結(jié)膜松弛癥結(jié)膜組織中彈力纖維結(jié)構(gòu)蛋白和交聯(lián)酶的表達(dá)

干靜云 李青松 詹月萍 符之瑄

【關(guān)鍵詞】結(jié)膜松弛癥;彈力纖維;彈力蛋白;原纖蛋白-1，賴(lài)氨酰氧化酶

【中圖分類(lèi)號(hào)】G644.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2026-5328（2022）03--01

結(jié)膜松弛癥是一種與年齡相關(guān)的疾病，因松弛及非水腫性的球結(jié)膜堆積在眼球和下眼瞼之間而引起[1]。透射電鏡下，彈性纖維由徑向排列的微纖維束圍繞無(wú)定型的彈性蛋白核心構(gòu)成[2]。彈性蛋白原通過(guò)交聯(lián)而組裝成彈性蛋白，微纖維束則主要由原纖維蛋白家族[3]組成。當(dāng)身體發(fā)生貧血時(shí)，紅骨髓造血功能會(huì)代償性亢進(jìn)，以產(chǎn)生更多的紅細(xì)胞來(lái)糾正貧血。同理，我們提出彈性纖維也有類(lèi)似的代償機(jī)制。

為此，我們檢測(cè)了結(jié)膜松弛癥患者結(jié)膜組織中彈性蛋白、原纖維蛋白-1、賴(lài)氨酸氧化酶的表達(dá)。有趣的是，檢測(cè)結(jié)果與假設(shè)并不相符。

方法和材料：

共收集結(jié)膜組織標(biāo)本12例，標(biāo)本全部來(lái)自右眼，其中6例來(lái)自對(duì)照組;6例來(lái)自CCh組。CCh的診斷基于張興儒提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)。手術(shù)方法均選用新月形切除術(shù)。

免疫組織化學(xué)方法：將石蠟切片在65℃的恒溫烘箱中放置30 min。然后在二甲苯溶液中脫蠟。將脫蠟的載玻片分別置于100%乙醇，95%乙醇，85%乙醇和75%乙醇中5 min，然后用自來(lái)水洗滌10 min。將水合的載玻片在高壓下置于檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 6.0）中15 min，自然冷卻后，將其用0.02 M PBS洗滌3分鐘x 3次。然后將載玻片置于3%H2O2溶液中約10 min，并用0.02 M PBS溶液沖洗3分鐘x 3次。將一抗添加至玻片（選擇最佳稀釋比例），在濕盒中孵育，然后在室溫下放置1小時(shí)。用0.02M PBS沖洗載玻片3 min×3次。將HRP標(biāo)記的廣譜二抗添加至玻片，在濕盒中孵育，并在室溫下靜置20-30分鐘，然后用0.02 M PBS沖洗3 minx 3次。載玻片用DAB染色，當(dāng)其顏色改變時(shí)，立即用自來(lái)水清洗。用蘇木精對(duì)載玻片復(fù)染色，然后使其透明并密封。

總計(jì)進(jìn)行了彈性蛋白，原纖維蛋白-1和LOX的免疫組織化學(xué)染色。在一抗孵育的實(shí)驗(yàn)步驟中，需要分別添加相應(yīng)的抗體，其余步驟完全相同?？箯椥缘鞍祝ù鷄b21610）纖維蛋白-1（代碼ab53076）和LOX（代碼ab31238）的一抗來(lái)自英國(guó)的ABCAM公司。

在200倍顯微鏡下觀(guān)察經(jīng)HE染色和醛紅色染色的標(biāo)本的細(xì)胞和彈性纖維的形態(tài)。在200倍顯微鏡下拍攝免疫組織化學(xué)染色的石蠟切片，并從每個(gè)切片中拍攝三個(gè)不同部分的照片。使用Image-Pro-Plus 6.0軟件分析照片，并使用三個(gè)不同部分的光密度值的平均值代表結(jié)膜組織中每種蛋白質(zhì)的含量。

使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。測(cè)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

本研究遵循赫爾辛基宣言，均取得上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者的知情同意。

結(jié)果：

CCh組的6例患者中，男性3例，女性3例，年齡64-83歲（72.55±6.51）。對(duì)照組的6例患者中，男性2例，女性4例，年齡65-79歲（69.66±5.64）。

在200倍的顯微鏡下觀(guān)察HE染色的結(jié)膜組織，可見(jiàn)其上皮層為深紅色，上皮細(xì)胞核為藍(lán)色。對(duì)照組（A）的上皮層為扁平上皮細(xì)胞。相反，CCh組（B）的上皮層的層數(shù)明顯增加，并伴有角化不全（圖1）。

討論：

免疫組化結(jié)果表明和對(duì)照組比較，CCh患者結(jié)膜組織中結(jié)構(gòu)蛋白Elastin、Fibrillin-1的表達(dá)是降低的。Elastin由可溶性的前體-彈力蛋白原互相交聯(lián)裝配而成。在彈力蛋白原被釋放到細(xì)胞表面之前，彈力蛋白結(jié)合蛋白和彈力蛋白原結(jié)合，防止它在形成彈力蛋白前被破壞。它構(gòu)成彈力纖維的無(wú)定型蛋白核心。

結(jié)膜固有層中彈力纖維破壞后明顯減少可引起球結(jié)膜彈性下降、張力降低。進(jìn)而球結(jié)膜與眼球的附著力下降，在下瞼緣的反復(fù)擠壓下形成皺褶。結(jié)膜皺褶突出于眼球表面曲面，影響眼淚的流動(dòng)和淚河的形成。引起CCh患者的淚液排泄延緩和清除延遲。淚液清除延遲反過(guò)來(lái)又導(dǎo)致淚液中上述炎癥因子大量堆積，如此形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致結(jié)膜松弛不斷地加重和進(jìn)展。

由上可知，目前對(duì)CCh發(fā)病過(guò)程的認(rèn)識(shí)著重點(diǎn)在于彈力纖維的破壞、降解、變性。本研究的結(jié)果提示CCh發(fā)病機(jī)制不僅僅局限于彈力纖維降解的一面，還存在彈力纖維的合成不足的一面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明和對(duì)照組比較，CCh患者結(jié)膜組織中交聯(lián)酶Lox的表達(dá)是無(wú)差異的。賴(lài)氨酰氧化酶是一種銅依賴(lài)性胺氧化酶，其家族共有五個(gè)成員：Lox和賴(lài)氨酰氧化酶樣蛋白1-4（LOX-like proteins 1-4，Loxl1-4）。

LOX具有穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞表型、抗腫瘤和趨化作用。Elastin和膠原蛋白是LOX家族的特征性生理底物。通過(guò)此作用使Elastin和膠原蛋白發(fā)生共價(jià)交聯(lián)成彈力纖維和膠原纖維，彈力纖維和膠原纖維在LOX的作用下進(jìn)一步發(fā)生共價(jià)交聯(lián)成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。共價(jià)交聯(lián)為彈力纖維和膠原纖維提供大部分拉伸強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)完整性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果意味著它大概率并不涉及在CCh的發(fā)病機(jī)制中。

雖然參與彈力纖維合成的蛋白質(zhì)分子很多，但Elastin、Fibrillin-1、Lox在彈力纖維的裝配中起比較重要的作用。此外，研究成本和研究者的精力的限制使得它們被選作研究對(duì)象。

人體結(jié)膜組織菲薄，手術(shù)切除得到的離體標(biāo)本分量少，組織勻漿的量不足以進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法的檢測(cè)。它也不符合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的檢測(cè)條件。因?yàn)槊庖呓M化法可對(duì)蛋白進(jìn)行定性和定量研究，且特異性強(qiáng)，敏感性高，對(duì)目標(biāo)蛋白的行定位準(zhǔn)確，對(duì)組織標(biāo)本的大小無(wú)特殊限制和要求，最終本研究采用免疫組化法檢測(cè)Elastin、Fibrillin-1、Lox在結(jié)膜組織中的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hughes WL.Conjunctivochalasis[J].Am J Ophthalmol.1942;25：48-51.

[2]Gan JY，Li QS，Zhang ZY，et.al.The role of elastic fibers in pathogenesis of conjunctivochalasis[J].Int J Ophthalmol.2017;10（9）：1465-1473.DOI：10.18240/ijo.2017.09.21

[3]A.GARNER，R.A.ALEXANDER.Histochemistry of elastic and related fibres in the human eye in health and disease[J].Histochem J.1986;18：405-412.

*通訊作者：李青松（1969，11）女，博士，主任醫(yī)師，眼科主任，研究方向：眼表淚液學(xué)。

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