脂肪干細(xì)胞抑制炎癥對緩解兔耳增生性瘢痕形成效果研究

楊玲玲， 黃 悅， 王洪一， 白澤明， 韓子陽， 劉芮嫡， 陶 凱

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 燒傷整形科，遼寧 沈陽 110016

創(chuàng)面愈合的過程需要多種細(xì)胞、因子和介質(zhì)的參與，愈合過程中任何一個階段發(fā)生異常都可能導(dǎo)致瘢痕的形成。愈合過程中的炎癥期會有大量炎癥因子的釋放，炎性細(xì)胞通過細(xì)胞介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化，成纖維細(xì)胞也會反過來調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)一步參與炎癥反應(yīng)[1]。白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)在炎癥期均發(fā)揮重要的作用，因此，在增生性瘢痕有關(guān)的炎癥因子表達(dá)的相關(guān)研究中，這些因子是研究的重點(diǎn)[2-5]。適度的炎癥反應(yīng)對于創(chuàng)面修復(fù)是有利的，但是，炎癥反應(yīng)過度可能誘發(fā)增生性瘢痕的產(chǎn)生。目前，有學(xué)者提出，抑制炎癥反應(yīng)可能會對增生性瘢痕的治療發(fā)揮一定作用[4]。Xie等[6]研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞具有促進(jìn)傷口愈合并且減少瘢痕增生的作用，脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)也已經(jīng)被證明可以參與組織和器官的損傷和修復(fù)，具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。但是，ADSCs對于病理性瘢痕的作用機(jī)制目前仍在研究中。本研究通過建立兔耳增生性瘢痕模型，探討ADSCs是否可以通過抑制增生性瘢痕炎癥的發(fā)生，發(fā)揮抑制增生性瘢痕的作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 兔脂肪源性干細(xì)胞提取 選取20只清潔級新西蘭大白兔，體質(zhì)量為2.5～3.5 kg，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)動物中心。購入后調(diào)整性飼養(yǎng)1周，環(huán)境條件為(25℃±1℃)、濕度為55%～65%，飲食、進(jìn)水均自由。將購買的大白兔分開飼養(yǎng)1周，讓其適應(yīng)環(huán)境，然后開始實(shí)驗(yàn)。取2只清潔級新西蘭大白兔，麻醉后獲取兔左側(cè)腹股溝的皮下脂肪組織，用PBS反復(fù)沖洗脂肪組織，至無血色為止。將組織裝至50 ml離心管中，1 200 r/min離心5 min。棄去油脂層，將脂肪層重新收集至離心管中。使用0.125%濃度的Ⅰ型膠原酶按1∶1比例加入脂肪組織，放入5% CO2培養(yǎng)箱中消化2 h，期間每15 min取出搖勻1次。脂肪消化成黏糊狀，1 200 r/min離心15 min。離心后使用生理鹽水重懸脂肪細(xì)胞，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)，取3～7代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測 取第3代的ADSCs，用1% PBS沖洗2～3次，加入適量0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞3～5 min，然后加培養(yǎng)基終止消化。離心(100 g，1 500 r/min，10 min)。棄去上清，加入生理鹽水重懸細(xì)胞。將細(xì)胞(1.0×106個/ml)轉(zhuǎn)入EP管中，每管100 μl，然后加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的CD45和CD73及PE標(biāo)記的抗體CD34和CD90，每管5 μl。對照組加入5 μl相對應(yīng)的同型對照IgG1-FITC、IgG1-PE，4℃避光孵育30 min。4℃離心(100 g，1 000 r/min，5 min)。棄去上清，生理鹽水重懸細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀檢測CD34、CD45、CD73、CD90表面標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.3 兔耳增生性瘢痕模型建立及治療 分別在18只大白兔雙耳腹側(cè)設(shè)計4個大小為1.5 cm×1.5 cm的方形切口線，切口間距1.0 cm。常規(guī)手術(shù)消毒兔耳腹側(cè)，然后行腫脹麻醉液的配置，術(shù)區(qū)局部麻醉滿意后，使用尖刀片沿著已經(jīng)設(shè)計好的切口線將兔耳全層皮膚至軟骨膜切開，至軟骨表面后進(jìn)行剝離，然后將全部皮膚和軟骨膜逐一去除，切除過程中保持耳軟骨的完整。

建模成功后，將大白兔分為對照組(n=9)和治療組(n=9)。對照組：用 2 ml 注射器，從瘢痕四周正常皮膚約0.4 cm處刺入至瘢痕中央，每點(diǎn)注射0.3 ml生理鹽水。治療組：用2 ml 注射器，從瘢痕四周正常皮膚約0.4 cm處刺入至瘢痕中央，每點(diǎn)注射0.3 ml(1×105個)ADSCs。分別在術(shù)后即刻，術(shù)后1、3、5周注射4次。分別于術(shù)后1、3、5周將每組3只動物處死取材，取材時將瘢痕組織、瘢痕周圍部分正常皮膚軟組織及其下方的軟骨一起切除。每個標(biāo)本由中軸縱切均分為兩等份，一份組織放入10%中性甲醛溶液中固定，一份組織保存于液氮中。

1.4 HE染色 4%甲醇固定標(biāo)本24 h，沖洗干凈后分別用70%～100%濃度乙醇逐一脫去標(biāo)本中的水；浸蠟，包埋；標(biāo)本切片，切片厚度5 μm。切片在60℃條件下烘干，二甲苯脫蠟；70%～100%不同濃度乙醇干燥切片；蘇木精染色5 min；水清洗后使用伊紅進(jìn)行染色2 min；水漂洗后通過中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，200倍下拍照。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 將組織勻漿，使用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒按照說明書測定標(biāo)準(zhǔn)曲線后，在450 nm波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-6和TNF-α的含量。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 將組織裂解，氯仿抽提去除蛋白和DNA，異丙醇沉淀RNA，乙醇清洗沉淀，DEPC水溶解RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR試劑盒，在95℃ 30 s、變性95℃ 30s、退火55℃ 30 s、延伸72℃ 30 s的條件下進(jìn)行實(shí)時熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)。所用引物包括Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，COLⅠ)，正向引物：GAGGGCAACAGCAGGTTCACTTA，反向引物：TCAGCACCACCGATGTCCA；α-平滑肌肌動蛋白(alpha--smooth muscle actin，α-SMA)，正向引物：GACAATGGCTCTGGGCTCTGTAA，反向引物：TGTGCTTCGTCACCCACGTA；GAPDH，正向引物：GCACCGTCAAGCTGAGAAC，反向引物：TGGTGAAGACGCCAGTGGA。

2 結(jié)果

2.1 脂肪源性干細(xì)胞鑒定 與相應(yīng)的同型對照比較，ADSCs表面抗原CD73(99.9%)和CD90(99.9%)呈陽性表達(dá)，而CD34(2.09%)和CD45(1.36%)呈陰性表達(dá)，證明脂肪源性干細(xì)胞提取成功。見圖1。

圖1 ADSCs表面抗原標(biāo)志物的表達(dá)

2.2 ELISA測定ADSCs對炎癥因子的影響 與對照組相應(yīng)時間點(diǎn)比較，ADSCs作用1、3、5周時，組織中IL-6的表達(dá)均顯著下調(diào)，TNF-α的表達(dá)均被抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、3。

圖2 ADSCs對IL-6表達(dá)的影響(與對照組比較，①P<0.05) 圖3 ADSCs對TNF-α表達(dá)的影響(與對照組比較，①P<0.05)

2.3 ADSCs對組織中COLⅠ及α-SMA表達(dá)的影響 與對照組相應(yīng)時間點(diǎn)比較，ADSCs作用1、3、5周時，組織中COLⅠ和α-SMA的表達(dá)均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 ADSCs對組織中COLⅠ和α-SMA表達(dá)的影響(與對照組比較，①P<0.05)

2.4 HE染色觀察 ADSCs的添加可顯著降低組織中炎性細(xì)胞聚集的現(xiàn)象，對照組膠原錯亂排列的現(xiàn)象比較嚴(yán)重。見圖5。

圖5 HE染色觀察瘢痕組織情況(200倍；a.對照組1周時；b.治療組1周時；c.對照組3周時；d.治療組3周時；e.對照組5周時；f.治療組5周時)

3 討論

目前，對于病理性瘢痕的形成機(jī)制有很多猜想，例如免疫炎癥性因素，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)異常，細(xì)胞基質(zhì)異常等。有研究報道，抑制細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、抑制炎癥的進(jìn)展，可能是預(yù)防和治療病理性瘢痕的方法[7]。本研究通過進(jìn)行兔耳瘢痕實(shí)驗(yàn)，探討ADSCs對兔耳瘢痕中炎癥因子的影響，從而探討ADSCs對增生性瘢痕的可能防治機(jī)制。為了鑒定原代培養(yǎng)的ADSCs是否培養(yǎng)成功，本研究采用了流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞表面CD73和CD9陽性表達(dá)，而CD34和CD45陰性表達(dá)，提示ADSCs提取成功。

有研究報道，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)可以促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，但是，如果炎癥持續(xù)存在或者過度表達(dá)，可能會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，進(jìn)而造成增生性瘢痕的形成[8-9]。Xie等[8]指出，IL-6可吸引中性粒細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，TNF-α可促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞上，刺激局部炎癥反應(yīng)。因此，大量IL-6和TNF-α等炎癥因子的存在，使得炎癥反應(yīng)加重，最終誘導(dǎo)增生性瘢痕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADSCs可以顯著下調(diào)兔耳瘢痕組織中IL-6和TNF-α的表達(dá)，由此可見，ADSCs可能通過下調(diào)炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮抑制增生性瘢痕的作用。

與正常組織相比，增生性瘢痕中COLⅠ表達(dá)增多[10-13]。本研究通過實(shí)時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，ADSCs能夠顯著下調(diào)組織中COLⅠ的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制增生性瘢痕形成的作用。α-SMA可以促進(jìn)細(xì)胞移動和收縮，在創(chuàng)面收縮、瘢痕攣縮等增生性瘢痕病理性形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs可能通過增加肝細(xì)胞生長因子的分泌來介導(dǎo)下調(diào)成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)[11-12]。本研究結(jié)果也證明，ADSCs可有效抑制增生性瘢痕中α-SMA的積累。由此可見，ADSCs可以通過下調(diào)COLⅠ和α-SMA的表達(dá)，改善創(chuàng)面收縮與瘢痕攣縮，從而進(jìn)一步緩解增生性瘢痕的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，ADSCs能夠通過下調(diào)增生性瘢痕中炎癥因子的表達(dá)，抑制COLⅠ和α-SMA的含量，發(fā)揮抑制增生性瘢痕的作用。