降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選鑒定及發(fā)酵特性研究

胡蝶，趙鑫，張素平，祁勇剛,3，吳勇超，高冰,3，柳志杰,3*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，武漢 430068；2.湖北聚匯農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，湖北 荊門 431821；3.湖北省發(fā)酵蔬菜企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 荊門 431821)

泡菜是中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，各地做法不一；大多是由圓白菜等大宗蔬菜經(jīng)食鹽腌漬后發(fā)酵而成。冷加工方式保護(hù)了蔬菜中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并使其具備貯藏性質(zhì)，在一定程度上可以調(diào)節(jié)蔬菜因季節(jié)變化而帶來的供需關(guān)系和解決蔬菜浪費(fèi)問題[1-2]。泡菜的獨(dú)特口感和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值贏得消費(fèi)者的喜愛，但泡菜中的亞硝酸鹽等有害物質(zhì)阻礙了泡菜的進(jìn)一步發(fā)展[3]。原料中硝酸鹽的含量增加、發(fā)酵過程中的雜菌污染等因素都會(huì)造成泡菜中亞硝酸鹽含量增高。過量攝入亞硝酸鹽會(huì)導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥，同時(shí)長(zhǎng)期食用高亞硝酸鹽含量的食品會(huì)增加患癌幾率[4]。因此，對(duì)于泡菜，控制和減少其亞硝酸鹽含量極其重要。

研究表明，乳酸菌能夠有效降解亞硝酸鹽，幾乎所有的乳酸菌都能產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶(NiR)，在厭氧條件下可將亞硝酸鹽還原為NH4+或N2[5-8]。此外，乳酸菌是泡菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)種群之一[9-10]。乳酸菌產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸不但可以調(diào)節(jié)酸度，豐富泡菜口感，還可以抑制雜菌與部分有害菌的生成[11-14]。研究表明，泡菜是國(guó)內(nèi)外乳酸菌菌種較為重要的來源之一，且乳酸菌用途較為廣泛[15]。乳酸菌或作為益生菌改善腸道微環(huán)境，或作為工業(yè)菌種進(jìn)行傳統(tǒng)食品工業(yè)化，或作為功能性成分添加以期開發(fā)食品新品種。

本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)方法從泡菜中分離出乳酸菌，研究其降解亞硝酸鹽能力，探究其耐鹽、產(chǎn)酸和抗氧化等特性。該研究從泡菜中分離并篩選出具有亞硝酸鹽降解能力和抗氧化能力的優(yōu)良乳酸菌，為低亞硝酸鹽泡菜的生產(chǎn)提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

泡菜(酸白菜)：取自湖北聚匯農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司泡菜車間，用無菌袋收集，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

硼砂、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、NaCl、HCl、DPPH、PBS：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2×Taq Master Mix試劑(試劑中含有染料)：購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；細(xì)菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)：均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 固體MRS培養(yǎng)基

蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.04 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3.2 液體MRS培養(yǎng)基

蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.04 g/L，115 ℃滅菌20 min。

1.1.4 儀器

ZXSR-1270恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；DELTA320 pH計(jì)、ME54E微量天平 梅特勒-托利多有限公司；HCB-1300V垂直層流超凈工作臺(tái) 海爾生物醫(yī)療股份有限公司；CR21N落地式高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；UV-1601紫外可見分光光度計(jì) 北京瑞麗分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

取發(fā)酵液100 μL加無菌水稀釋至1000 μL，并進(jìn)行梯度稀釋，分別取10-4，10-5，10-6，10-7這4個(gè)梯度的發(fā)酵液200 μL，涂布于MRS培養(yǎng)基平板上，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)20 h后，用接種環(huán)挑取單菌落，平板劃線，37 ℃培養(yǎng)。重復(fù)劃線，傳代3次，得到單菌落，轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基，所得菌液按1∶1(菌液∶50%甘油)加入保藏管，編號(hào)，并于-80 ℃冰箱中保藏。

1.2.2 乳酸菌的鑒定

將1.2.1中甘油管中的菌株活化，并置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行16S rDNA分子生物學(xué)鑒定。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 1 min，98 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株16S rDNA序列，采用MEGA 10.0軟件中的鄰接法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 降亞硝酸鹽的菌株篩選

將活化好后的菌株按1%接種量接種至亞硝酸鈉濃度為200 μg/mL的培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別在12，24，36，48，60，72 h取樣檢測(cè)亞硝酸鈉的含量。參考國(guó)標(biāo)GB 5009.33-2016和文獻(xiàn)[16-17]采用鹽酸萘乙二胺法測(cè)定亞硝酸鹽，并作改動(dòng)。樣品預(yù)處理：取5 mL菌液于50 mL帶塞比色管中，加入飽和硼砂溶液12.5 mL，蒸餾水20.0 mL，混合均勻，置于沸水浴中加熱15 min。待冷卻后加入乙酸鋅5.0 mL搖勻，再加入亞鐵氰化鉀5.0 mL，加水至刻度線，搖勻?；旌弦旱谷?50 mL離心管中，并加水50 g，4000 r/min離心10 min；將溶液過濾，取中間澄清溶液供后續(xù)測(cè)定。樣品測(cè)定：吸取2 mL處理液于50 mL比色管中，加入40 mL蒸餾水，混勻。加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸，搖勻，避光靜置5 min；加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液混勻，并加水到刻度線，避光靜置15 min，于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光度值，并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算亞硝酸鹽含量。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將活化后菌株按1%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，并且每隔2 h測(cè)OD值。

1.2.5 耐鹽性的測(cè)定

耐鹽性[18]：將其按照1%接種量分別添加于含有0%、2%、4%、6%、8%、10%(W/V)NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)36 h，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值。

1.2.6 產(chǎn)酸能力的測(cè)定[19]

將活化好后的菌種按1%接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng) 24 h，測(cè)發(fā)酵后的pH，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 抗氧化分析

細(xì)胞懸浮液制備：菌種活化3代后，5000 r/min離心10 min，棄上清液，無菌水洗滌3次，重懸調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/mL (OD595 nm=1.0)。

無細(xì)胞提取物制備：對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心破碎處理，電鏡檢查無完整細(xì)胞，離心收集上清液[20]。

1.2.7.1 DPPH清除能力的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[21]略作改進(jìn)：向2 mL待測(cè)液中加入0.2 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液2 mL，混勻，避光反應(yīng)30 min，9000 r/min離心10 min，取上清液于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)吸光度值。其中對(duì)照組用純水代替DPPH，空白組用無水乙醇代替DPPH。

1.2.7.2 還原能力的測(cè)定

參考劉洋等[22]的方法：向0.5 mL待測(cè)液中依次加入0.5 mL 的0.2 mol/L PBS溶液(pH 6.6)、1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴20 min；迅速冷卻后加入0.5 mL的10%三氯乙酸，4000 r/min離心5 min；取上清液、蒸餾水、0.1%三氯乙酸各1 mL混勻，靜置，反應(yīng)10 min，于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定其吸光度值。吸光度值越大，還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離與鑒定

按照乳酸菌的菌落特征進(jìn)行單菌落的挑選，隨后從樣品中共分離得到5株疑似乳酸菌菌株，分別命名為L(zhǎng)2、L6、L7、L11和L18。經(jīng)過鑒定，分別為醋酸菌、根瘤菌和乳酸菌，見表1；其中3株乳酸菌分別屬于兩個(gè)不同的屬，分別為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和明串珠球菌(Leuconostoc)。

表1 乳酸菌16S rDNA序列鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria

確定實(shí)驗(yàn)菌株為乳酸菌L7、L11和L18，從NCBI中查找其已知乳酸菌菌株的16S rDNA基因序列和其親緣性近的菌株16S rDNA基因序列，在MEGA 10.0中構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果見圖1。

圖1 乳酸菌的進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria

2.2 降解亞硝酸鹽能力

亞硝酸鹽是食品中較為關(guān)注的指標(biāo)，也是發(fā)酵蔬菜中最容易產(chǎn)生的有害物質(zhì)。3株乳酸菌在72 h降解亞硝酸鹽的能力見圖2，L7的降解能力為(114.19±2.46) mg/L；L11的降解能力為(104.26±3.68) mg/L；L18的降解能力為(128.70±4.85) mg/L。0～48 h時(shí)，亞硝酸鹽的含量會(huì)隨著時(shí)間的增加而減少。研究表明[23]，乳酸菌降解亞硝酸鹽的途徑可分為酸降解和產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶；當(dāng)環(huán)境pH<4.0時(shí)，降解途徑才以酸降解為主；當(dāng)環(huán)境pH>4.5時(shí)，降解途徑才以酶降解為主。結(jié)合實(shí)驗(yàn)中24 h發(fā)酵后的pH值，分析可知實(shí)驗(yàn)過程中兩種降解途徑都存在。

圖2 3株乳酸菌降解亞硝酸鹽能力Fig.2 Nitrite-degrading ability of three strains of lactic acid bacteria

2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定及產(chǎn)酸、耐鹽特性結(jié)果與分析

圖3 3株乳酸菌的生長(zhǎng)曲線圖Fig.3 The growth curves of three strains of lactic acid bacteria

圖4 3株乳酸菌發(fā)酵后的pH值Fig.4 The pH values of three strains of lactic acid bacteria after fermentation

圖5 3株乳酸菌的鹽耐受性Fig.5 The salt tolerance of three strains of lactic acid bacteria

3株乳酸菌的生長(zhǎng)曲線見圖3，L7、L11、L18在2 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，L11和L18均在12 h進(jìn)入穩(wěn)定期，而L7在接近18 h才進(jìn)入穩(wěn)定期；3株菌中，L18的生長(zhǎng)活力最強(qiáng)。乳酸菌在泡菜發(fā)酵前期需要通過產(chǎn)酸來抑制不耐酸雜菌生長(zhǎng)，后期需乳酸菌產(chǎn)酸調(diào)節(jié)口感，故乳酸菌的產(chǎn)酸能力是較為重要的發(fā)酵特性。培養(yǎng)24 h后，3株乳酸菌的pH結(jié)果見圖4，L18的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，L7的產(chǎn)酸能力最弱，但通過對(duì)比分析三者并沒有顯著性的差異(P<0.05)。因泡菜多加鹽水發(fā)酵制成，乳酸菌的耐鹽性這一發(fā)酵特性也值得研究。3株乳酸菌的耐鹽性結(jié)果見圖5，NaCl濃度為0%～10%范圍內(nèi)時(shí)，3株乳酸菌的生長(zhǎng)會(huì)因?yàn)镹aCl增加受到抑制，NaCl濃度為0%～4%時(shí)，菌株L11和L18均能較好地生長(zhǎng)；NaCl濃度為6%時(shí)，菌株L7比L11和L18生長(zhǎng)情況要好，NaCl濃度>6%時(shí)，菌株幾乎不生長(zhǎng)。

2.4 抗氧化特性結(jié)果與分析

DPPH清除率和還原性都是細(xì)菌抗氧化性能的評(píng)價(jià)指標(biāo)，DPPH清除率結(jié)果見圖6，3株乳酸菌的還原性見圖7。3株乳酸菌的細(xì)胞懸浮液的DPPH清除率都高于無細(xì)胞提取物的清除率。其中，L7的細(xì)胞懸浮液的DPPH清除率最高并且已達(dá)到(52.47±1.04)%，最低的為L(zhǎng)11細(xì)胞懸浮液(25.15±0.67)%。而無細(xì)胞提取物中L18的DPPH清除率最高，L11次之，L7最低。同一種菌株的細(xì)胞懸浮液與無細(xì)胞提取物比較：細(xì)胞懸浮液的清除能力強(qiáng)于無細(xì)胞提取物，L11的兩者差值最小，L7的差值最大，達(dá)到48.09%。3株乳酸菌的還原能力有一定差異，L18的還原能力最強(qiáng)，細(xì)胞懸浮液與無細(xì)胞提取物之間有較大差異。L7和L11的細(xì)胞懸浮液與無細(xì)胞提取物的還原性差異不大，且菌種之間的差異性也不大。

圖6 3株乳酸的DPPH清除率Fig.6 The scavenging rates of three strains of lactic acid bacteria on DPPH

圖7 3株乳酸菌的還原性Fig.7 The reducing capacity of three strains of lactic acid bacteria

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)分離篩選并通過分子鑒定得到3株乳酸菌，L7為腸膜明串珠菌亞種Leuconostocmesenteroidessubsp.jonggajibkimchii，L11為清酒乳酸桿菌亞種Latilactobacillussakeisubsp.sakei，L18為彎曲乳桿菌Latilactobacilluscurvatus。據(jù)有關(guān)報(bào)道[24-25]，彎曲乳桿菌Latilactobacilluscurvatus有良好的降解亞硝胺作用，并且已經(jīng)成為國(guó)際公認(rèn)的新食品原料；腸膜明串珠菌是發(fā)酵過程中的啟動(dòng)菌種[26]，清酒乳酸桿菌也是發(fā)酵過程中十分重要的乳酸菌。實(shí)驗(yàn)分離得到的3株菌中，L18菌株在降解亞硝酸鹽和還原性方面優(yōu)于另外兩株菌，推測(cè)其細(xì)胞中具有良好的產(chǎn)還原酶性能，可進(jìn)一步分析產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶性能；L7菌株耐鹽性能和DPPH清除能力較好。經(jīng)降解亞硝酸鹽能力及耐鹽性等發(fā)酵特性綜合分析，篩選得到的3株乳酸菌均可用于低亞硝酸鹽泡菜的生產(chǎn)。