高通量測序探究乳酸鈉對冷鮮牛肉細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

唐遠謀，孫勁松，龐紫琳，劉洋，潘攀，王新惠

(成都大學 食品與生物工程學院，成都 610100)

隨著人們生活節(jié)奏的加快以及冷鏈系統(tǒng)的完善，人們對冷鮮肉制品的需求將越來越大[1]。冷鮮牛肉及其調(diào)理肉制品因其豐富的營養(yǎng)和鮮美的口感受到廣大消費者的青睞，但在貯藏過程中牛肉極易滋生微生物，導致腐敗變質(zhì)。因此，如何抑制微生物生長、延長冷鮮牛肉的貨架期是一個亟需解決的問題。

乳酸鈉是肉制品中常見的添加劑，作為調(diào)味劑和保鮮劑添加在預調(diào)理肉制品中[2]，能夠有效抑制冷鮮肉和肉糜在儲藏過程中微生物的生長，延長貨架期。針對不同的肉制品，如冷鮮肉、冷凍肉、腌臘肉制品等，常將乳酸鈉與乳酸鏈球菌素(Nisin)、檸檬酸、山梨酸鉀、雙乙酸鈉等其他食品添加劑復合使用[3]，以達到調(diào)味、延長貨架期等目的[4]。 乳酸鈉具有較好的抑菌能力，Grosulescu等研究表明[5]，乳酸鈉在低溫下對單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)具有較好的抑制效果。Masana等發(fā)現(xiàn)乳酸鈉結(jié)合高壓滅菌能夠有效抑制腌制牛肉中的大腸桿菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7)以及其他腐敗菌，并且發(fā)現(xiàn)3%的乳酸鈉能有效降低大腸桿菌O157:H7的致病性[6]。

目前，16S rRNA擴增子測序技術(shù)已經(jīng)在肉類的研究中得到廣泛應用[7]，但大部分僅停留在對微生物相對豐度的探究上。而隨著測序和分析技術(shù)的發(fā)展，如今絕對豐度的分析技術(shù)較成熟[8]，如Mou等[9]通過16S rRNA測序技術(shù)分析了綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素對人體腸道微生物群落絕對豐度的影響。微生物絕對豐度可以更準確地反映樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)，避免了相對豐度分析時由于微生物A的減少而造成微生物B豐度升高的現(xiàn)象。

本研究將牛肉用乳酸鈉的生理鹽水溶液處理后進行4 ℃冷藏，用生理鹽水進行相同處理作為對照，并將冷藏1～7 d的樣品取樣，采用16S rRNA擴增子測序技術(shù)，在相對豐度和絕對豐度的層面分析乳酸鈉對牛肉的細菌群落結(jié)構(gòu)以及演替規(guī)律的影響，為乳酸鈉在冷鮮牛肉保鮮中的應用提供了理論支持。

1 材料和方法

1.1 樣品的前處理與取樣

實驗選用市面上常見的西門塔爾牛肉，購于成都市十陵鎮(zhèn)久貿(mào)綜合市場。選取背最長肌肉，分割成50 g左右的小塊后用無菌生理鹽水洗凈血水，并用濃度為3 g/dL的無菌生理鹽水的乳酸鈉溶液做浸泡處理[10]，浸泡時間為5 min，用無菌生理鹽水浸泡相同時間作為對照組。用無菌塑封袋進行裝袋，并迅速保存于4 ℃冰箱中冷藏，分別于第1天、第3天、第5天、第7天取樣。每組的每個采樣時間點取3個樣品作為重復，空白組和實驗組分別編號為C和SL。

1.2 實驗主要試劑

Qiagen凝膠回收試劑盒、無水乙醇、液氮、氯化鈉等：成都市科隆化學品有限公司；TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit試劑盒：美國Illumina公司。

1.3 實驗主要設(shè)備

瓊脂糖凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司；5810R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；AP-60-395LA型超低溫冰箱 杭州艾普儀器設(shè)備有限公司。

1.4 實驗方法

將牛肉樣品取樣后用液氮急速冷凍，并置于-80 ℃冰箱中保存，待測。采用CTAB法對樣本的基因組DNA進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳儀檢測DNA的純度和濃度[11]。采用16S V3-V4區(qū)通用引物(515F和806R)進行PCR擴增[12]。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳儀檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用Qiagen公司提供的凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，使用NovaSeq 6000測序系統(tǒng)進行上機測序。

1.5 冷藏期間牛肉的感官評價

根據(jù)GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評定規(guī)范》以及GB/T 17238—2008《鮮、凍分割牛肉》的相關(guān)要求制定感官評價表，見表1[13]。并由10名經(jīng)過培訓的感官評價員對冷藏期間的樣品進行感官評價，樣品的每項指標得分之和除以10，即得到該項指標的得分，最后用5項指標得分之和表示感官總得分。

表1 牛肉的感官評定標準表Table 1 The sensory evaluation standard of beef

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用uParse軟件對所有樣本的全部Effective Tags進行聚類[14]，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，篩選出現(xiàn)頻率最高的OTUs序列作為代表序列，利用FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)方法將數(shù)據(jù)進行校正[15]，得到每個樣品中的絕對定量值，更加準確地表現(xiàn)樣品中微生物群落的組成。使用Mothur方法與SILVA132的SSU rRNA數(shù)據(jù)庫進行注釋分析，設(shè)定閾值為0.8～1[16]，使用R以及OriginPro 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏期間樣品感官得分

冷藏期間牛肉的感官得分情況見圖1。

圖1 冷藏期間感官得分變化曲線Fig.1 Change curve of sensory score during cold storage

由圖1可知，在儲藏的1～2 d，C組和SL組的得分值相近，第3天開始，C組開始低于SL組；第4天開始，兩組的得分差值迅速增加。并且空白組牛肉煮沸后肉湯從第4天開始出現(xiàn)明顯的異味，而實驗組依然具備牛肉特殊的香味。當儲藏第7天時，實驗組得分依舊有(34.2±2.01)分，依舊保持較好的外觀，而空白組僅(20.9±1.19)分，說明經(jīng)過乳酸鈉的處理，牛肉能夠獲得更長的貨架期。

2.2 測序結(jié)果

圖2 樣品的OTU稀釋曲線Fig.2 OTU dilution curve of samples

本實驗通過將有效序列以97%的一致性聚類，共得到4884個OTUs，然后進行物種注釋，得到30個門，346個屬。并且由OTUs稀釋曲線(見圖2)可知，隨著測序量的增加，得到的OTU數(shù)量逐漸趨于平緩，說明測序深度足夠，實驗結(jié)果可信。

2.3 Alpha多樣性分析

表2 牛肉樣品的Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indexes of beef samples

由表2可知8個樣品的Alpha多樣性指數(shù)。其中，Group代表組名，每個組的值由3個重復樣品取平均值得到，Shannon和Simpson指數(shù)為微生物多樣性指數(shù)，其數(shù)值越大表示微生物多樣性越高。Chao1和ACE指數(shù)為微生物豐度指數(shù)，其值越大說明物種豐度越高。C組的微生物多樣性指數(shù)隨著儲藏時間的延長而升高，Shannon和Simpson指數(shù)在第7天分別達到最大值2.28±0.36和0.64±0.06。而SL組則在第5天達到最大值，并在第7天微生物多樣性有所減小；C組的細菌豐度在第1天最高，Chao1和ACE指數(shù)分別為288.36±30.07和306.10±20.06，而SL組的細菌豐度在第5天達到最高，Chao1和ACE指數(shù)分別為544.84±150.66和579.78±137.86，兩組樣品的細菌豐度在儲藏期間均呈現(xiàn)上下浮動的變化趨勢。在儲藏初期，兩組的細菌群落多樣性和豐度值相近，而在儲藏末期(第7天)，空白組的多樣性指數(shù)大于實驗組，豐度指數(shù)小于實驗組。

2.4 細菌群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律分析

2.4.1 門水平

儲藏1～7 d牛肉中細菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上的變化見圖3，圖3中a表示相對豐度前十的菌門，圖3中b表示絕對豐度前十五的菌門，其橫坐標為OTUs的豐度值。

圖3 門水平上牛肉樣品中細菌的群落結(jié)構(gòu)Fig.3 The bacterial community structure of beef samples at the phylum level

由圖3可知，第1天的6個樣品細菌群落結(jié)構(gòu)較相似，主要以Proteobacteria占主導，相對豐度達90%左右，其次是Firmicutes，相對豐度為1.06%～5.12%；第3天的C組3個樣品與第1天的相比變化較大，主導菌為Firmicutes，相對豐度為93.20%～96.17%。SL3與SL1的變化不大，主導菌依然為Proteobacteria，相對豐度為87.97%～99.08%；第5天C5和SL5的6個樣品中，相對豐度較高的分別為Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria。此外，在SL5.1中鑒定出Actinobacteria，其相對豐度為15.78%，絕對豐度為10220，但在SL5.2和SL5.3中其絕對豐度僅為20和278，說明樣品SL5.1可能受到污染；第7天，C7中Bacteroidetes和Firmicutes的含量較多，平均豐度分別為38.87%和53.70%。SL7中依然為Firmicutes占據(jù)主導，相對豐度為94.88%～97.07%。

兩組樣品中細菌的演替規(guī)律為：空白組的優(yōu)勢菌從Proteobacteria演替為Firmicutes，最后再由Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria共同主導；而實驗組的優(yōu)勢菌由Proteobacteria演替為Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria主導，再到最后由Firmicutes作為絕對優(yōu)勢菌。與空白組相比，經(jīng)過乳酸鈉的處理會使Bacteroidetes的生長受到抑制。

2.4.2 屬水平

屬水平上，對冷藏期間牛肉的細菌群落結(jié)構(gòu)做進一步分析，結(jié)構(gòu)見圖4，圖4中a表示相對豐度前十的菌屬，圖4中b表示絕對豐度前十五的菌屬。

圖4 屬水平上牛肉樣品中細菌的群落結(jié)構(gòu) Fig.4 The bacterial community structure of beef samples at the genus level

由圖4可知，第1天的6個樣品中優(yōu)勢菌均為Ralstoniaspp.；第3天時，C組中相對豐度最高的菌屬演替為Lactococcusspp.，相對豐度為78.23%～85.55%，絕對豐度值為43177～54437，其次為Weissellaspp.，相對豐度為7.46%～16.72%，絕對豐度為4355～9228。SL3的優(yōu)勢菌Ralstoniaspp.的相對豐度與SL1相近，平均相對豐度由SL1的93.83%變?yōu)镾L3的93.46%，平均絕對豐度由56387下降到52568。此外，SL3中Lactococcusspp.的含量也有明顯增加，平均相對豐度從SL1的0.01%增加到SL3的3.20%，平均絕對豐度由5增加至1579；第5天，C5演替成以Lactococcusspp.為主導，并且Myroidesspp.、Weissellaspp.、Kurthiaspp.、Paracoccusspp.等菌屬也占有較大的比重，其平均豐度依次為68.29%、9.83%、8.82%、2.77%、1.43%。SL5的主要菌屬為Lactobacillusspp.，豐度為45.85%～67.44%，其他菌屬豐度高低依次為Weissellaspp.、Bifidobacteriumspp.、Lactococcusspp.、Bacteroidesspp.，其平均豐度分別為18.07%、5.05%、4.21%、1.03%；第7天，C7的主要菌屬以及平均豐度分別為：Lactococcusspp. 43.16%，Myroidesspp. 37.76%，Serratiaspp. 4.80%，Lactobacillusspp. 3.87%，Weissellaspp. 2.97%；SL7的主要菌屬以及平均相對豐度為：Lactobacillusspp. 70.60%，Weissellaspp. 17.32%，Lactococcusspp. 4.88%，Myroidesspp. 1.33%。

其中Ralstoniaspp.是一種近幾年新發(fā)現(xiàn)的條件致病菌屬，常見于土壤或者供水系統(tǒng)中[17]，它以絕對的占比優(yōu)勢成為C1和SL1多種樣品中的優(yōu)勢菌，并且SL3的3個樣品中Ralstoniaspp.依然具有較高的占比，說明乳酸鈉的處理可以使初始菌屬存活較長時間。Lactobacillusspp.和Lactococcusspp.兩種菌屬分別含有能產(chǎn)生細菌素Nisin[18]和sakacin P[19]的Lactococcuslactis和Lactobacillussakei，其產(chǎn)生的細菌素均可以作為安全的食品防腐劑。由圖4中b可知，Lactobacillusspp.在SL5和SL7中含量較多，這可能是由于乳酸鈉的添加形成了適宜Lactobacillusspp.生存的條件，導致Lactobacillusspp.在第5天之前取代了Ralstoniaspp.的優(yōu)勢地位，成為了樣品中的絕對優(yōu)勢菌。而Lactococcusspp.在C3、C5和C7中含量較多，尤其是C3樣品中，平均絕對豐度是SL3中的31倍。但隨著儲藏期的延長，其豐度有所下降，由第3天的平均絕對豐度49186下降至第7天的平均絕對豐度27132，這可能與Lactococcusspp.對低溫不耐受有關(guān)。此外，從第3天開始，在空白組樣品中檢測出了Myroidesspp.，第3，5，7天的平均絕對豐度分別為1584，5481和22552，呈“指數(shù)型”增長，并且在C7樣品中成為含量第二的優(yōu)勢菌屬，這是一種可能引起菌血癥、腔內(nèi)感染或肺炎的條件致病菌[20-21]。此外，Weissellaspp.在SL組中后期(第3～7天)的樣品中也有較高的豐度，Weissellaspp.是一種乳酸菌，常與食品中的風味物質(zhì)形成有密切的關(guān)系[22]。由屬水平的分析發(fā)現(xiàn)，僅在SL5.1含量較高的Actinobacteria可能是Bifidobacteriumspp.，這是一種人和動物體內(nèi)常見的菌群，在食品中常作為益生菌[23-24]。

屬水平上，對儲藏期間牛肉的細菌群落結(jié)構(gòu)分析，隨著冷藏時間的延長，空白組出現(xiàn)兩個豐度較高的優(yōu)勢菌屬，即Lactococcusspp.和Myroidesspp.。而實驗組的Lactobacillusspp.是儲藏中后期(第5～7天)豐度最高的優(yōu)勢菌，SL5和SL7的平均絕對豐度分別為34338和45981，分別是第二優(yōu)勢菌Weissellaspp.的3.05倍和4.04倍。因此，經(jīng)乳酸鈉處理的冷鮮肉具有較長的保質(zhì)期，可能主要與牛肉中高豐度的Lactobacillusspp.有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究通過16S rRNA擴增子測序技術(shù)，探究乳酸鈉浸泡處理的牛肉在儲藏期間細菌群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律。通過Alpha多樣性分析，發(fā)現(xiàn)在儲藏初期，兩組的細菌群落多樣性和豐度值相近，而在儲藏末期，經(jīng)過乳酸鈉浸泡處理的冷鮮牛肉的細菌多樣性指數(shù)更低，豐度指數(shù)更高。通過細菌群落演替規(guī)律的分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)乳酸鈉的處理，牛肉樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)在第3天以后才發(fā)生較大變化，而空白組前3 d的細菌群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。通過群落演替規(guī)律的分析，發(fā)現(xiàn)乳酸鈉的處理對Lactococcusspp.、Myroidesspp.和Serratiaspp.等菌屬的生長具有一定的抑制效果，而能夠提升Lactobacillusspp.和Weissellaspp.在儲藏中后期樣品中的豐度，這可能是由于乳酸鈉能夠為這兩種菌群的生長提供有利的環(huán)境。通過對C和SL兩組空間距相等牛肉樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)Lactobacillusspp.在儲藏的第5～7天豐度較高，其中Lactobacillussakei可以產(chǎn)生的細菌素sakacin P會進一步抑制其他細菌的生長，并且能夠直接作為肉類防腐劑。但Lactobacillusspp.在實驗組中豐度達60.65%～77.80%，其中Lactobacillussakei具體占據(jù)多大的比例，是否能在保鮮過程中起到關(guān)鍵作用，有待進一步探究。