褐藻素通過調(diào)控Nrf2/Keap1通路緩解糖尿病大鼠心肌肥大

糖尿病心肌?。―CM）是糖尿病主要并發(fā)癥之一，最終可發(fā)展成心衰，導(dǎo)致糖尿病病人的死亡。據(jù)臨床研究調(diào)查，糖尿病患者相比于非糖尿病患者其心力衰竭發(fā)生率高至2～4倍。DCM早期主要表現(xiàn)為糖尿病背景下心室壁肥厚和舒張功能受損，晚期進一步發(fā)展為心臟纖維化和收縮功能障礙。心臟肥大分為生理性肥大和病理性肥大，以心臟肥大，細胞凋亡和纖維化為特征的病理性肥大最終會導(dǎo)致心力衰竭。心臟肥厚主要表現(xiàn)在胎兒基因心房利尿鈉肽（ANP）、腦利尿鈉肽（BNP）、β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）的表達增加，及細胞面積增加。心肌纖維化表現(xiàn)為膠原蛋白堆積、纖連蛋白（FN）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）增多。

自然環(huán)境條件是農(nóng)村居民點分布形成的基礎(chǔ)，其中地形條件為農(nóng)村居民點的建設(shè)提供空間，同時又可能限制其發(fā)展；耕地是農(nóng)村居民的主要勞作對象及其經(jīng)濟來源依附體；河流的分布不僅影響到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，同時也是農(nóng)村居民主要的水源供給地。社會經(jīng)濟因素決定著區(qū)域發(fā)展?jié)摿亩绊懼r(nóng)村居民點的布局，其中城鎮(zhèn)與工礦用地為區(qū)域工業(yè)聚集地，可在一定范圍內(nèi)提供就業(yè)并帶動經(jīng)濟增長；良好的交通是進行經(jīng)濟交流的基礎(chǔ)。因此采用河流、耕地、高程、坡度4個因子作為影響農(nóng)村居民點的自然因素，城鎮(zhèn)與工礦、交通作為社會經(jīng)濟因素加以研究，根據(jù)隴川縣區(qū)域?qū)嵡楹鸵蜃颖旧硖匦源_定分級范圍，測算各影響因素不同范圍內(nèi)的農(nóng)村居民點景觀指數(shù)，測算結(jié)果如表1。

褐藻素（FX）是一種源自棕色大型藻類的天然海洋類胡蘿卜素。由于其特殊的官能團，包括不尋常的丙二烯鍵和5，6-單環(huán)氧結(jié)構(gòu)，使它具有抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病和抗癌等活性。FX逆轉(zhuǎn)創(chuàng)傷性腦損傷模型中丙二醛的上調(diào)和谷胱甘肽過氧化物酶的活性起到神經(jīng)保護作用，這歸因于FX具有強抗氧化活性。在糖尿病研究方面，F(xiàn)X 減少氧化應(yīng)激改善糖尿病大鼠腎纖維化，F(xiàn)X改善2型糖尿病小鼠的胰島素抵抗、葡萄糖和脂質(zhì)代謝。FX還降低糖尿病和肥胖KK-Ay小鼠的白色脂肪組織和血糖的增加，并減少腫瘤壞死因子和單核細胞趨化蛋白-1 的mRNA表達以調(diào)節(jié)白色脂肪組織誘導(dǎo)的胰島素抵抗。然而，F(xiàn)X對糖尿病心肌病是否具有保護效應(yīng)及其保護機制目前還尚未見報道。

與高血糖相關(guān)的氧化應(yīng)激被認為在糖尿病心肌病中起著核心作用，可誘導(dǎo)心臟重塑、心肌細胞鈣處理受損、心肌收縮力和舒張力降低。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子，通過上調(diào)抗氧化反應(yīng)來調(diào)節(jié)細胞氧化還原平衡。在氧化應(yīng)激脅迫下，Nrf2在細胞質(zhì)中與Keap1分離，并異位到細胞核中。超氧化物歧化酶（SOD）、血紅素氧合酶1（HO-1）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等被認為是Nrf2的下游靶蛋白，起到抗氧化作用。

基于以上背景，本研究通過鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型和高糖誘導(dǎo)H9C2 心肌細胞體外模型，探討FX是否具有抗糖尿病心肌纖維化和心肌細胞肥大作用，并初步探索其作用機制。本研究旨在為將FX 開發(fā)成為抗DCM的臨床藥物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性Sprague-Dawley大鼠（=32，200±10 g）由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，許可證44007200065141。所有實驗程序均經(jīng)美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南許可，并經(jīng)海南大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（HNUAUCC-2021-00089）。

1.2 實驗細胞

與NG 組相比，高糖刺激下H9C2 心肌細胞表面積增加，給予FX 處理后，細胞表面積減少（＜0.05，圖2A、B）。隨后通過qRT-PCR進一步檢測細胞肥大因子ANP、BNP和β-MHC的mRNA表達水平。與NG組相比，高糖刺激下H9C2細胞內(nèi)肥大因子ANP、BNP和β-MHC的mRNA表達上調(diào)，給予FX處理后，細胞肥大因子ANP、BNP和β-MHC的mRNA表達下調(diào)（＜0.05，圖2C～E）。

1.3 藥物與試劑

FX（成都普瑞法生物科技有限公司）；DMEM低糖培養(yǎng)液、DMEM 高糖培養(yǎng)液（Thermo）；胎牛血清（Newzerum）；活性氧檢測試劑盒、預(yù)染蛋白Marker、Western及IP細胞裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、HRP標(biāo)記山羊抗兔lg G、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠lg G、BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（上海翌圣生物科技有限公司）；FN、TGF-β1、Keap1、Nrf2蛋白抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；α-Tubulin、β-Actin、SOD1蛋白抗體（武漢博士德生物科技有限公司）；HO-1蛋白抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司）；培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.4 實驗儀器

1.5.7 細胞骨架染色 將細胞種于爬片上，給藥處理后用PBS 洗3 次，用4%多聚甲醛固定細胞，加入0.1%Triton X-100 透化。然后將細胞在含有1% BSA 的200 nmol/L 鬼筆環(huán)肽工作溶液中孵育30 min。用PBS洗滌3 次，10 min/次，隨后用Hochest33342 染色孵育20 min以顯示細胞核，用PBS洗滌3次，10 min/次。于載玻片上滴一滴抗熒光淬滅劑，將含細胞的爬片緩慢蓋上，隨后用濾紙吸去多余的淬滅劑，邊緣涂抹指甲油以封片。封片于熒光顯微鏡得到細胞圖像，用Image-J軟件進行分析得到細胞表面積大小。

1.5 方法

1.5.3 大鼠心肌細胞H9C2的培養(yǎng) 本實驗使用H9C2細胞代數(shù)均在25 代以內(nèi)。于含10%胎牛血清的DMEM 低糖培養(yǎng)液中進行細胞培養(yǎng)（37 ℃，5%CO），待細胞長至匯合后傳代。在給藥處理前，先使用無血清培養(yǎng)液進行同步化處理。24 h后將細胞處理分為以下3組：含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM作為正常組（NG），含45 mmol/L 葡萄糖的DMEM 作為模型組（HG），含45 mmol/L葡萄糖的DMEM+1 μmol/L的FX作為給藥組（HG+FX）。

1.5.2 HE染色 用4%多聚甲醛將新鮮的心肌組織固定，進行脫水、包埋和切片處理，得到石蠟切片。石蠟切片烘片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；雙蒸水沖洗；蘇木精溶液中染色；1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒；蒸餾水中沖洗；0.5%伊紅染液染色1～3 min；蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明；中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察拍照，用Image-J軟件分析心肌細胞橫截面面積。

1.5.1 動物分組及造模 所有動物都在標(biāo)準(zhǔn)條件下喂養(yǎng)，自由獲取食物和水。將大鼠分為正常組（=8）和糖尿病模型組（=24），造模通過腹腔注射新鮮STZ（60 mg/kg）誘導(dǎo)，注射后72 h剪尾取血測空腹血糖，空腹血糖值大于16.7 mmol/L 的大鼠為成功建立糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠隨機分為糖尿病對照組、FX 干預(yù)糖尿病組[200 mg/（kg.d）]和二甲雙胍干預(yù)糖尿病組[230 mg/（kg.d）]，8只/組，每日灌胃給藥，處理12周后處死大鼠。

1.5.5 Western blot實驗 將細胞種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細胞長至匯合狀時進行無血清處理，隨后加藥48 h終止培養(yǎng)。使用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次后，用濾紙和小量程移液槍將皿內(nèi)殘余液體吸干，再加入80 μL 含PMSF 的細胞裂解液，用細胞刮充分刮下培養(yǎng)皿中的細胞，收集皿內(nèi)裂解液于1.5 mL 的EP 管，冰浴靜置30 min，于4 ℃，12 000×離心30 min，取上清為胞漿蛋白。動物組織剪切一小塊，置于含PMSF 的裂解液裂解，用剪刀剪碎，玻璃棒研磨后，使用超聲破碎儀破碎后，冰浴靜置30 min，于4 ℃，12 000×離心30 min。取上清液于1.5 mL的EP管中，得到動物組織內(nèi)蛋白。通過BCA法測定各組蛋白含量，分裝得到上樣蛋白量。然后經(jīng)5%濃縮膠，12%分離膠進行電泳來分離蛋白，每孔上樣40 μg總蛋白。經(jīng)Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀在冰上以300 mA，2 h條件將蛋白由凝膠轉(zhuǎn)至NC 膜上。TBST洗膜3次，10 min/次，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗于4 ℃慢搖孵育過夜，次日以TBST洗膜3次，10 min/次，HRP二抗于室溫慢搖孵育1 h，以TBST 洗膜3次，10 min/次。隨后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，于Amersham Image Quant 800 蛋白印跡成像系統(tǒng)顯影，圖片用Image-J軟件進行灰度分析。

2)從外部形態(tài)上判斷。頂花芽芽基部比較細，芽體不論大小，一般都較飽滿充實，多數(shù)品種芽體有3個棱起，其上部向一邊歪斜。腋花芽芽體肥厚，多數(shù)芽尖歪斜，鱗片光亮。頂葉芽芽體直立，基部較粗，形態(tài)不飽滿，芽體棱起不明顯，鱗片上毛茸多，色暗，黑褐色邊緣較寬，大鱗片不夠突出。側(cè)葉芽芽體短小而扁，芽尖小，不歪斜，芽緊貼附枝條著生，鱗皮色暗。

1.5.4 細胞核蛋白提取 細胞給藥48 h后，預(yù)冷的PBS洗滌3次后，加入含有PMSF的胞漿抽提試劑A，用細胞刮充分刮取培養(yǎng)皿內(nèi)細胞，收集提取試劑A于1.5 mL離心管中，劇烈震蕩5 s，冰浴15 min。隨后加入胞漿抽提試劑B，劇烈震蕩5 s，冰浴1 min，再次震蕩5 s，于4 ℃12 000×離心5 min，得到胞漿蛋白。余下沉淀加入含有PMSF 的細胞核蛋白抽提試劑，劇烈震蕩30 s，冰浴2 min，重復(fù)該過程，直到沉淀充分懸浮并散開。隨后于4 ℃12 000×離心10 min，上清即為核蛋白。

1.5.6 活性氧檢測 細胞種于六孔板中培養(yǎng)至匯合狀，無血清同步化后進行處理，給藥48 h后進行檢測。無血清培養(yǎng)液稀釋活性氧探針DCHF-DA至20μmol/L，并將其加入六孔板中，在37 ℃下與細胞一起孵育1 h。孵育完成后用無血清培養(yǎng)液沖洗3遍，每次沖洗3～5 min，以充分除去未結(jié)合的探針。于熒光倒置顯微鏡中觀察并拍照。

1.2.3 采取民間借貸。通過調(diào)研數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，借款建房的農(nóng)戶約占總數(shù)的73.61%。除了向親戚朋友借錢，他們還會選擇向裝修工隊賒賬或者借10萬以下的小額高利貸?？梢哉f，借款建房是一個普遍現(xiàn)象。

垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad），熒光倒置顯微鏡（Olympus），熒光實時定量PCR 儀（Thermo），Amersham ImageQuant 800 蛋白印成像系統(tǒng)（Cytiva），微量紫外分光光度計（Thermo）。

1.5.8 熒光實時定量PCR 法 根據(jù)Primer 5 軟件和NCBI設(shè)計引物，引物序列如下：ANP序列：上游5'-GG GAAGTCAACCCGTCTCA-3'，下游5'-GCTCCAATC CTGTCAATCCT-3'；BNP序列：上游5'-CCCCAGATG ATTCTGCTCC-3'，下 游5'-AGGGCCTTGGTCCTTT GA-3'；β-MHC 序列：上游5'-AGGCAAAGCAAAGA AAGGC-3'，下游5'-AAAGTGAGGGTGCGTGGA-3'；β-Actin序列：上游5'-AATCGTGCGTGACATTAAAG AG-3'，下游5'-CATTGCCGATAGTGATGACCT-3'反應(yīng)體系10 μL，擴增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。Ct 值用2法計算目的mRNA相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 26軟件統(tǒng)計分析，結(jié)果表示以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，方差齊時選擇LSD 法，方差不齊時采用非參數(shù)檢驗，＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有的實驗都是獨立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 褐藻素緩解STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌肥大和心肌纖維化

應(yīng)用HE切片觀察心肌細胞橫截面面積，結(jié)果顯示，與Con組相比，DM組心肌細胞肥大，細胞間排列紊亂。FX組和Met組心肌細胞相比于DM組心肌細胞排列整齊，且細胞橫截面面積減少（＜0.05，圖1A、B）。Western blot結(jié)果顯示，DM組心臟組織中纖維化蛋白FN表達相對于Con組上調(diào)，F(xiàn)X組和Met組心臟組織中FN表達相對DM組下調(diào)（＜0.05 圖1C）。DM組心臟組織中纖維化蛋白TGF-β1相對于Con組上調(diào)，給予FX和Met處理后，TGF-β1的表達下調(diào)（＜0.05，圖1D）。

2.2 褐藻素緩解高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細胞肥大

大鼠心肌細胞H9C2購于上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。

（3）采用多元評價手段激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)熱情。過程性評價有利于學(xué)生學(xué)習(xí)活動中每個階段的工作均得到認可，逐步引導(dǎo)學(xué)生繼續(xù)努力，力爭做到最好。

2.3 褐藻素調(diào)控糖尿病大鼠心臟中Nrf2/Keap1通路緩解心肌肥大

與Con 組相比，DM組心臟中Nrf2 表達下調(diào)，F(xiàn)X和Met處理可抑制STZ誘導(dǎo)的Nrf2表達下調(diào)（＜0.05，圖3A）。DM組心臟中Keap1表達相對Con組上調(diào)，給予FX和Met處理可抑制Keap1的上調(diào)（＜0.05，圖3B）。隨后，我們檢測Nrf2調(diào)控的抗氧化蛋白HO-1。與Con組相比，DM心臟中HO-1的表達下調(diào)，給予FX處理后，心臟中HO-1的表達上調(diào)（＜0.05，圖3C）。

2.4 褐藻素調(diào)控高糖誘導(dǎo)的H9C2細胞中Nrf2/Keap1通路

高糖誘導(dǎo)H9C2心肌細胞Nrf2蛋白表達下調(diào)，給予FX處理后，Nrf2蛋白表達相對于HG組顯著上調(diào)（＜0.05，圖4A）。通過提取核蛋白進一步檢測Nrf2入核情況，在高糖誘導(dǎo)情況下，Nrf2蛋白在細胞核中表達相對NG組上調(diào)。給予FX處理后，其入核程度顯著上調(diào)，且與NG 組和HG 組有顯著性差異（＜0.05，圖4B）。Keap1在高糖誘導(dǎo)H9C2細胞中表達相對NG組顯著上調(diào)，給予FX處理后，Keap1表達下調(diào)（＜0.05，圖4C）。

?Tony Smith，America’s Mission，the United States and the World Struggle for Democracy in the Twentieth Century(Foreword)，Princeton University Press，1994．

2.5 褐藻素緩解高糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激抗糖尿病心肌細胞肥大

高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細胞中SOD1蛋白表達相對于NG組顯著下調(diào)，給予FX處理后，SOD1表達相對于HG組上調(diào)（＜0.05，圖5A）。相對于NG組，HG組的HO-1表達下調(diào)，給予FX處理后，HO-1的表達顯著上調(diào)（＜0.05，圖5B）。通過結(jié)合DCFH-DA探針檢測細胞內(nèi)活性氧族（ROS）水平，我們發(fā)現(xiàn)在高糖刺激情況下ROS水平相對上調(diào)，給予FX處理后，ROS水平降低（圖5C）。

3 討論

糖尿病心肌病的主要特征包括心肌纖維化，心肌肥大以及心臟舒張功能和收縮功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭、心律失常和心肌梗死。伴隨著社會性人口老齡化，肥胖和糖尿病的增加，心力衰竭的發(fā)生率和死亡率以驚人的速度增加。糖尿病心肌病發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前沒有專門針對糖尿病心肌病的治療藥物。

左小龍一直很喜歡黃瑩，但這樣的喜歡是一種沒有預(yù)感到交集的喜歡，所以不曾放在心上，今天這樣的場合遇見她，左小龍突然冒出一個想法，他對大帥說：大帥，你覺得黃瑩怎么樣？

心肌肥大最初表現(xiàn)為心臟對各種刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，但長期心肌肥大最終會變成病理性肥大，其特點是心肌細胞肥大和成纖維細胞活化，最終可導(dǎo)致適應(yīng)不良性肥大和心力衰竭。給予FN聚合抑制劑的缺氧模型小鼠，其表現(xiàn)的心臟重構(gòu)和纖維化的病理變化得到抑制。在過表達TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠中，心肌肥大和纖維化程度較正常小鼠更為明顯，提示TGF-β1可誘導(dǎo)心肌肥大和纖維化。在臨床上，ANP和BNP能夠提供具有臨床和功能價值的信息，他們與心肌肥厚信號呈正相關(guān)。本研究顯示，DM組大鼠心臟中纖維化蛋白TGFβ1和FN表達上調(diào)且橫截面細胞面積增加，表明STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠心臟發(fā)生心肌纖維化病變和心肌肥大。與Hu等的研究一致，給予FX處理的糖尿病大鼠中TGF-β1和FN表達均下調(diào)，因此我們推測FX可緩解糖尿病大鼠心肌纖維化病變和心肌肥大的發(fā)生。高糖刺激后H9C2 細胞表面積增加的同時，ANP、BNP 和β-MHC的mRNA 表達也增加，這表明給予高糖可誘導(dǎo)H9C2心肌細胞肥大。FX減少細胞表面積增加，并下調(diào)肥大因子ANP、BNP和β-MHC的mRNA表達。上述結(jié)果與Hang等研究一致，因此我們認為FX可緩解高糖誘導(dǎo)的細胞肥大。結(jié)合體內(nèi)外研究結(jié)果，我們首次發(fā)現(xiàn)FX同時抑制糖尿病大鼠心臟和高糖誘導(dǎo)的心肌纖維化和心肌細胞肥大相關(guān)指標(biāo)，但其改善效應(yīng)的潛在機制有待進一步明確。

氧化應(yīng)激是心肌肥大發(fā)展中關(guān)鍵誘因之一。在高血糖情況下，細胞內(nèi)葡萄糖代謝受到干擾，伴隨著大量ROS的產(chǎn)生。ROS促進成纖維細胞和肌成纖維細胞的活化和增殖，并激活氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞死亡，進一步導(dǎo)致細胞外基質(zhì)重塑和心力衰竭。自由基的消除主要通過過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽抗氧化物酶和SOD等抗氧化酶來實現(xiàn)，維持氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的平衡。在本研究中，F(xiàn)X上調(diào)HO-1和SOD1蛋白表達水平，緩解高糖誘導(dǎo)的H9C2細胞ROS水平的增加從而起到抗氧化作用。早期有研究表明，熒光素上調(diào)HO-1 和NQO-1 緩解氧化應(yīng)激從而抗心肌肥大，EUK-8作為SOD和CAT模擬物，減輕心臟氧化應(yīng)激改善心肌肥大。非瑟酮上調(diào)抗氧化蛋白SOD1、CAT和HO-1的表達抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生，改善心肌肥大。因此我們推測，F(xiàn)X上調(diào)糖尿病大鼠心臟和高糖誘導(dǎo)心肌細胞中抗氧化蛋白SOD1和HO-1表達，抑制心臟和心肌細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增加，可能是其改善糖尿病大鼠心肌肥大機制之一。

Nrf2/Keap1信號通路是體內(nèi)調(diào)控氧化應(yīng)激重要通路之一。Nrf2的阻斷導(dǎo)致氧化損傷的敏感度增加。補骨脂酚調(diào)節(jié)Sirt1/Nrf2 通路增強心臟抗氧化能力來改善心肌纖維化和肥大。別嘌呤醇增加Nrf2和p62的表達，降低Keap1的表達，緩解氧化應(yīng)激和凋亡的發(fā)生，改善糖尿病大鼠心臟功能。臨床上，SGLT2可預(yù)防糖尿病二型患者心力衰竭的發(fā)展，SGLT2抑制劑促進Nrf2入核且調(diào)控其下游抗氧化蛋白HO-1蛋白表達降低心肌氧化應(yīng)激。FX激活Nrf2-ARE和自噬來減少氧化應(yīng)激而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，這歸因于其α，β-不飽和羰基，其結(jié)構(gòu)可以促進keap1 與Nrf2 的分離。ROS上調(diào)是糖尿病誘導(dǎo)心臟重塑的關(guān)鍵因素，進一步導(dǎo)致心力衰竭，抗氧化劑治療心血管疾病也越來越受到大家的關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)X抑制STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠心臟中Nrf2表達減少，促進高糖誘導(dǎo)的H9C2細胞中Nrf2入核，從而調(diào)控其下游抗氧化基因表達，起到抗氧化作用。這與我們觀察到FX抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細胞中ROS的結(jié)果一致，表明FX調(diào)控糖尿病大鼠心臟和高糖誘導(dǎo)的心肌細胞中Nrf2的表達，降低Keap1的表達，促進下游抗氧化蛋白HO-1和SOD1表達，從而緩解氧化應(yīng)激。還有研究顯示，Nrf2增強心肌細胞自噬體形成以去除心臟毒性蛋白，進而抑制心臟重塑和改善功能障礙。自噬的激活緩解壓力超負荷和心臟損傷引起的心肌肥大。我們推測FX緩解心肌肥大可能與Nrf2/Keap1通路降低糖尿病大鼠和高糖誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激水平有關(guān)，我們后續(xù)將通過沉默/過表達Nrf2基因，結(jié)合體外和體內(nèi)實驗進一步驗證Nrf2通路在FX緩解糖尿病心肌肥大中的重要性。

輸出方程均為x，其中H=PX (x-BTy+DTu), Rm, Rn, Rp。顯然，這兩個模型都需要m+n+p個決策變量,與提出的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型所需變量數(shù)一致,但網(wǎng)絡(luò)層數(shù)不同,模型(13)和(14)的層數(shù)分別為2和3，而模型(9)僅為單層。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)FX對糖尿病心肌纖維化和心肌細胞肥大具有保護效應(yīng)，并首次揭示FX通過Nrf2/Keap1調(diào)控其下游HO-1和SOD1蛋白，抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。我們前期研究發(fā)現(xiàn)FX可通過緩解氧化應(yīng)激改善糖尿病腎功能和腎纖維化。在此基礎(chǔ)上，我們的研究進一步驗證FX對糖尿病心肌肥大的保護效應(yīng)，為FX進一步開發(fā)為糖尿病治療藥物提供數(shù)據(jù)支撐。我們接下來將結(jié)合基因沉默或過表達以及轉(zhuǎn)基因動物，進一步確認FX抗糖尿病心肌肥大的作用和機制。