625 μg﹒mL-1）五味子醇乙QC樣品分別在室溫下放置12 h、‐80 ℃下凍存5天以及‐20 ℃反復(fù)凍融5次的準(zhǔn)確度范圍為91.64～108.88 %，表明該方法的穩(wěn)定性良好。

3.1.5 回收率 取高、中、低濃度（20.00、5.00、0.625 g﹒mL-1）五味子醇乙QC樣品，每個(gè)濃度平行制備5份，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算出實(shí)際濃度，實(shí)際濃度與理論濃度的比值即為回收率。五味子醇乙在高、中、低三個(gè)QC樣品濃度下（20.00、5.00、0.625 μg﹒mL-1）回收率分別為101.36±12.20 %、102.91±12.19 %和113.71±7.69 %，其回收率均大于80%且小于120%，表明此方法回收率良好。

3.1.6 基質(zhì)效應(yīng) 取高、中、低濃度（20、5、0.625 g﹒mL-1）五味子醇乙QC樣品，每個(gè)濃度平行制備5份，得到含有大鼠空白血漿基質(zhì)的峰面積A；同時(shí)利用蒸餾水代替大鼠空白血漿，按照相同方法，制備不含有大鼠空白血漿的高、中、低濃度（20.00、5.00、0.625 g﹒mL-1）五味子醇乙樣品，每個(gè)濃度平行制備5份，進(jìn)樣分析，得到不含大鼠空白血漿基質(zhì)的峰面積B。

根據(jù)上述方法得到的色譜峰面積，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)因子（matrix infactor, MF）：基質(zhì)效應(yīng)因子=峰面積A/峰面積B；內(nèi)標(biāo)歸一的MF=五味子醇乙的MF/內(nèi)標(biāo)的MF

結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，內(nèi)標(biāo)歸一化的MF的變異系數(shù)均小于15 %，說(shuō)明該方法符合生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，基質(zhì)對(duì)于實(shí)驗(yàn)樣品中化學(xué)成分的測(cè)定沒(méi)有影響。

3.1.7 血漿中殘留評(píng)價(jià) 取標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度樣品（25 μg﹒L-1），與50 %A流動(dòng)相和50 %B流動(dòng)相制備的空白樣品交叉連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，評(píng)估五味子醇乙在色譜柱中殘留行為。結(jié)果顯示，五味子醇乙和內(nèi)標(biāo)血漿樣品在該方法中殘留低，不影響樣品色譜峰，實(shí)驗(yàn)方法符合生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則。

3.2 藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

3.2.1 五味子醇乙藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果 五味子醇乙在心肌缺血模型和正常大鼠血漿中的血藥-濃度曲線圖如圖2所示，從圖可以看出，在灌胃給予生脈飲后，模型組與對(duì)照組相比血漿中五味子醇乙的最大濃度更高，吸收較快，藥時(shí)曲線面積更大。

通過(guò)PKSolver 2.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)擬合計(jì)算，五味子醇乙在大鼠體內(nèi)的代謝過(guò)程符合非房室模型，相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如表2所示。結(jié)果顯示心肌缺血大鼠與正常大鼠相比較Cmax、AUC (0-inf)、MRT (0-inf)、Vz/F增大，而Cl/F減小。

表2 模型組和對(duì)照組五味子醇乙的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(x±S, n=6)

4 討論

隨著對(duì)心肌缺血病因、發(fā)病機(jī)制等研究的深入，心肌缺血模型建立方法以及評(píng)價(jià)指標(biāo)逐步完善，心肌缺血模型可分為：急性心肌缺血模型、慢性心肌缺血模型、可控性心肌缺血模型和離體心肌缺血模型[1]。急性心肌缺血模型是基于臨床心肌缺血特點(diǎn)而建立的一種短期的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，一般通過(guò)手術(shù)或者藥物進(jìn)行造模。但手術(shù)造模存在操作要求高，且易造成動(dòng)物死亡的問(wèn)題。因此本實(shí)驗(yàn)采用尾靜脈注射垂體后葉素進(jìn)行藥物造模，垂體后葉素可引起冠狀動(dòng)脈痙攣，血管外周阻力增大，心肌細(xì)胞的負(fù)荷增加，從而出現(xiàn)心機(jī)供血不足造成心肌缺血，該方法的操作簡(jiǎn)便有效且比較接近人心絞痛的病理狀態(tài)[10]。垂體后葉素制備心肌缺血模型時(shí)的劑量通常為0.6-1.5 U﹒kg-1[11、12]，但預(yù)實(shí)驗(yàn)采用1.0 U﹒kg-1劑量制備時(shí)，發(fā)現(xiàn)大鼠維持心肌缺血的心電圖表現(xiàn)時(shí)間較短，不能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，因此正式實(shí)驗(yàn)采用2.0 U﹒kg-1[13]垂體后葉素制備心肌缺血大鼠模型，心電圖的各段指標(biāo)符合心肌缺血大鼠模型的要求，認(rèn)為建模成功。

運(yùn)用PKSolver 2.0處理五味子醇乙的血藥濃度，擬合得到五味子醇乙在大鼠體內(nèi)的過(guò)程符合非房室模型，通過(guò)比較正常組和模型組大鼠，五味子醇乙在心肌缺血模型大鼠的Cmax、AUC (0-inf)、MRT(0-inf)、Vz/F增大，而Cl/F減小，說(shuō)明五味子醇乙在心肌缺血大鼠中吸收度好、體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)，清除率小，更說(shuō)明了生脈飲在治療心肌缺血方面的合理性，符合臨床上使用生脈飲用于治療心系疾病。