傳統(tǒng)泡菜制作與乳酸菌的分離觀察

高悅皓

摘 要：本實(shí)驗(yàn)以制作的傳統(tǒng)泡菜為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)對(duì)乳酸菌的培養(yǎng)以及每日泡菜液中的pH值的檢測(cè)，探究泡菜制作過(guò)程中酸堿度的變化和乳酸菌數(shù)量的消長(zhǎng)，并對(duì)加入乳酸菌粉和不加乳酸菌粉的兩缸泡菜的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，探究乳酸菌粉的加入是否能加速泡菜的制作速度。結(jié)果表明，自然發(fā)酵的泡菜pH值在前2 d短暫升高，后續(xù)開(kāi)始逐漸下降并最終趨于穩(wěn)定;而加入乳酸菌粉的泡菜pH值呈現(xiàn)出先下降后穩(wěn)定的趨勢(shì)，且相較于自然發(fā)酵趨于平緩更早、最終數(shù)值略低。此外，自然發(fā)酵的泡菜中乳酸菌數(shù)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在第4 d左右到達(dá)最高值，第7 d仍呈下降趨勢(shì)，推測(cè)后續(xù)會(huì)逐漸趨于平緩;而加入乳酸菌粉的泡菜中乳酸菌數(shù)量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，并在第5 d左右開(kāi)始逐漸趨于平緩。對(duì)比分析確定乳酸菌粉的加入能加速泡菜的制作速度。

關(guān)鍵詞：傳統(tǒng)泡菜;乳酸菌;觀察計(jì)數(shù);自然發(fā)酵

Preparation of Traditional Pickles and Isolation and Observation of Lactic Acid Bacteria

GAO Yuehao

（School of Environment and Ecology， Xiamen University， Xiamen 361000， China）

Abstract： This experiment takes the traditional kimchi as the experimental object， and explores the changes of pH and the growth and decline of lactic acid bacteria in the process of kimchi production by means of daily pH value in kimchi liquid， detection of miscellaneous bacteria， culture， observation and counting of lactic acid bacteria. In addition， through the comparison of various data of two cylinders of pickles with and without lactic acid bacteria powder， this experiment explores whether the addition of lactic acid bacteria powder can accelerate the production speed of pickles. The results showed that the pH of naturally fermented kimchi began to decrease gradually and finally stabilized after a short increase of 2 days; The pH of kimchi added with lactic acid bacteria powder showed a trend of decreasing first and then stabilizing， and tended to be gentle earlier and slightly lower than that of natural fermentation. In addition， the number of lactic acid bacteria in naturally fermented pickles increased first and then decreased， reached the highest value around the fourth day， and still showed a downward trend on the seventh day. It is speculated that it will gradually flatten in the follow-up; The number of lactic acid bacteria in pickles added with lactic acid bacteria powder decreased from the beginning， and gradually leveled off around the fifth day. Through comparative analysis， it is determined that the addition of lactic acid bacteria powder can accelerate the production speed of kimchi.

Keywords： traditional kimchi; lactobacillus; observation and counting; natural fermentation

泡菜是一種獨(dú)特的乳酸發(fā)酵蔬菜制品，食用后會(huì)攝入乳酸菌及乳酸等代謝產(chǎn)物，有助于調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，達(dá)到預(yù)防疾病和保健的目的[1-2]。我國(guó)泡菜歷史十分悠久，北魏賈思勰的《齊民要術(shù)》一書(shū)中，就有制作泡菜的敘述，可見(jiàn)至少1 400多年前，中國(guó)就有制作泡菜的歷史。在清朝，川南、川北民間還將泡菜作為嫁奩之一，足見(jiàn)泡菜在人們生活中所占地位[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制作傳統(tǒng)泡菜，測(cè)定泡菜的理化指標(biāo)，對(duì)制作泡菜不同階段中的乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)、計(jì)數(shù)與形態(tài)觀察，了解發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的數(shù)量變化，同時(shí)通過(guò)自然發(fā)酵與人工加入乳酸菌兩壇泡菜的對(duì)比，探究接種乳酸菌制作泡菜是否能提升制作速率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

涼白開(kāi)、圓白菜、大蒜、花椒、干辣椒、生姜、冰糖、碘鹽、蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸鈉、酵母提取物、檸檬酸二胺、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、吐溫80、溴甲酚紫、瓊脂、泡菜乳酸菌粉、NaCl、pH計(jì)緩沖液、革蘭氏染色液（結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、番紅）、芽孢染色液（孔雀綠染液、7.6%飽和孔雀綠水溶液、番紅水溶液）、3%過(guò)氧化氫溶液、放線(xiàn)菌酮。

1.2 儀器

SQP電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）]、培養(yǎng)皿、pH計(jì)、燒杯、厭氧培養(yǎng)袋、MGC-350BP-2光照培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、O2YMPVS CX21生物顯微鏡、接種環(huán)、C21-SDHCB06G電磁爐。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 傳統(tǒng)泡菜的制作

購(gòu)買(mǎi)新鮮的圓白菜，清洗，瀝干，切分，用電子天平稱(chēng)取224.00 g裝入泡菜缸，同時(shí)加入13.86 g大蒜、4.62 g花椒、4.62 g干辣椒、4.62 g生姜、36.96 g冰糖和36.96 g碘鹽，最后向其中加入700 mL涼白開(kāi)，封壇并做好標(biāo)記存于陰涼處;取另一個(gè)泡菜缸，重復(fù)第一個(gè)的操作，并在封壇前向其中加入1包泡菜乳酸菌粉，做好標(biāo)記同樣存放于陰涼處。

1.3.2 MRS培養(yǎng)基及生理鹽水的配制

稱(chēng)取蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、葡萄糖 5 g、乙酸鈉0.5 g、酵母提取物0.5 g、檸檬酸二胺0.2 g、磷酸氫二鉀0.02 g、硫酸鎂0.02 g、吐溫80 0.1 g、溴甲酚紫 0.04 g及瓊脂 1.5～2.0 g，加蒸餾水至100 mL，用電磁爐煮至徹底融化后裝瓶備用。

稱(chēng)取0.85 g氯化鈉固體，溶解于100 mL蒸餾水中，再通過(guò)梯度稀釋配制多種梯度的0.85%無(wú)菌生理鹽水。

1.3.3 乳酸菌pH值測(cè)定方法

用移液槍從泡菜缸內(nèi)取5 mL泡菜液于燒杯中，對(duì)pH計(jì)進(jìn)行校正后，對(duì)其進(jìn)行pH測(cè)定。

1.3.4 乳酸菌培養(yǎng)方法

從泡菜缸中取泡菜液，估算合適的梯度，進(jìn)行稀釋平板涂布，并將培養(yǎng)皿封入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋后放入37 ℃光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.5 革蘭氏染色、芽孢染色和接觸酶測(cè)試方法

（1）革蘭氏染色。涂片、干燥，并在酒精燈火焰上過(guò)火固定，然后滴加結(jié)晶紫染色1～2 min，后用水沖洗，接著滴加碘液染色1 min后，用水沖洗，甩盡殘余水，再用95%乙醇沖洗30 s，嚴(yán)格控制時(shí)間和濃度，然后立即用水沖洗。接著用番紅覆蓋涂片進(jìn)行復(fù)染，染3～5 min，水洗，晾干，最后先用低倍鏡觀察，后用高倍鏡觀察。

（2）接觸酶測(cè)試。先在載玻片上加1滴3%H2O2，然后用非金屬接種工具刮取斜面或平板上的培養(yǎng)物與其混合，再用肉眼或低倍鏡觀察其冒氣情況。

（3）芽孢染色。將培養(yǎng)24 h左右的菌體，進(jìn)行涂片、干燥、固定，再滴加3～5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上，用飽和的孔雀綠水溶液（約7.6%）染

10 min，然后傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止，再用番紅水溶液復(fù)染1 min，水洗，最后待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。

1.3.6 乳酸菌形態(tài)、數(shù)量觀察

對(duì)培養(yǎng)的平板上的乳酸菌進(jìn)行肉眼計(jì)數(shù)和放大鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡菜制作過(guò)程的觀察

經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，泡菜第1 d是綠色，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其顏色逐漸變?yōu)辄S色，泡菜液從澄清逐漸變渾濁，這是泡菜發(fā)酵過(guò)程中色素溶解、細(xì)菌代謝、乳酸菌演替所產(chǎn)生的正常現(xiàn)象[4]。

2.2 泡菜液pH值

由圖1可知，未加乳酸菌的泡菜液的pH值隨著發(fā)酵天數(shù)的增加呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，在第3 d左右開(kāi)始逐漸趨于平緩[5]，最終pH值在3.22左右。pH值最開(kāi)始升高是因?yàn)榘l(fā)酵剛開(kāi)始時(shí)蔬菜表面還存在一些革蘭氏陰性好氧菌和一些氧化酵母菌，它們利用最初一段時(shí)間的有氧環(huán)境和乳酸菌產(chǎn)生的乳酸進(jìn)行代謝，造成乳酸消耗，最終讓pH值有短暫的上升過(guò)程。

通過(guò)加入乳酸菌的泡菜液的pH值變化曲線(xiàn)可以看出，pH值從一開(kāi)始便呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，并且在第2 d左右就開(kāi)始逐漸趨于平緩，最終pH值在3.10左右。這與未加乳酸菌不同的原因是加入大量乳酸菌后，從一開(kāi)始乳酸菌就在泡菜中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)生大量乳酸，酵母菌等其他雜菌開(kāi)始便難以生長(zhǎng)，所以pH值從一開(kāi)始便呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。

通過(guò)兩者對(duì)比，可以看出加入乳酸菌的泡菜pH值趨于平緩的時(shí)間要早于未加乳酸菌的泡菜，說(shuō)明加入乳酸菌可以加快泡菜的制作。最終到達(dá)的pH值也是加入乳酸菌的泡菜要略低于未加乳酸菌的泡菜，推測(cè)原因是乳酸菌數(shù)量多所產(chǎn)乳酸也較多，雖然經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的種群數(shù)量變化和乳酸動(dòng)態(tài)變化會(huì)逐漸趨于一致，但是加入乳酸菌的泡菜最后酸性仍會(huì)略強(qiáng)一些。

2.3 乳酸菌優(yōu)勢(shì)度檢驗(yàn)

由圖2革蘭氏染色結(jié)果可以看出，未加乳酸菌粉泡菜液培養(yǎng)基中的菌株和加入乳酸菌粉泡菜液培養(yǎng)基中的菌株幾乎均被染為紫色，只有少量為紅色，說(shuō)明絕大部分菌株都是以乳酸菌為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌。未加乳酸菌粉泡菜液培養(yǎng)基中的菌株少數(shù)呈現(xiàn)紅色的原因可能是有少量酵母菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌在培養(yǎng)第2 d還沒(méi)完全死亡或染色時(shí)番紅染液浸染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)[6]。

由圖3芽孢染色結(jié)果可知，未加乳酸菌粉泡菜液培養(yǎng)基中的菌株和加入乳酸菌粉泡菜液培養(yǎng)基中的菌株幾乎均被染為紅色，極少數(shù)為綠色，說(shuō)明絕大部分都是菌體。極少數(shù)呈現(xiàn)綠色的原因可能是有少量枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌在培養(yǎng)第

2 d天還沒(méi)完全死亡或染色時(shí)孔雀石綠染液浸染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

由圖4接觸酶測(cè)試可知，菌株與H2O2接觸時(shí)肉眼幾乎看不到任何變化，說(shuō)明泡菜缸中的細(xì)菌幾乎不含產(chǎn)氣菌。

綜合以上3個(gè)檢測(cè)試驗(yàn)，可以排除絕大部分革蘭氏陰性菌、芽孢桿菌和產(chǎn)氣菌，說(shuō)明泡菜缸內(nèi)的菌體幾乎全部為革蘭氏陽(yáng)性菌、厭氧細(xì)菌——乳酸菌。

2.4 乳酸菌數(shù)量的觀察

從圖5可以看出，未加乳酸菌的泡菜缸內(nèi)乳酸菌數(shù)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在第4 d數(shù)量達(dá)到最多，且在第7 d后仍會(huì)降低，但推測(cè)會(huì)逐漸趨于平緩。推測(cè)原因是最開(kāi)始乳酸菌數(shù)量還未達(dá)到飽和，鹽分使白菜中的可溶性物質(zhì)進(jìn)入泡菜液為乳酸菌提供營(yíng)養(yǎng)，且逐漸形成的無(wú)氧環(huán)境會(huì)讓乳酸菌在與其他雜菌的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，從而加速增長(zhǎng)，在第4 d數(shù)量由于資源的限制到達(dá)飽和值，且過(guò)多的乳酸抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，其數(shù)量開(kāi)始逐漸下降，但由于實(shí)驗(yàn)天數(shù)有限，因此統(tǒng)計(jì)到第7 d后仍呈下降趨勢(shì)，但推測(cè)會(huì)逐漸趨于平緩，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[7-9]。加入乳酸菌的泡菜缸內(nèi)乳酸菌數(shù)量呈現(xiàn)先下降后趨于平緩的趨勢(shì)，從第5 d開(kāi)始乳酸菌數(shù)量基本保持不變。這可能是因?yàn)閯傞_(kāi)始時(shí)乳酸菌是絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)種群，其數(shù)量超過(guò)了飽和值，因此會(huì)一直下降以達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[10]。

通過(guò)兩者對(duì)比，可以看出加入乳酸菌的泡菜缸內(nèi)乳酸菌數(shù)量相較于未加乳酸菌會(huì)更快到達(dá)穩(wěn)定值，且最后的穩(wěn)定值要更高。

2.5 乳酸菌形態(tài)的觀察

如圖6所示，乳酸菌菌落大致有以下幾種形態(tài)特征：①邊緣整齊，表面光滑，中央有凸起或扁平的白色或乳白色菌落，菌落直徑在0.5～1.0 mm;②邊緣不整齊、表面粗糙無(wú)光澤、中央有凸起或中央扁平的褐色或乳黃色半透明菌落，直徑約為0.5～3.0 mm;③圓形、邊緣整齊、表面光滑、扁平隆起的灰白色菌落，菌落直徑在1.0～2.0 mm;④圓形、邊緣整齊、不透明、中心凸起的乳白色菌落，菌落直徑在1.0 mm左右;⑤圓形邊緣光滑半透明微凸起的白色菌落，菌落直徑在1.0 mm左右。

3 結(jié)論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵的傳統(tǒng)泡菜的pH值會(huì)呈現(xiàn)先升高后降低并在第3 d開(kāi)始逐漸趨于平緩的趨勢(shì)，且最高值出現(xiàn)在第1～2 d，乳酸菌數(shù)量會(huì)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，推測(cè)也會(huì)逐漸趨于平緩，最高值出現(xiàn)在第4 d左右，這是由于乳酸菌在逐漸無(wú)氧的內(nèi)部環(huán)境里逐漸在與其他雜菌的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)的原因。加入乳酸菌發(fā)酵的泡菜的pH值從一開(kāi)始便會(huì)逐漸下降，在第2 d左右就會(huì)逐漸趨于平緩，乳酸菌數(shù)量一開(kāi)始就下降并在第5 d開(kāi)始逐漸趨于平緩，這是由于乳酸菌數(shù)量一開(kāi)始就處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，超過(guò)了資源的可容納范圍，逐漸下降并最終達(dá)到與資源相適應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡。通過(guò)兩種泡菜對(duì)比分析，可以看出加入乳酸菌可以明顯加快泡菜的制作速度，且最后的pH和乳酸菌數(shù)量都會(huì)略多于自然發(fā)酵的泡菜。

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