通塞宣肺合劑對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的防治作用研究

張帥　黃思詩(shī)　張榮昶　龔小妹

【摘 要】 目的：觀察通塞宣肺合劑對(duì)抗博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的防治作用。方法：18～22 g SPF級(jí)昆明種雄性小鼠48只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性組、通塞宣肺合劑高劑量組、通塞宣肺合劑中劑量組、通塞宣肺合劑低劑量組，每組8只。除空白組外，采用對(duì)小鼠鼻腔一次性滴注博萊霉素（6 mg/kg）建立肺纖維化動(dòng)物模型。各組于造模14 d后開(kāi)始相應(yīng)的藥物干預(yù)，空白組和模型組采用生理鹽水（NS）灌胃，陽(yáng)性組給予地塞米松（1 mg/kg/d）灌胃，其余各組每天分別給予高、中、低劑量制劑灌胃。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始測(cè)定小鼠體重，干預(yù)14 d后處死各組小鼠。肺組織勻漿測(cè)定羥脯氨酸（HYP）;ELISA法檢測(cè)肺組織中白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子（TNF-α）含量;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺組織TGF-β1mRNA表達(dá)水平。HE染色觀察肺組織病理切片，Masson染色觀察膠原纖維的分布情況。結(jié)果：與模型組比較，通塞宣肺合劑小鼠HYP、IL-4、TNF-α的的表達(dá)水平顯著性地降低（P<0.01），中、低劑量組也有一定的效果（P<0.05）;IL-10含量表達(dá)顯著性的增高（P<0.01），中、低劑量組也有一定的效果（P< 0.05）;HE和Masson染色顯示，通塞宣肺合劑高劑量組肺泡炎損傷和肺纖維化病變程度明顯減輕（P<0.01），效果最好。結(jié)論：通塞宣肺合劑可以通過(guò)抑制炎癥因子IL-4、TNF-α促炎癥細(xì)胞因子的釋放，提高IL-10的表達(dá)，降低HYP的含量發(fā)揮抗肺纖維化的作用，對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化具有一定的防治作用。

【關(guān)鍵詞】 通塞宣肺合劑;博萊霉素;肺纖維化

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A? 【文章編號(hào)】1007-8517（2022）07-0032-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究”專(zhuān)項(xiàng)“民族醫(yī)藥傳承研究”項(xiàng)目（2017YFC170 3901）;防城港市科學(xué)與技術(shù)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目科技基地與人才專(zhuān)項(xiàng)（防科AC21014042）;防城港市科學(xué)與技術(shù)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（防科字[2016]7號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：張帥（1989-），男，漢族，碩士研究生，副主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴?、京族醫(yī)藥制劑開(kāi)發(fā)及藥理作用研究。E-mail：yimingsir@163.com

通信作者：黃思詩(shī)（1984-），女，漢族，碩士研究生，講師，研究方向?yàn)橹兴幟褡逅幹苿┘八幚碜饔醚芯?。E-mail：237526977@qq.om

Study on Effect of Tongsai Xuanfei Prescription Mixture to Inhibit Bleomycin-induced Pulmonary Fibrosis in Mice

ZHANG Shuai1 HUANG Sishi^2*ZHANG Rongchang1 GONG Xiaomei3

1.Traditional Chinese Medicine Hospital of Fang Chenggang， Fangchenggang 538021，China;

2.Gungxi Medical College， Nanning 530000，China;3. Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530000，China

Abstract：Objective To explore the mechanism of Tongsai Xuanfei prescription in the treatment of pulmonary fibrosis （PF）. Methods 36 mouse were randomly divided into 6 groups， including model group， normal group， the positive drug group， Tongsai Xuanfei prescription high dose group，Tongsai Xuanfei prescription Middle-dose group and Tongsai Xuanfei prescription Low-dose group. Adopt the model of induce Pulmonary Fibrosis in mouse by disposable endotracheal injection of BLM （ bleomycin ） 6mg kg-1.d-1. Normal control group and model group were treated with normal saline. Hormone group was given subcutaneous of hydrocortisone while the rest groups were given corresponding medicines separately for 14 days after these models were established. 14 days after such intervention treatment， these 5 groups of mouse were killed to detect the lung tissue expression of IL-4，IL-10，TNF-α levels in each group rats by ELISA and observe the ultrastructure of the lung tissue through electron microscopy. Colorimetric method was used to measure the content of hydroxyproline （HYP） in lung. At the same time， to observe the spirit，activity and weight of all rats before and after molding and drug intervention.Results The expression levels of HYP， IL-4 and TNF-α in the high-dose group of Tongsaixuan Pills were significantly decreased （P<0.01）， and the low-dose group also had a certain effect（P<0.05）; IL-10 The expression of the content was significantly increased （P<0.01）， and the low-dose group also had a certain effect （P<0.05）. Tongsai Xuanfei prescription group could significantly relieved inflammation and restrained the degree of pulmonary fibrosis （P<0.01）. High-dose group is the best. Conclusion Tongsai Xuanfei prescription can inhibit the release of pro-inflammatory cytokines， exert anti-inflammatory effects， promote the degradation of extracellular matrix， and thus exert anti-pulmonary fibrosis effect. It has a certain preventive effect on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice.3A0B8894-9639-4E9B-B6A3-7AAD05FEE087

Key words：Tongsai Xuanfei Prescription Mixture; Bleomycin; Pulmonary Fibrosis

肺纖維化（Pulmonary fibrosis，PF）是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨的治療難題，作為慢性復(fù)雜類(lèi)疾病之一，發(fā)病率和致死率都較高，其發(fā)病機(jī)制并不清楚，好發(fā)于中老年，生存周期短，生存質(zhì)量低^[1-2]。目前對(duì)于肺纖維化最有效的方法就是肺移植，但是肺移植手術(shù)價(jià)格昂貴，肺供體稀缺，在臨床上推廣使用較少。臨床實(shí)踐和現(xiàn)代試驗(yàn)表明中醫(yī)藥對(duì)防治肺纖維化具有一定的優(yōu)勢(shì)，可以改善患者的生活質(zhì)量。中醫(yī)將肺纖維化歸于“肺痿”“肺痹”“肺脹”等范疇^[3-5]。中醫(yī)認(rèn)為肺間質(zhì)纖維化主要發(fā)病機(jī)制是氣虛血瘀、痰熱互結(jié)痹阻肺絡(luò)。通塞宣肺合劑由牛大力、黃芪、三七、芒果葉組成。牛大力、黃芪性溫而味甘，歸肺、脾、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣潤(rùn)肺之效;三七活血化瘀，芒果葉清熱祛痰止咳，全方共奏補(bǔ)肺益腎，止咳祛痰，活血化瘀之功。現(xiàn)代研究^[6-7]表明黃芪、三七、芒果葉對(duì)肺纖維化都有一定的干預(yù)作用。本研究通過(guò)觀察通塞宣肺合劑對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的炎癥因子影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡昆明種雄性小鼠，體重18～22 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。合格證號(hào)：scxk桂2016-0002。

1.2 藥物與試劑 注射用鹽酸博萊霉素（批號(hào)：210082，日本化藥株式會(huì)社）;乙醚（批號(hào)：ws20050411，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;黃芪（批號(hào)：130901）、三七（批號(hào)130902）、芒果葉（自采）經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室覃文慧鑒定為正品。鹽酸（成都科龍化學(xué)試劑有限公司）;冰乙酸（AR）（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;地塞米松磷酸鈉注射液（批號(hào)：130608，廣州白云山天心制藥股份有限公司）。羥脯氨酸（HYP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）;IL-4、TNF-α試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 儀器 BX60顯微鏡（OLYMPUS）、TGL-16B和TGL-16C型高速臺(tái)式離心機(jī)、高速低溫離心機(jī)（Heraeus LG16-W）、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Epoch Biotek公司）、TU-1901/1900 紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）、EL204電子天平（ 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、GZX-DH·400型電熱恒干燥箱（上海躍進(jìn)公司）、HH·B11·360型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)公司）、BX-60型研究級(jí)顯微鏡（OLYMPUS ）、YQ-3勻漿器;德國(guó)Leitz1512型石蠟切片機(jī);病理圖像分析儀（德國(guó)Leica公司）。

1.4 造模與分組 取6～8周健康昆明種雄性小鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組8只，空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽(yáng)性組（地塞米松）、通塞宣肺合劑制劑高劑量組、通塞宣肺合劑制劑中劑量組、通塞宣肺合劑制劑低劑量組。各組小鼠乙醚麻醉后，仰位固定，用手托住小鼠呈直立狀，配合小鼠呼吸，從鼻腔緩慢滴入無(wú)菌鹽酸博萊霉素溶液（6 mg/kg），空白組滴入等量無(wú)菌生理鹽水，滴完后保持直立20 s，連續(xù)觀察14 d，小鼠出現(xiàn)咳嗽、乏力、冷顫現(xiàn)象，模型即建立完成。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 各組于造模14 d后開(kāi)始相應(yīng)的藥物干預(yù)，空白組和模型組采用生理鹽水（NS）灌胃，陽(yáng)性組給予地塞米松（1 mg/kg）灌胃，其余各組每天分別給予通塞宣肺合劑高劑量組（5.00 mg/kg）、通塞宣肺合劑中劑量組（3.30 mg/kg）、通塞宣肺合劑低劑量組（1.65 mg/kg）灌胃。

1.6 觀察指標(biāo) 各組小鼠分別于造模后第28天采集標(biāo)本摘眼球取血后靜置析出血清后，于4 ℃離心機(jī)以3000 rpm離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)定指標(biāo)用。打開(kāi)小鼠胸腔，取出左側(cè)肺組織保存至-80 ℃冰箱，分別用 ELISA法檢測(cè)肺組織中白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）和腫瘤壞死因子（TNF-α）含量水平，堿水解法測(cè)定肺組織中羥脯氨酸（HYP）的含量。操作按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

肺右大葉固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟處理，分別用HE和Masson染色觀察肺組織病理改變以及肺纖維化程度。HE染色病理切片（Szapiel方法）分為4級(jí)。I級(jí)（0分）：無(wú)肺泡炎癥;II級(jí)（1分）：輕度肺泡炎癥，單核細(xì)胞浸潤(rùn)使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積小于全肺的30%，肺泡結(jié)構(gòu)一般正常;III級(jí)（2～3分）：中度肺泡炎癥，受累面積占全肺的30%～70%，近胸膜部比較嚴(yán)重;IV級(jí)（4分）：重度肺泡炎癥，受累面積大于70%，偶然會(huì)見(jiàn)到肺泡腔內(nèi)有單核細(xì)胞和出血造成的實(shí)質(zhì)性變化。

Masson染色病理切片，將肺纖維化程度分4級(jí)。I級(jí)（0分）：無(wú)肺纖維化;II級(jí)（1分）：輕度肺纖維化，受累面積小于20%;III級(jí)（2分）：中度肺纖維化，受累面積占全肺的20%～50%;IV級(jí)（3分）：重度肺纖維化，受累面積大于50%，肺泡結(jié)構(gòu)比較紊亂。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。等級(jí)計(jì)數(shù)資料轉(zhuǎn)化為計(jì)量資料，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間差異進(jìn)行單因素方差分析，P<0.01表示差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況 空白組小鼠皮毛健康無(wú)松散，具光澤，體重逐漸增加，呼吸平穩(wěn)，未有咳嗽現(xiàn)象;模型組小鼠剛剛造模后會(huì)出現(xiàn)撓頭、躁動(dòng)不安現(xiàn)象，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，體重會(huì)下降;精神萎靡不振;毛發(fā)松散，無(wú)光澤;呼吸困難、急促，偶有喘鳴聲，多有咳嗽;用藥組小鼠的一般狀況較模型組好。與空白組小鼠比較，模型組體重下降相對(duì)比較明顯（P<0.01），其余各組小鼠的體重均呈現(xiàn)出了不同程度的減輕;陽(yáng)性組、通塞宣肺合劑高劑量組小鼠體重較模型組增加（P<0.05）。見(jiàn)表1、圖1。3A0B8894-9639-4E9B-B6A3-7AAD05FEE087

2.2 各組小鼠肺組織中HYP、IL-4 、IL-10、TNF-α的含量 通塞宣肺合劑高劑量組小鼠HYP、IL-4、TNF-α的表達(dá)水平顯著性地降低（P<0.01），中、低劑量組有所降低（P<0.05）;IL-10含量表達(dá)顯著性的增高（P<0.01），中、低劑量組有一定的效果（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組小鼠肺組織中TGF-β1mRNA的表達(dá)水平 通塞宣肺合劑高劑量組小鼠TGF-β1mRNA的表達(dá)水平顯著性地降低（P<0.0 1），中、低劑量組有所降低（P<0.05），低劑量組有一定的效果（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)照組肺結(jié)構(gòu)清晰，肺泡上皮細(xì)胞、肺間質(zhì)血管上皮細(xì)胞未見(jiàn)或少見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管、肺泡、血管壁均未見(jiàn)膠原纖維明顯增生;肺泡炎癥與肺纖維化程度評(píng)分均為0分;模型組小鼠均有肺泡炎，表現(xiàn)為肺泡充血、水腫，部分肺泡有透明膜形成，肺泡上皮細(xì)胞有中至重度損傷，肺泡炎稍減輕;肺纖維化程度最重，多呈III級(jí)肺纖維化變化，膠原纖維組織增生、變厚，肺氣腫嚴(yán)重;肺泡炎癥與肺纖維化程度評(píng)分均為3分，與對(duì)照組比較，差異顯著（P<0.01）。各給藥組肺泡炎癥與肺纖維化程度均有明顯的改善，評(píng)分均為2分，與模型組比較，差異顯著（P<0.01）。肺組織病理學(xué)分析結(jié)果如圖1、圖2和表4所示。

3 討論

肺纖維發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，臨床對(duì)肺纖維化的治療仍然是一個(gè)難題，中藥復(fù)方對(duì)防治肺纖維化具有一定的優(yōu)勢(shì)。通塞宣肺合劑是按照肺纖維化氣虛、血瘀、痰熱的機(jī)理組成的經(jīng)驗(yàn)用方，由牛大力、黃芪、三七、芒果葉組成，牛大力、黃芪性溫而味甘，歸肺、脾、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣潤(rùn)肺之效;三七活血化瘀，芒果葉清熱祛痰止咳，全方共奏補(bǔ)肺益腎，止咳祛痰，活血化瘀之功。

肺纖維化是由于細(xì)胞外基質(zhì)和成纖維細(xì)胞過(guò)度沉積而導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)異常修復(fù)的一類(lèi)疾病^[8-9]。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要有形成分，肺內(nèi)結(jié)締組織的成分絕大部分是膠原，它分布于肺泡壁、支氣管、胸膜和血管等所有肺組織中，因此膠原的異常沉積是肺纖維化的標(biāo)志性改變^[10]。肺纖維化中由于細(xì)菌、病毒等多種致病因素的作用，導(dǎo)致肺泡炎癥細(xì)胞分泌多種生物活性物質(zhì)，誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞合成、分泌大量的膠原成分，使得肺中膠原的合成速度大于降解速度，膠原纖維明顯增多，從而導(dǎo)致膠原的逐漸積累，以上構(gòu)成了肺纖維化的病理學(xué)基礎(chǔ)^[11]。而 HYP 是膠原中的一種特有的氨基酸，在膠原蛋白中含量約占 13%～14%，在彈性蛋白中占極少量，在其它蛋白中則不存在，因此當(dāng)膠原代謝發(fā)生異常時(shí)，組織內(nèi) HYP 含量發(fā)生相應(yīng)的變化，在膠原蛋白水平檢測(cè)方面，HYP的含量可作為特異性的判斷纖維化程度的指標(biāo)^[12-13]。

TNF-α是TH1細(xì)胞分泌的促炎癥因子，可加速中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的增殖， 加速炎癥反應(yīng)，加快肺纖維化的形成;TNF-α還能促進(jìn)IL- 4的生成，激活成纖維細(xì)胞^[14-16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通塞宣肺合劑能夠降低IL-4的含量，同時(shí)減少I(mǎi)L-10的水平，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。通過(guò)對(duì)各組小鼠一般狀態(tài)觀察分析，用藥組小鼠體重、精神狀態(tài);毛發(fā)光澤和組織切片觀察HE染色、Masson染色觀察;呼吸狀況等方面較模型組好，從整體上反映出通塞宣肺合劑對(duì)肺纖維化小鼠有一定的治療作用。表明了通塞宣肺合劑能在一定程度地抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制膠原纖維的沉積，從而起到了防治肺間質(zhì)纖維化的作用，縮短了病變的進(jìn)程，可以用于阻逆早期纖維化。

參考文獻(xiàn)

[1]卞玉凡，李京，趙春江，等.小青龍湯對(duì)肺纖維化大鼠肺組織的改善作用及機(jī)制研究[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2018（4）：17-20.

[2]李瑩瑩，陳煒.基于氣血理論論治特發(fā)性肺纖維化[J].陜西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019（2）：26-28.

[3]王鶴，張廣平，侯紅平，等.博來(lái)霉素不同給藥方式致大鼠肺纖維化模型探討[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019（11）：1-11.

[4]顧燕蘭，張雅琴，孫鋼.莪術(shù)醇對(duì)大鼠肺纖維化模型的干預(yù)作用及對(duì)TGF-β1和PAI-1表達(dá)的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2019，25（10）：27-31.

[5]岳崇梅，王宋平，任成果.氯沙坦對(duì)百草枯中毒大鼠急性肺損傷及肺纖維化的干預(yù)作用[J].臨床肺科雜志，2018，23（12）：2163-2169.

[6]李紅，王勝，沈明霞，等.黃芪甲苷對(duì)特發(fā)性肺纖維化模型大鼠肺組織堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）表達(dá)的影響[J].西部中醫(yī)藥，2015，28（12）：21-24.

[7]孫曉芳，楊會(huì)慈，段斐，等.三七總皂苷對(duì)博萊霉素致小鼠肺組織蛋白酶K表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（1）：53-55.

[8]欒智華，任晉宏，薛慧清，等.黃芪糖蛋白對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的治療作用及機(jī)制[J].世界中醫(yī)藥，2018，13（9）：2276-2280.

[9]冀會(huì)鴿，李亞，余學(xué)慶.中醫(yī)藥干預(yù)肺纖維化相關(guān)信號(hào)通路研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2019，17（4）：124-126.

[10]劉淼，廖尖兵，王文譞，等.特發(fā)性肺纖維化中醫(yī)發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2018，24（8）：82-84，87.

[11]馬瑞敏，葉俏.肺纖維化相關(guān)脂類(lèi)和氨基酸類(lèi)代謝物研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2021，35（11）：852-858.

[12]王琦，趙亞茜，諶曉莉，等.中醫(yī)治療肺纖維化的研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)學(xué)，2021，27（10）：1751-1753.

[13]代瑜，肖書(shū)熠，齊鳳軍.從中醫(yī)瘀病角度辨治特發(fā)性肺纖維化[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，40（5）：572-577.

[14]高風(fēng)麗，孫麗麗，李竹英.中藥對(duì)肺纖維化相關(guān)機(jī)制調(diào)控的研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥雜志，2021，55（9）：91-95.

[15]谷長(zhǎng)宏.芪術(shù)肺纖湯聯(lián)合吡非尼酮對(duì)氣虛血瘀型特發(fā)性肺纖維化患者實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)、癥狀積分及生活質(zhì)量的影響[J].四川中醫(yī)，2018，36（9）：75-77.

[16]榮寧，田偉峰.肺痿方離子導(dǎo)入對(duì)特發(fā)性肺纖維化患者肺功能及血清炎癥因子的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，23（11）：112-114.

（收稿日期：2021-08-20 編輯：劉 斌）3A0B8894-9639-4E9B-B6A3-7AAD05FEE087