葛藤莖揮發(fā)油成分分析及葛根總黃酮提取工藝研究

唐婷范，朱家慶，周萌琳，黃芳麗，黃華杰，程昊

(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院 廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006)

葛根和葛藤莖具有較高的營養(yǎng)價值，其蘊含豐富的活性成分，對人體大有裨益。一株完整的葛藤包括莖、葉、花、果四部分，靠近根部的葛藤莖屬于莖葉中最為粗壯的部分，為半木質(zhì)化狀態(tài)，可供藥用?，F(xiàn)挖掘出的葛根和葛藤莖的活性成分有揮發(fā)油類和黃酮類等[1-3]。仰玲玲等[4]在野葛藤莖內(nèi)發(fā)現(xiàn)153個揮發(fā)油成分，并成功鑒定出64個，其中以烷酸和烯酸類化合物含量最高，占鑒定出成分的69.72%。葛根在心腦血管方面的功效得益于其含有的黃酮類化合物尤其是葛根素，能活化血管的管壁，增強血管的擴張能力和韌性，改善大腦血液循環(huán)活動，預(yù)防因血小板凋亡或局部凝集引起的血栓等[5]。Wang等[6]的研究結(jié)果顯示，葛根素能夠使破骨細胞進行骨吸收時被抑制，胎鼠體外的骨發(fā)育能力得到增強，從而進一步證明葛根素具備促進大鼠成熟骨細胞的增殖和分化的作用。

當(dāng)前，中外對葛根的化學(xué)活性成分鉆研主要聚集在葛藤根部上，對此已有較多研究成果，而對葛藤莖部則研究有限，在對葛根的采收上，葛藤莖無不是被當(dāng)作無效部位而丟棄，這何嘗不是另一種資源的浪費[7]。另外，黃酮的提取方法多種多樣，有溶劑提取法、微波提取法、超聲波提取法等[8-10]。所以，有必要對葛藤莖揮發(fā)油類物質(zhì)以及葛根中黃酮物質(zhì)提取進行研究探索，明確葛藤莖的揮發(fā)油成分及研究葛根的提取工藝的重要意義，為以后研發(fā)新的葛根及葛藤莖產(chǎn)品提供理論依據(jù)。因此，實驗選取新鮮葛藤莖和葛根，以水蒸氣蒸餾法提取新鮮葛藤莖的揮發(fā)油，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)分析鑒定其化學(xué)組分[11]。另外，以總黃酮的得率為指標(biāo)，采用超聲波輔助提取葛根總黃酮。通過單因素實驗考察對黃酮得率的影響，并選用正交實驗，確定葛根總黃酮的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根及葛藤莖：廣西北海；蘆丁：南京奧多福尼生物科技有限公司；無水乙醇：成都市科龍化工試劑廠；亞硝酸鈉、三氯化鐵：臺山市粵僑試劑塑料有限公司；無水碳酸鈉、濃硫酸：廣東光華科技股份有限公司；乙醚、氫氧化鈉、六水合氯化鋁、無水硫酸鈉、九水合硝酸鋁：西隴科學(xué)股份有限公司。

JJ200電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠；AR124CN分析天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；GZX-GF101-4-S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海錦屏儀器儀表有限公司；V2000可見分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Trace 1300氣相色譜儀、ISQ QD單四極質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根原料預(yù)處理

選取新鮮葛根洗凈切片，烘箱烘干后研磨成粉末過20目篩，利用乙醇水溶液進行超聲輔助提取，抽濾后取上清液備用。

稱取剪碎的新鮮葛藤莖100 g，按固液比1∶10(g/mL)加入蒸餾水，用揮發(fā)油提取器進行提取，持續(xù)提取12 h，蒸出液用乙醚萃取，以無水硫酸鈉干燥，過濾后密封保存。

1.2.2 揮發(fā)油類物質(zhì)及黃酮類化合物檢測[12]

GC/MS條件：毛細管色譜柱HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣，流量1.0 mL/min；程序升溫：初始溫度為75 ℃，保持3 min后按8 ℃/min的速率升至220 ℃，汽化室溫度260 ℃；分流比25∶1；進樣口溫度為280 ℃，進樣量為1 μL。EI電離源，電子能量70 eV，接口溫度280 ℃，電子倍增器電壓1.5 kV，質(zhì)量掃描范圍50～550 amu，掃描方式為全掃描方式。

稱取2 g研磨后的葛根粉，加入60 mL 60%的乙醇，50 ℃超聲提取20 min，冷卻后抽濾，濾液定容到100 mL容量瓶中，獲得粗黃酮提取液。取潔凈的試管，分別向其中加入1.0 mL提取液，再分別向試管中加入少量的FeCl3、AlCl3、NaOH、Na2CO3、濃硫酸試劑，搖勻等待，觀察其顯色反應(yīng)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[13]

首先稱量10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品于干凈的燒杯中，加入60%乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，得0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液；再分別量取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL 0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液至10 mL容量瓶中，用60%乙醇補足至5.0 mL，搖勻后向容量瓶中加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min，再加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液定容至刻度線，搖勻靜置15 min后備用；最后在510 nm處測定其吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率實驗

精密度實驗：取葛根黃酮提取液2.0 mL，按照1.2.3進行操作，用分光光度計連續(xù)測定5次其吸光度。

穩(wěn)定性實驗：取葛根黃酮提取液2.0 mL，按照1.2.3進行操作，每間隔2 min測量提取液的吸光度值變化情況。

加標(biāo)回收率實驗：分別取葛根黃酮提取液2.0 mL定容至10 mL容量瓶中，再依次加入不同體積的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定溶液的吸光度，計算其加標(biāo)回收率。

1.2.5 葛根提取物總黃酮得率計算[14-15]

總黃酮得率的計算公式如下：

式中：A為溶液吸光度，V固液比為對應(yīng)固液比的體積。單因素實驗及正交實驗均用此計算公式。

1.2.6 單因素對葛根總黃酮得率的影響

以葛根總黃酮得率為指標(biāo)，采用單因素實驗研究乙醇濃度、固液比、超聲時間、超聲輸出功率、提取溫度對得率的影響。實驗水平分別選取乙醇濃度30%、40%、50%、60%、70%；固液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)；超聲時間20，40，60，80，100 min；超聲輸出功率200，250，300，350，400 W；提取溫度40，50，60，70，80 ℃。對影響因素進行初步優(yōu)化，確定較佳因素實驗參數(shù)范圍。

1.2.7 正交實驗的建立

以單因素實驗的結(jié)果為依據(jù)，從乙醇濃度、固液比、超聲時間、超聲輸出功率、提取溫度5個因素中，選中因素的最優(yōu)條件和相鄰的兩個條件進行正交實驗，正交實驗因素水平的選取見表1。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2019和Origin 2018進行數(shù)據(jù)處理與分析，每次測3次，取平均值計算，并繪制圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC/MS結(jié)果分析

葛藤莖揮發(fā)油總離子流圖見圖1。

圖1 葛藤莖揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile oils fromPueraria lobata stems

使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)對葛藤莖揮發(fā)油進行總離子質(zhì)譜檢測，用計算機對各峰質(zhì)譜圖在質(zhì)譜庫NIST17 Search和AMDIS中進行標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索并結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律，鑒定出10種主要的組分，并利用峰面積歸一化法計算出各組分的相對含量，結(jié)果見表2。鑒定出的組分占總體的83.94%，其中醇類(5個，見表2中序號3，4，5，6，7)占49.68%，酯類(2個，見表2中序號9，10)占15.85%，烷類(2個，見表2中序號1，2)占5.81%，酚類(1個，見表2中序號8)占12.60%。

表2 葛藤莖揮發(fā)油成分及相對含量Table 2 Components and relative content of volatile oils from Pueraria lobata stems

由此可看出構(gòu)成該葛藤莖的揮發(fā)油成分以醇類和酯類為主，尤其藍桉醇的含量最高，達到了31.30%，葛藤莖散發(fā)的香味可能也與富含醇類與酯類有關(guān)。

2.2 黃酮類化合物檢測結(jié)果分析

表3 顯色反應(yīng)結(jié)果分析Table 3 Analysis of chromogenic reaction results

由表3可知，葛根粉的提取液與黃酮類物質(zhì)的顯色反應(yīng)現(xiàn)象相似，多數(shù)黃酮類化合物都含有酚羥基，可與氯化鐵溶液發(fā)生陽性反應(yīng)而顯色。在堿性試劑，如氫氧化鈉、碳酸鈉溶液中被開環(huán)，羥基被氧化而顯色。還與鋁鹽發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)而顯色等，故可以得出葛根提取物中含有黃酮類化合物的結(jié)論。

2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程結(jié)果分析

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Rutin standard curve

由圖2可以計算出標(biāo)準(zhǔn)方程式為：Y=11.146X-0.006，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，說明在濃度范圍0.01～0.07 mg/mL之間，線性關(guān)系良好。

2.4 精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率結(jié)果分析

表4 精密度實驗結(jié)果分析Table 4 Analysis of precision experiment results

表5 穩(wěn)定性實驗結(jié)果分析Table 5 Analysis of stability experiment results

由表4可知，精密度實驗的RSD值為0.227%，表明該方法精密度較好。由表5可知，20 min內(nèi)葛根黃酮提取液的平均吸光度為0.241，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.23%，說明該方法的穩(wěn)定性良好。

表6 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果分析Table 6 Analysis of recovery rate experiment results

由表6可知，葛根黃酮提取物的平均加標(biāo)回收率為98.64%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.86%，表明該方法真實可靠，可用于測量葛根中總黃酮含量。

2.5 單因素實驗結(jié)果分析

2.5.1 乙醇濃度對總黃酮得率影響結(jié)果分析

由圖3可知，葛根總黃酮的得率受乙醇濃度影響較大，隨著乙醇濃度的上升，得率也隨之上升，這是由于乙醇濃度增大，黃酮類化合物的溶解量也隨之增大，在乙醇濃度為40%時得率最大，達到0.795%，隨后乙醇濃度繼續(xù)增加得率反而減小，這可能是由于葛根總黃酮也有部分水溶性的成分存在，在較高的提取介質(zhì)中溶解量下降，影響了得率。故選擇40%乙醇作為葛根總黃酮的最佳提取介質(zhì)濃度。

2.5.2 固液比對總黃酮得率影響結(jié)果分析

圖4 固液比對葛根總黃酮提取的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on extraction of total flavonoids from Pueraria lobata roots

由圖4可知，固液比對總黃酮得率也有較大影響，固液比的增大促進了總黃酮得率的提高。在一定的溫度下，總黃酮的溶解量有限，當(dāng)增大固液比時，總黃酮的得率也隨之提高，當(dāng)固液比達到1∶30(g/mL)時，溶解量達到最大，得率也達到了最大值0.813%，繼續(xù)增大固液比得率反而下降，可能是在該溫度下植物細胞壁未被破壞，總黃酮的溶解量不再增大反而被稀釋，綜合之下，確定葛根總黃酮的最佳提取固液比為1∶30(g/mL)。

2.5.3 超聲時間對總黃酮得率影響結(jié)果分析

圖5 超聲時間對葛根總黃酮提取的影響Fig.5 Effects of ultrasonic time on extraction of total flavonoids from Pueraria lobata roots

由圖5可知，在20～60 min內(nèi)，總黃酮得率相對平緩，但總體仍隨超聲時間的延長而上升，在60 min時達到最大值，為0.762%，而后得率下降，這可能是由于長時間的超聲作用使得大量細胞壁被破壞，大量物質(zhì)被溶出并糅雜在一起，從而影響了總黃酮得率。因此，選擇最佳的總黃酮超聲提取時間為60 min。

2.5.4 超聲輸出功率對總黃酮得率影響結(jié)果分析

圖6 超聲功率對葛根總黃酮提取的影響Fig.6 Effects of ultrasonic power on extraction of total flavonoids from Pueraria lobata roots

由圖6可知，隨著功率的增大，總黃酮也隨即被加速溶出，總黃酮得率在功率為300 W時達到最大值，為0.816%，但隨功率繼續(xù)增大得率反而降低，這可能是由于功率增大后，原先無法浸出的其他干擾物質(zhì)被加速浸出，大大降低了得率，故選擇300 W作為最佳的總黃酮提取功率。

2.5.5 提取溫度對總黃酮得率影響結(jié)果分析

由圖7可知，隨著溫度的逐漸升高，得率逐漸上升。這是由于溫度的升高會使黃酮類物質(zhì)的溶解量和浸出速率都有所提高，但溫度繼續(xù)提高時，得率趨于平緩，這可能是由于溫度過高使得部分黃酮類化合物被破壞，同時加速了細胞內(nèi)的非有效成分浸出，故選擇70 ℃作為總黃酮的最佳提取溫度。

圖7 提取溫度對葛根總黃酮提取的影響Fig.7 Effects of extraction temperature on extraction of total flavonoids from Pueraria lobata roots

2.6 正交實驗結(jié)果與分析

表7 實驗方案及實驗結(jié)果Table 7 Experimental scheme and results

由表7可知，超聲時間和固液比對葛根總黃酮的提取影響很大，超聲功率對總黃酮的提取影響較小，由極差R分析可知，對黃酮得率的影響次序為固液比>超聲時間>提取溫度=乙醇濃度>超聲功率，正交實驗以總黃酮得率為評價指標(biāo)，通過對比各個因素的指標(biāo)之和K1、K2、K3的最大值可知，最優(yōu)組合為A3B2C1D3E3，最優(yōu)工藝為：提取溫度80 ℃、乙醇濃度40%、超聲時間20 min、固液比1∶50(g/mL)、超聲功率300 W。

3 結(jié)論

由實驗分析結(jié)果可知，醇類化合物是新鮮葛藤莖中最主要的揮發(fā)性成分，占49.68%，其次為酯類化合物，占15.85%，酚類占12.60%，烷類占5.81%。另外，利用黃酮類化合物的顯色反應(yīng)現(xiàn)象對葛根中黃酮類物質(zhì)進行分析判定。選取蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣品，以亞硝酸鈉-硝酸鋁法作為顯色分析方法，通過分光光度計測量其吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=11.146X-0.006，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍是0.01～0.07 mg/mL，加標(biāo)回收率的RSD為1.86%。并以此計算葛根中總黃酮的含量。基于單因素實驗結(jié)果采用正交實驗法，優(yōu)化葛根中總黃酮的提取工藝，在此工藝下總黃酮的最高得率可達1.47%。