液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

郭凌霄，謝豐鳴，張倩倩

(山東萬(wàn)達(dá)化工有限公司，山東 東營(yíng) 257500)

0 引言

核磁共振(NMR)是一種得到有機(jī)物詳細(xì)結(jié)構(gòu)的重要方法，但其所需的樣品要為純凈物，當(dāng)有雜質(zhì)存在時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響其對(duì)結(jié)構(gòu)的分析，所以對(duì)混合樣品需要一個(gè)強(qiáng)大的手段對(duì)其進(jìn)行分離純化。眾所周知，液相色譜(LC)是一種高效的分離手段，所以將HPLC和NMR進(jìn)行聯(lián)用是表征混合物的一種強(qiáng)大技術(shù)[1]，在中草藥分析、高分子領(lǐng)域有著廣闊的前景。

然而，LC與NMR的直接聯(lián)用并不簡(jiǎn)單，科學(xué)家花了很長(zhǎng)時(shí)間才引入這種耦合，原因有一下幾點(diǎn)：首先是NMR的靈敏度較低，為了提高靈敏度需要增大流通池的體積，但增大流通池體積會(huì)造成LC的峰展寬；其次，目前NMR所用的溶劑僅限于幾種氘代溶劑，以減小溶劑對(duì)測(cè)量的影響，但如何成功地在各種溶劑中選擇最優(yōu)的溶劑是HPLC需要考慮的重要問題。在實(shí)際應(yīng)用中經(jīng)常使用的梯度洗脫方法并不適用與NMR檢測(cè)，適用于NMR的幾種溶劑顯然無法滿足需求，同時(shí)氘代溶劑價(jià)格昂貴，不適合大量使用。所以LC-NMR聯(lián)用技術(shù)實(shí)際上在解決這些問題。

1 LC-NMR的操作模式

如圖1(a)中，在流(on-flow)模式為從HPLC的色譜柱流出的洗脫液直接被輸送到NMR，核磁共振采集將與色譜一起開始，一系列自由誘導(dǎo)衰變(FID)信號(hào)將在HPLC運(yùn)行的同時(shí)獲得[2]。因此，這一系列FID信號(hào)可以像二維實(shí)驗(yàn)中的第一維那樣處理，從而得到保留時(shí)間—化學(xué)位移的等高線圖。由于需要在洗脫液快速流經(jīng)核磁探頭時(shí)得到核磁共振譜圖，因此需要NMR快速的檢測(cè)，所以這種模式適合分析高濃度樣品。第一個(gè)on-flow實(shí)驗(yàn)是使用了90 MHz的核磁共振波譜儀。儀器配備了含有流通池的流動(dòng)探針，流動(dòng)池是最重要的部分，需要調(diào)整尺寸以同時(shí)適應(yīng)色譜分離和最佳核磁共振靈敏度。試驗(yàn)所報(bào)道的流通池為415 μL，由于超導(dǎo)磁體、低溫探針、溶劑壓制方法的發(fā)展，核磁的靈敏度不斷提高，所以現(xiàn)在所需的流通池也變得更小，目前大多數(shù)流量探針的有效容積為60～120 μL。

圖1(b)顯示了停流(stop-flow)模式，停流模式為控制一種組分進(jìn)入NMR進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過程中NMR檢測(cè)池中溶液不變。當(dāng)一種組分流入NMR后停止HPLC的泵，使待測(cè)物停留在NMR中進(jìn)行多次掃描(增加掃描次數(shù)可以提高NMR的信號(hào))，但停止流動(dòng)后樣品在色譜柱中會(huì)發(fā)生縱向擴(kuò)散，造成峰的展寬，所以不適合分析多組分樣品。在這種情況下，可以進(jìn)行溶劑抑制的一維和二維實(shí)驗(yàn)。核磁共振實(shí)驗(yàn)完成后，流動(dòng)將自動(dòng)恢復(fù)，色譜將尋找下一個(gè)峰隨后停泵。此過程將重復(fù)進(jìn)行，直到色譜圖結(jié)束或程序設(shè)定的停止峰結(jié)束。

圖1(c)和圖1(d)展示了循環(huán)收集和分析的過程，這個(gè)過程也屬于停流模式的一種。當(dāng)HPLC檢測(cè)器檢測(cè)到一個(gè)峰時(shí)，循環(huán)延遲計(jì)數(shù)器將被激活，在某一循環(huán)內(nèi)收集一部分，直到延遲結(jié)束，然后接口將切換到下一個(gè)循環(huán)繼續(xù)收集。待收集完成后，HPLC系統(tǒng)的某些部分被繞過，只有泵起主要作用，儀器將按照程序?qū)⑹占軆?nèi)的樣品按順序進(jìn)行分析。此模式中需要確定兩種延遲：一種為檢測(cè)器中檢測(cè)到的最大LC峰值和環(huán)路中心之間的時(shí)間；另一種為環(huán)路到NMR探針的時(shí)間。對(duì)循環(huán)回路的分析將像停流動(dòng)實(shí)驗(yàn)一樣，收集管內(nèi)相應(yīng)的樣品直接輸送到流動(dòng)池，當(dāng)?shù)竭_(dá)探測(cè)延遲時(shí)，流量將停止，NMR收到信號(hào)開始采集。當(dāng)最后一次NMR采集實(shí)驗(yàn)完成后，泵將恢復(fù)流動(dòng)，并將沖洗出下一個(gè)循環(huán)進(jìn)行分析。此方法對(duì)樣品的分離度要求較高，且儲(chǔ)存的溶液會(huì)被后續(xù)進(jìn)入的溶液稀釋導(dǎo)致靈敏度降低，所以需要樣品濃度較高。

圖1 LC-NMR的操作模式(虛線為不使用路線)

基于FT-NMR較高的靈敏度，HPLC-NMR實(shí)驗(yàn)[3]采用了最容易操作的停流技術(shù)，在HPLC和NMR之間增加了介電常數(shù)檢測(cè)器和兩個(gè)三通閥(如圖2(a)所示)。采用四氯乙烷或四氯化碳作為洗脫劑，實(shí)現(xiàn)了對(duì)三種二甲基苯酚的分離檢測(cè)。為了解決NMR但靈敏度低，采用停流模式可以將分辨率提高制納摩量級(jí)。在該實(shí)驗(yàn)中采用的為第二種方式，實(shí)驗(yàn)需首先確定樣品從HPLC的檢測(cè)器到NMR檢測(cè)器的時(shí)間。圖2(b)展示了樣品從介電常數(shù)檢測(cè)器到NMR出峰的時(shí)間，從圖2中可以看出NMR相較于HPLC檢測(cè)器峰明顯存在展寬，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中均在檢測(cè)到峰值后52 s開啟閥2，使液體不再流入NMR。實(shí)驗(yàn)中采用了四氯乙烷和四氯化碳兩種洗脫劑進(jìn)行洗脫(如圖2(c)和圖2(d)所示)，這兩種洗脫劑均不含有1H，從圖中可以看出可以實(shí)現(xiàn)對(duì)2,6-二甲基苯酚、2,3-二甲基苯酚和3,5-二甲基苯酚進(jìn)行分離。但核磁譜中存在雜質(zhì)峰，其中四氯乙烷作洗脫劑的雜質(zhì)峰更復(fù)雜，當(dāng)采用四氯化碳作為洗脫劑時(shí)的雜質(zhì)峰可以通過脈沖去除。

圖2 LC-NMR聯(lián)用設(shè)備示意圖

2 溶劑峰的壓制

前面已經(jīng)提到，限制LC-NMR發(fā)展的一個(gè)重大的因素是溶劑的問題。普通的溶劑會(huì)在NMR中產(chǎn)生多個(gè)干擾信號(hào)，使用氘代溶劑不劃算且不能應(yīng)用于色譜，當(dāng)使用混合溶劑時(shí)干擾會(huì)更加的嚴(yán)重，所以在NMR技術(shù)中發(fā)展溶劑峰的壓制技術(shù)就變得尤為關(guān)鍵。一般來說，應(yīng)用專門設(shè)計(jì)的脈沖序列進(jìn)行核磁共振測(cè)量會(huì)導(dǎo)致溶劑信號(hào)強(qiáng)度顯著降低或完全被抑制。

發(fā)射預(yù)飽和技術(shù)(PRESAT)技術(shù)為利用一個(gè)施加在主脈沖之前的低功率脈沖來抑制溶劑的信號(hào)，此脈沖可以將特定頻率的質(zhì)子的Zeeman裂分導(dǎo)致的分布平均化，導(dǎo)致無法顯示出核磁的信號(hào)。如果需要抑制更多的信號(hào)，則可以采用多個(gè)通道同時(shí)發(fā)射不同的頻率脈沖對(duì)不同的溶劑峰進(jìn)行預(yù)飽和。預(yù)飽和需要一定的時(shí)間，所以PRESAT技術(shù)只能應(yīng)用在stopflow實(shí)驗(yàn)中。

WATERGATE技術(shù)使用去相位梯度脈沖、180°反轉(zhuǎn)脈沖和重述梯度脈沖來抑制溶劑信號(hào)。WATERGATE脈沖是一個(gè)梯度回波序列，一個(gè)非選擇性的90° RF脈沖均勻地激發(fā)所有核的共振，隨后的對(duì)稱回波段由兩個(gè)具有相同振幅和符號(hào)的短場(chǎng)梯度脈沖與中間的180°選擇性射頻脈沖組成(如圖3所示)。所有在第一個(gè)場(chǎng)梯度脈沖下退相位，只要在選擇性射頻脈沖下經(jīng)歷180°旋轉(zhuǎn)，就會(huì)被第二個(gè)場(chǎng)梯度重新確定相位。如果將選擇性180°脈沖設(shè)計(jì)為溶劑的共振頻率，則其凈旋轉(zhuǎn)接近零，而其余頻率翻轉(zhuǎn)為180°，則在開始采集的那一刻就沒有溶劑信號(hào)了。形狀脈沖明顯比以前的脈沖技術(shù)所需時(shí)間短，所以此技術(shù)對(duì)on-flow和stop-flow實(shí)驗(yàn)均可以使用，也可以與形狀脈沖壓制13C衛(wèi)星峰一起應(yīng)用于on-flow實(shí)驗(yàn)。

圖3 WATERGATE脈沖方案用于抑制溶劑峰

圖3中，射頻脈沖和場(chǎng)梯度脈沖分別顯示在不同的線上。除了標(biāo)準(zhǔn)的非選擇性自旋回波脈沖對(duì)外，兩個(gè)旋轉(zhuǎn)方向相反的選擇性90°脈沖和兩個(gè)形狀的磁場(chǎng)梯度被對(duì)稱地放置在非選擇性180°脈沖上。插入四個(gè)延遲(△)以允許梯度恢復(fù)。

WET序列由四個(gè)不同翻轉(zhuǎn)角度的溶劑選擇形狀脈沖組成，每個(gè)形狀脈沖后面直接跟著一個(gè)退相位梯度脈沖，梯度強(qiáng)度的比率為8∶4∶2∶1(如圖4所示)。因此，溶劑核的磁化在獲得之前就被抵消了。WET可用于多種溶劑抑制，該實(shí)驗(yàn)對(duì)on-flow模式特別有用，因?yàn)樵赟EDUCE脈沖的情況下，形狀脈沖的整個(gè)持續(xù)時(shí)間通常不超過100 ms，當(dāng)然此方法也可以用于stop-flow模式的測(cè)量。

這些實(shí)驗(yàn)是LC-NMR中最常用的解決溶劑峰的方法，當(dāng)然NMR技術(shù)的發(fā)展為溶劑抑制實(shí)驗(yàn)提供了更多的選擇，如：二項(xiàng)式序列、跳躍返回、基于松弛的序列等，優(yōu)化溶劑峰可以有效地提高NMR的分辨率，為L(zhǎng)C-NMR提供更多的支持。

圖4中，四個(gè)選擇性WET RF SEDUCE脈沖的相位為x、y、y和y，梯度脈沖的持續(xù)時(shí)間為2 ms，振幅為32、16、8和4 G/cm，與下一個(gè)RE脈沖間隔為2 ms，場(chǎng)強(qiáng)為100 Hz的選擇性碳去耦與選擇性H去耦脈沖一同使用。

圖4 WET序列應(yīng)用在1D LC-NMR

3 各種模式LC-NMR的應(yīng)用

SEC在分析生物大分子和聚合物等方面有著重要的應(yīng)用，第一個(gè)是SEC-NMR實(shí)驗(yàn)。這項(xiàng)工作使用了配有60 μL流動(dòng)池的500 MHz的NMR光譜儀，測(cè)定了小等規(guī)聚甲基丙烯酸甲酯樣品的摩爾質(zhì)量。NMR可以通過測(cè)定引發(fā)劑封端的叔丁基的信號(hào)來對(duì)摩爾量進(jìn)行直接測(cè)定，由于PMMA分子中只有一個(gè)叔丁基團(tuán)，所以可以將積分歸一化后與-OCH3基團(tuán)的信號(hào)進(jìn)行比較從而得到分子量。

毛細(xì)管高效液相色譜在于NMR聯(lián)用技術(shù)中有巨大的優(yōu)勢(shì)，原因是毛細(xì)管的流量很小，可以使用高成本的氘代試劑作為洗脫劑，在天然產(chǎn)物的分離中有著巨大的應(yīng)用。利用微流NMR對(duì)市售的迷迭香提取物的分析，所用的方法為stop-flow模式，所用的洗脫劑為乙腈-d3和D2O進(jìn)行梯度洗脫。

4 結(jié)語(yǔ)

LC作為高效的分離手段，NMR作為準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)鑒定手段，兩者的聯(lián)用具有非常廣闊的前景，廣泛應(yīng)用在混合物的分離和鑒定中，如中草藥成分鑒定、高分子領(lǐng)域。但由于LC與NMR在溶劑、靈敏度等方面由較大的沖突，所以其聯(lián)用有著較大的困難。解決這些問題的思路主要是通過改進(jìn)一方來適應(yīng)另一方。通過改進(jìn)NMR技術(shù)以適用于LC的有提高FT-NMR的頻率來增加靈敏度、設(shè)計(jì)脈沖序列來去除溶劑效應(yīng)等；通過改進(jìn)LC來適應(yīng)NMR的方法有stop-flow模式和循環(huán)模式、毛細(xì)管色譜采用氘代溶劑等。同時(shí)，許多更先進(jìn)的方法被開發(fā)出來，如：低溫LC-NMR、微流NMR等，為提高LC-NMR的靈敏度等提供了新的思路。