綠原酸脫除工藝對葵花蛋白功能性質影響的研究

王志鵬，王璐

(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

葵花籽是制油工業(yè)原料的重要來源之一，用于榨油的葵花籽占總產量的50%～55%[1]，所產生的葵花籽粕多用作生產飼料、葵花蛋白，用部分葵花籽粕代替豆粕生產高附加值的醬油，葵花籽粕釀制的醬油有特殊香氣，具有一定的防腐功能，可以減少對供應緊張的豆粕的需求。葵花蛋白的營養(yǎng)結構比例接近人體的需求，不僅沒有已知的毒性成分和抗營養(yǎng)因子，而且具有良好的消化率。同時，葵花蛋白具有優(yōu)異的功能和感官特性，可作為食品工業(yè)的風味保持劑。但是在食品加工處理過程中，由于其自身成分的交互作用，影響葵花蛋白的營養(yǎng)功能性質和感官特性，不僅會降低其在人體內的消化率，破壞其穩(wěn)定性，而且會縮短其儲存壽命。如葵花籽中存在殼和多酚，多酚的存在會導致葵花蛋白在堿性條件下提取時發(fā)生變色，生成綠色的產物從而影響葵花蛋白的感官特性[2]。多酚的存在不但會與賴氨酸和蛋氨酸等必需氨基酸相互作用，還會抑制蛋白酶活性[3-4]，引起消化不良及胃脹現象，降低葵花蛋白的營養(yǎng)價值，無法滿足現代食品開發(fā)的需要。

綠原酸作為葵花籽粕中主要的酚類物質，在葵花蛋白提取過程中會與蛋白質產生共價及非共價作用，其共價作用會不可逆地生成CGA-蛋白共價復合物，非共價作用會可逆地生成CGA-蛋白復合物。但綠原酸并不會全部與蛋白質發(fā)生反應，在不同的酸堿環(huán)境和不同綠原酸與蛋白質的相對濃度條件下，蛋白質與綠原酸結合位點的數目不同，因此在反應體系中會同時存在結合態(tài)和游離態(tài)的綠原酸。葵花蛋白與綠原酸形成CGA-蛋白復合物后，其平均相對分子質量和分子柔性發(fā)生改變，從而影響葵花蛋白的溶解性、乳化性、持水性和持油性[5-6]。因此，進一步探究綠原酸與葵花蛋白的不同結合狀態(tài)對葵花蛋白功能特性的影響具有十分重要的意義。

本研究采用不同的脫酚方式獲得葵花蛋白，并以堿溶酸沉法所得蛋白為對照，系統(tǒng)地研究綠原酸對葵花蛋白功能特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葵花籽仁：齊齊哈爾市甘南縣；綠原酸水解酶：日本天野酶制劑株式會社；綠原酸標準品(純度≥95%)：Sigma公司；大豆油：魯花，壓榨一級；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、乙腈(分析純)。

1.2 試驗儀器

1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；FW80型高速粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；Kjeltec 8200型自動凱氏定氮儀 丹麥福斯公司；S210-K型pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；Alpha 2-4/LSC型真空冷凍干燥機 北京思達興業(yè)儀器有限公司；CF15RX型高速冷凍離心機 Hitachi公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同工藝脫酚葵花蛋白的制備[7]

具體實驗參數：

篩選葵花籽：將去皮后的葵花籽放置于50 ℃的烘箱中烘干后脫脂3 h，自然干燥并粉碎得到葵花脫脂粕粉；

提取蛋白：將葵花脫脂粕粉以1∶10(m/V)料水比混合，并加入1 mol/L NaOH至溶液pH為8.5，然后放入水浴鍋(50 ℃)中水浴并攪拌2 h。利用離心機(4000 r/min)離心10 min，將上清液倒出并保留，再將沉淀物以1∶8(m/V)料水比洗滌，并重復上述操作，將2次離心出的上清液合并；

脫酚：將葵花脫脂粕粉以1∶5(m/V)料水比混合，將溫度升至30 ℃后，加入1 mol/L的HCl至溶液pH為6.5，加入1 U/g的酶，酶解3 h；

酸沉：將1 mol/L的HCl加入到酶解后的溶液中，調節(jié)溶液pH至4.5，利用離心機(4000 r/min)離心10 min，保留沉淀；

水洗：將沉淀以1∶10(m/V)料水比洗滌2次，利用離心機(4000 r/min)離心10 min，保留沉淀；

中和：將沉淀以1∶3(m/V)料水比加入去離子水，并加入1 mol/L NaOH至溶液pH為7.0左右；

干燥：利用真空冷凍干燥機將蛋白干燥，從而得到葵花蛋白。

工藝流程見圖1。

1.3.2 綠原酸含量的測定

參考GB/T 22250-2008和賈國凱等[8]的方法并稍加修改，利用高效液相色譜儀對綠原酸含量進行測定。

稱取0.1 g葵花蛋白置于離心管中，并加入30 mL 70%乙醇溶液，利用超聲波提取儀超聲提取30 min，利用離心機(3000 r/min)離心10 min，取上清液過0.45 μm水相濾膜待測。

色譜柱為Thermo Hypersil ODS-2 (250 mm×4.6 mm×5 μm)，流動相為0.4%磷酸與乙腈以83∶17體積比混合的溶液，流動相流動速度為1.0 mL/min，等梯度洗脫，色譜柱溫度為35 ℃，檢測波長為327 nm，進樣量為10 μL。橫坐標為綠原酸標準溶液的濃度，縱坐標為峰面積，標準曲線公式為y=26.678x-43.18，繪制標準曲線，并計算葵花蛋白中綠原酸含量。

1.3.3 溶解性的測定

參照郭曉歌等[9]的方法，將0.2 g葵花蛋白分散于15 mL 0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，分別加入1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH至溶液pH分別為2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，7.0，9.0，并定容至20 mL，然后置于水浴搖床振蕩30 min，利用離心機(3000 r/min)離心20 min。取上清液，用微量凱氏定氮法測定上清液和蛋白樣品中蛋白質含量，計算公式為：

1.3.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定

參照Pearce和Kinsella的方法比濁法[10]。將葵花蛋白加入到0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，制成1 g/L的蛋白溶液，然后將大豆油和蛋白溶液按照50∶150體積比進行混合。利用均質機(12000 r/min)將混合溶液均質1 min。分別在均質完成0 min和10 min時在底部取出50 μL的混合液，同時加入5 mL 1 g/L的SDS溶液并攪拌均勻。以1 g/L的SDS溶液為空白參比，在500 nm波長處測定其吸光值，重復測定3次，計算公式為：

式中：EAI為乳化活性指數(m2/g)；T=2.303；A0為均質完成0 min的吸光度值；C為蛋白溶液的濃度(g/mL)；Φ為溶液中油的體積分數，0.25；ESI為乳化穩(wěn)定性；A10為均質完成10 min的吸光度值。

1.3.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定

參照Motoi等[11]的方法。將葵花蛋白加入到0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，制成1 g/L的蛋白溶液。利用高速組織攪拌機(12000 r/min)將蛋白樣品溶液攪拌1 min。利用攪拌后泡沫體積與攪拌前液體體積比，測定蛋白的起泡性FC。利用攪拌后靜置30 min的泡沫體積與攪拌后泡沫體積比，測定泡沫的穩(wěn)定性FS，重復測定3次，計算的公式為：

式中：V0為攪拌后泡沫體積，mL；VL為攪拌前液體體積，mL；V30為攪拌后靜置30 min泡沫體積，mL。

1.3.6 持水性和持油性的測定

參照Saetae等[12]的方法。

持水性的測定：稱取0.2 g葵花蛋白加入到離心管中，稱重為W1，然后將10 mL蒸餾水加入到離心管中并攪拌，靜置30 min。利用離心機(5000 r/min)離心30 min，倒出上清液，稱重為W2，計算公式如下：

式中：W0為葵花蛋白干重，g；W1為離心管與葵花蛋白重量之和，g；W2為離心后離心管與葵花蛋白重量之和，g。

持油性的測定：稱取0.2 g葵花蛋白加入到離心管中，然后將10 mL大豆油(V1)加入到離心管中并攪拌，靜置30 min。利用離心機(5000 r/min)離心30 min，將上清液倒進量筒中讀數，記為V2，計算公式如下：

式中：W0為葵花蛋白干重，g；V1為大豆油的體積，mL；V2為離心后上清液的體積，mL。

2 結果與討論

2.1 蛋白樣品基本參數的測定

蛋白質樣品的各項基本參數是蛋白功能特性指標評定的基礎，原料蛋白和不同葵花蛋白產物指標的測定參數見表1。

表1 原料基本成分Table 1 The basic ingredients of different sunflower proteins

2.2 不同脫酚工藝對葵花蛋白溶解性的影響

圖2 不同葵花蛋白在pH 2～9的溶解性Fig.2 The solubility of different sunflower proteins at pH 2～9

由圖2可知，SFP、DDM-1和DDM-2在pH 4附近溶解性最低。DDM-1和DDM-2的溶解性在pH 2～9范圍內始終高于SFP，且DDM-2的溶解性略優(yōu)于DDM-1。這是由于DDM-1和DDM-2中綠原酸大部分被脫除，其綠原酸的含量分別為SFP的12.5%和10.4%，大大減少了多酚與蛋白質作用形成復合物的機會，并且DDM-2的綠原酸在堿溶酸沉過程前進行脫除，從根本上減少了CGA-蛋白復合物的形成，使DDM-2的溶解性略優(yōu)于DDM-1。同時，由于在脫酚過程中，葵花蛋白需要進行酶解處理，該過程可能改變了蛋白分子的大小和結構，使親水基團暴露在蛋白分子表面，對水分子的吸附能力增強，使葵花蛋白的溶解性增強[13]。

2.3 不同脫酚工藝對葵花蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

圖3 不同葵花蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性Fig.3 The emulsifying activity and emulsifying stability of different sunflower proteins

由圖3可知，DDM-1和DDM-2的乳化性均高于SFP，分別為19.85 m2/g和18.65 m2/g，但DDM-1和DDM-2的乳化穩(wěn)定性均低于SFP?？赡苁怯捎谠诿摲舆^程中酶解作用會使蛋白質的分子柔性增大，蛋白分子束縛力降低，端基的極性基團增加，顯著提高了葵花蛋白的乳化活性[14-15]。同時，由于DDM-1和DDM-2的綠原酸被脫除，葵花蛋白與酚類作用減弱，使葵花蛋白的平均相對分子質量降低，更容易在界面擴散，降低了界面張力。但SFP中的蛋白與綠原酸作用，使葵花蛋白的平均相對分子質量增加，更容易形成穩(wěn)定的乳化層，SFP的乳化穩(wěn)定性最高。

2.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

蛋白質的起泡能力主要取決于蛋白質的構象，蛋白在溶于水時，小分子蛋白(肽鏈)迅速到達內表面，吸附并快速形成疏水層，在蛋白表面形成疏水保護膜，其涉及蛋白內在表面的二級及三級結構。發(fā)泡能力在一定范圍內與相對分子質量呈負相關，相對分子質量越小的蛋白質發(fā)泡能力越好，但超過特定范圍時，發(fā)泡能力會隨相對分子質量的減小而降低[16]。

圖4 不同葵花蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性Fig.4 The foamability and foam stability of different sunflower proteins

由圖4可知，DDM-2的起泡性顯著高于SFP和DDM-1(P<0.05)，為64.66%。這可能是由于DDM-2從根本上減少了綠原酸和蛋白質的共價結合，降低了葵花蛋白的平均相對分子質量，使蛋白質能夠快速展開并擴散到界面形成界面膜[17]。同時在脫酚過程中的酶解作用會使蛋白質的分子柔性增大[18]，易附在氣液的界面上，界面張力的降低導致了起泡性的增加。

DDM-1和DDM-2的泡沫穩(wěn)定性顯著高于SFP(P<0.05)，分別為82.88%和75.22%。且DDM-1的泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于DDM-2。這可能是由于在脫除綠原酸的過程中使用的乙醇使蛋白質發(fā)生輕微變性[19]，蛋白質重新折疊，使內埋的疏水肽段暴露出來，增加了蛋白質的疏水性，提高了泡沫穩(wěn)定性。同時，DDM-1的綠原酸在堿溶酸沉過程后進行脫除，其蛋白的平均相對分子質量較DDM-2大，有利于蛋白質的泡沫穩(wěn)定性[19]，使DDM-1的泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于DDM-2。

2.5 持水性及持油性

蛋白質的持水性、持油性是食品加工過程中的重要功能特性，如肉制品加工、烘焙和冰激凌等，若應用于風味食品加工中，持油性可以提高蛋白與脂肪的結合能力，改善食品對脂肪的吸收和持油能力。

圖5 不同葵花蛋白的持水性及持油性Fig.5 The water holding capacity and oil absorption capacity of different sunflower proteins

由圖5可知，未脫酚蛋白質SFP的持水性為2.71 g/g，DDM-1的持水性為2.52 g/g，DDM-2的持水性最低，僅為2.10 g/g。而不同蛋白樣品的持油能力差異顯著，后脫酚處理的葵花蛋白質DDM-1的持油性最低，為3.39 mL/g，未脫酚葵花蛋白SFP的持油性比DDM-1高70%，先脫酚葵花蛋白的持油性最高，比DDM-1高97%。

蛋白質的持水性和溶解性密切相關，一般來說，溶解性越好，蛋白質的保水性就越差[20]。體系中油與蛋白相互作用的作用力主要是非極性脂肪族鏈和非極性區(qū)域間的作用，如非共價鍵、氫鍵和疏水作用力[21]。DDM-1的處理過程對蛋白質構象改變程度最大，致使其持油能力減弱。DDM-2處理過程避免了綠原酸與蛋白質的非共價結合，較好地保護了疏水性氨基酸，蛋白質與小油滴之間的疏水作用力未被破壞，使DDM-2的持油能力提升。

3 結論

不同工藝脫除葵花蛋白中綠原酸對葵花蛋白功能性質的影響顯著，脫除葵花蛋白的綠原酸可提升其營養(yǎng)特性和功能特性。從酶的種類看，商品酶對葵花蛋白的脫酚作用顯著，此外，從酶的脫酚方式來看，提取蛋白前脫酚DDM-2的功能性優(yōu)于DDM-1，與SFP相比，脫酚葵花蛋白DDM-1和DDM-2的溶解性、乳化性、泡沫穩(wěn)定性顯著提升。先脫酚葵花蛋白DDM-2的溶解性顯著提升，pH為7時的溶解性最高。可以得出在提取蛋白前脫酚可以顯著提升葵花蛋白的綜合功能性質，本研究結果有助于提升葵花蛋白在食品加工中的應用價值。