響應(yīng)面法優(yōu)化莼菜多糖的提取工藝及其抗氧化活性的研究

李娉婷，廉爭(zhēng)皓，朱 芹，許明峰

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

莼菜(Braseniaschreberi)為原始花被亞綱睡蓮科莼菜屬多年生淡水水生草本植物[1]，原產(chǎn)于我國(guó)的浙江、四川、重慶等地[2]，其葉片表面有膠狀物質(zhì)包裹.莼菜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，含有多種氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖等人體生命活動(dòng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3-4]，其中鐵、鋅含量較多[5]，莼菜多糖還具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、降血脂等功效[6-7].

莼菜的各個(gè)部位均可食用，在傳統(tǒng)烹飪中，嫩葉部分常用來(lái)煲湯、制作糕點(diǎn)等.賈于晶等[8]研究了莼菜清蛋糕的制作流程與最佳工藝，鮮瑤等[9]利用正交試驗(yàn)得出莼菜保健面包的最佳工藝條件.莼菜還有凈化水質(zhì)作用，可用于水污染的處理.朱秀紅等[10]研究發(fā)現(xiàn)莼菜可以適應(yīng)在污染水體中的培植,能有效地吸收富營(yíng)養(yǎng)化水體中的氮、磷等物質(zhì),既可以美化水域景觀，又可以恢復(fù)水體生態(tài)環(huán)境，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.但目前對(duì)莼菜多糖及其提取工藝的研究還比較少.

本研究以西湖莼菜為原料，通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)莼菜多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并測(cè)定其抗氧化活性，為莼菜的深度開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備

可見分光光度計(jì)(722E，上海光譜儀器有限公司)；分析天平(感量0.000 1 g，F(xiàn)A3204B，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司).

1.2 材料和試劑

新鮮西湖莼菜，購(gòu)于浙江杭州.氫氧化鈉溶液、無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸(均為分析純).葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)粉末、Vc標(biāo)準(zhǔn)品(均為基準(zhǔn)試劑).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水提醇沉提取莼菜多糖

取新鮮莼菜，于70 ℃熱風(fēng)干燥8 h后勻漿機(jī)粉碎.取莼菜粉末，無(wú)水乙醇回流脫脂處理.稱取0.5 g脫脂后的樣品，在不同條件(超聲波功率、提取時(shí)間、提取溫度、液料比)下加0.5%氫氧化鈉溶液作為溶劑進(jìn)行超聲提取.提取后的混合物經(jīng)4 500 r/min離心10 min，取濾液，加入適量的氯仿、正丁醇(濾液、氯仿、正丁醇的體積比為25∶5∶1).將混合物劇烈震搖20 min，離心去除蛋白質(zhì)后，取上清液5 mL，加乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，4 ℃過(guò)夜，混合液5 000 r/min離心15 min得粗多糖.

1.3.2 莼菜多糖提取率的測(cè)定

采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定莼菜多糖的濃度[11].以葡萄糖溶液的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得方程為y=0.011 1x+0.015 2,R2=0.998 9.

按以下公式計(jì)算多糖的提取率：

ω=C×10-3×V×N/m×100%.

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖質(zhì)量濃度(μg/mL)；V為提取液體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；m為莼菜質(zhì)量(mg).

1.3.3 單因素試驗(yàn)

固定其余條件不變，采用單因素試驗(yàn)，研究不同提取時(shí)間、溫度、液料比、超聲波功率等因素對(duì)莼菜多糖提取率的影響.固定液料比40∶1、提取溫度70 ℃、超聲波功率200 W條件下，考察提取時(shí)間(10、20、30、35、40、45 min)對(duì)多糖提取率的影響.固定液料比40∶1、提取時(shí)間30 min、超聲波功率200 W條件下，考察提取溫度(50、60、65、70、75、80 ℃)對(duì)多糖提取率的影響.固定液料比40∶1、提取時(shí)間30 min、提取溫度70 ℃條件下，考察超聲波功率(50、100、150、200、250、300 W)對(duì)多糖提取率的影響.固定提取時(shí)間30 min、提取溫度70 ℃、超聲波功率200 W條件下，考察液料比(20∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1)對(duì)多糖提取率的影響.

1.3.4 莼菜多糖抗氧化活性的測(cè)定

以95%的甲醇為溶劑，將待測(cè)多糖樣品和Vc標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成0.125、0.25、0.5、1、2、3、4 mg/mL的溶液.分別取1 mL 20 μmol/L的DPPH溶液與3 mL上述系列溶液，具塞試管中充分混勻后置于陰暗處，室溫下反應(yīng)30 min，測(cè)定混合溶液在520 nm處的吸光度.

莼菜多糖的抗氧化活性用DPPH自由基清除率表示，計(jì)算公式為:

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲輔助提取中單因素對(duì)莼菜多糖提取率的影響

2.1.1 液料比對(duì)莼菜多糖提取率的影響

由圖1可知，在提取溫度、提取時(shí)間、超聲波功率固定的情況下，莼菜多糖的提取率在一定范圍內(nèi)隨液料比的增加而增加.當(dāng)液料比處于較低水平(20∶1)時(shí)，提取率較低，原因可能是提取溶劑較少、原料過(guò)多而導(dǎo)致的提取不充分.此問題可通過(guò)提高液料比解決.當(dāng)液料比由20∶1增加到40∶1時(shí)，可明顯觀察到提取率的增加，而從40∶1增加到50∶1，提取率卻沒有明顯變化.此現(xiàn)象可能是由于達(dá)到最大液料比后，多糖隨著提取溶劑量的增加而出現(xiàn)一部分的分解導(dǎo)致.綜上所述，液料比的增加無(wú)疑會(huì)帶來(lái)成本的提高，為達(dá)到節(jié)約資源和成本的目的，理想的液料比可設(shè)為40∶1～60∶1.

圖1 不同液料比對(duì)莼菜多糖提取率的影響 Fig.1 Effect of different liquid-solid ratio on yield rate of polysaccharides from Brasenia schreberi圖2 不同提取溫度對(duì)莼菜多糖提取率的影響 Fig.2 Effect of different temperature on yield rate of polysaccharides from Brasenia schreberi

2.1.2 提取溫度對(duì)莼菜多糖提取率的影響

由圖2可知，在液料比、提取時(shí)間、超聲波功率固定的情況下，莼菜多糖的提取率在一定范圍內(nèi)隨提取溫度的升高而增加.當(dāng)溫度由50 ℃升高至70 ℃時(shí)，多糖提取率顯著增長(zhǎng)，其中以60～70 ℃階段增長(zhǎng)尤為顯著.當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃時(shí)，提取率不升反降，推測(cè)其原因在于溫度過(guò)高導(dǎo)致的多糖分解.因此在實(shí)驗(yàn)與工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)應(yīng)盡量避免由于溫度過(guò)高而帶來(lái)的損失，最佳提取溫度可設(shè)為60～80 ℃.

2.1.3 超聲波功率對(duì)莼菜多糖提取率的影響

在液料比、提取時(shí)間、提取溫度固定的情況下，莼菜多糖的提取率在一定范圍內(nèi)隨超聲波功率的增加而增加(圖3)，但當(dāng)功率由50 W增加至200 W時(shí)，提取率的增長(zhǎng)速度卻比液料比、提取溫度下的增長(zhǎng)速度為慢.當(dāng)功率達(dá)到200 W時(shí)可明顯觀察到峰值的出現(xiàn)，隨后多糖提取率有所下降.這可能是由于超聲波的空化作用對(duì)多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響從而導(dǎo)致其分解，造成原料的損耗.因此，在綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本和提取率的前提下，初步判斷最佳功率范圍為100～300 W.

圖3 不同超聲波功率對(duì)莼菜多糖提取率的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic power on yield rate of polysaccharides from Brasenia schreberi圖4 不同提取時(shí)間對(duì)莼菜多糖提取率的影響Fig.4 Effect of different extraction time on yield rate of polysaccharides from Brasenia schreberi

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)莼菜多糖提取率的影響

由圖4可知，在液料比、提取溫度、超聲波功率固定的情況下，莼菜多糖的提取率在一定范圍內(nèi)隨提取時(shí)間的增加而增加.當(dāng)提取時(shí)間在10～30 min時(shí)，多糖提取率隨提取時(shí)間基本呈線性變化，并在35 min時(shí)達(dá)到峰值.當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)35 min后，多糖可能發(fā)生氧化等反應(yīng)，提取率有所下降.結(jié)合時(shí)間成本與多糖提取率等實(shí)際情況，初步設(shè)定最佳提取時(shí)間為20～40 min.

2.2 響應(yīng)面法對(duì)莼菜多糖提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面法分析因素水平的選取

有些時(shí)候，甲洛洛上街碰到澤仁姆，便開玩笑：澤仁姆，哪天晚上我們還是喝瓶酒吧？澤仁姆總是很開朗：你那小小的身板，有多大的酒量啊？甲洛洛笑開了：你不能只說(shuō)看得見的地方，看不見的地方大著呢！澤仁姆哈哈大笑：那可要見識(shí)見識(shí)你的能耐了。

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[12]，結(jié)合莼菜多糖提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取液料比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)對(duì)莼菜多糖提取率影響較大的因素，通過(guò)三因素三水平的試驗(yàn)方法對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化[13]，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1.

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Tab.1 Factors and their levels for the response surface design

2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

以液料比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)為單因素，莼菜多糖提取率(Y)為響應(yīng)值，響應(yīng)面法設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2.

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab.2 Box-Benhnken design for independent variables and observed responses

利用Design Expert 8.0.5b程序軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到莼菜多糖提取率(Y)對(duì)液料比(A)、提取溫度(B)和提取時(shí)間(C)的三元二次回歸方程為Y=6.36+0.16A+0.027B+0.44C+0.023AB+0.12AC+0.086BC-0.35A2-0.45B2-0.79C2.

對(duì)回歸方程進(jìn)行響應(yīng)面二次模型的方差分析和顯著性檢驗(yàn).由表3可知，回歸模型達(dá)到極顯著水平(P<0.000 1)；失擬項(xiàng)P值為0.405 3，大于0.05，說(shuō)明二次多項(xiàng)式模型擬合較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，能夠較好地用回歸方程來(lái)代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)而通過(guò)方程擬合各因素對(duì)多糖提取率的影響.液料比、提取時(shí)間對(duì)多糖提取率有顯著影響(P< 0.01)，而提取溫度對(duì)多糖提取率的影響較小.AB、AC、BC三者P值均大于0.01，說(shuō)明液料比、提取溫度、提取時(shí)間的兩兩交互作用對(duì)多糖提取率影響不顯著.

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果Tab.3 Response variance analysis results of the regression model

續(xù)表3

2.2.3 響應(yīng)面圖與等高線圖分析

依據(jù)多元二次回歸方程繪制響應(yīng)面圖可直觀地反映出不同因素之間的交互作用，并確定各個(gè)因素的最佳取值范圍.等高線圖則可反映兩因素之間交互作用的強(qiáng)弱，當(dāng)?shù)雀呔€為橢圓時(shí)，表明兩因素交互作用顯著，等高線為圓形時(shí)交互作用不顯著[14-15].圖5—7為液料比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素在三水平上對(duì)莼菜多糖提取率的響應(yīng)面曲線和對(duì)應(yīng)的等高線圖.

圖5 提取時(shí)間和液料比交互作用對(duì)莼菜多糖提取率的響應(yīng)面及其等高線Fig.5 Interaction of time and liquid-solid ratio on the yield of polysaccharides and its contour

由圖5可見，三維圖形中響應(yīng)面傾斜程度較小且較圓，表明液料比和提取時(shí)間二者的交互作用對(duì)莼菜多糖提取率的影響并不大.等高線圖顯示極值點(diǎn)位于等高線橢圓圓心處，表明在合適的液料比、提取時(shí)間下可得到最佳提取率.當(dāng)液料比不變時(shí)，多糖提取率隨時(shí)間的增加表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)；當(dāng)提取時(shí)間不變時(shí)，多糖提取率隨液料比的增加先增加后趨于平緩.

液料比和提取溫度二者的交互作用對(duì)莼菜多糖提取率的影響不顯著，但相較而言，提取溫度影響較大，因此，在圖6所示三維響應(yīng)面圖中可觀察到提取溫度面較液料比更為傾斜、陡峭.在等高線圖中，極值點(diǎn)存在于圓心處.由此可見，適當(dāng)液料比、提取溫度的條件下，莼菜多糖的提取率可達(dá)到最大.當(dāng)液料比固定時(shí)，多糖提取率隨提取溫度的升高而增加，達(dá)到最大值后緩慢減少.同理，當(dāng)提取溫度固定時(shí)，多糖提取率隨液料比的增加而增加.

圖6 提取溫度和液料比交互作用對(duì)莼菜多糖提取率的響應(yīng)面及其等高線Fig.6 Interaction of temperature and liquid-solid ratio on the yield of polysaccharides and its contour

圖7結(jié)果表明，提取時(shí)間與提取溫度二者交互作用對(duì)多糖提取率的影響較小.在三維響應(yīng)面中，曲面傾斜程度不大且較為平緩，而極值點(diǎn)位于等高線圖的圓心位置，表明在適當(dāng)提取溫度、提取時(shí)間下，可達(dá)到最佳提取率.在等高線圖中，當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)，多糖提取率隨提取溫度的變化最為明顯.當(dāng)提取溫度不變時(shí)，多糖提取率隨提取時(shí)間的增加先上升后緩慢下降.

圖7 提取時(shí)間和提取溫度交互作用對(duì)莼菜多糖提取率的響應(yīng)面及其等高線Fig.7 Interaction of time and temperature on the yield of polysaccharides and its contour

2.2.4 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面分析數(shù)據(jù)及各交互作用所得二維、三維圖形可確定液料比(A)、提取時(shí)間(C)、A2、B2、C2對(duì)多糖提取率有較顯著影響，B、AB、AC、BC四者對(duì)多糖提取率影響較小.由此推斷各種因素對(duì)莼菜多糖提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，可通過(guò)得出的回歸方程確定最佳提取工藝：超聲波功率200 W，液料比42.82∶1，提取時(shí)間30.66 min，提取溫度73.04 ℃，此條件下多糖提取率為6.454%.為驗(yàn)證數(shù)據(jù)可靠性，結(jié)合試驗(yàn)條件與工藝水平，在超聲波功率200 W、液料比43∶1、提取時(shí)間31 min、提取溫度73 ℃條件下，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得多糖的平均提取率為6.446%，與理論預(yù)測(cè)值較為接近.綜上所述，此響應(yīng)面法優(yōu)化莼菜多糖提取的工藝參數(shù)可靠.

2.3 莼菜多糖抗氧化活性的研究

由圖8可見，莼菜多糖具有一定的抗氧化活性，并且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴的趨勢(shì)：當(dāng)莼菜多糖質(zhì)量濃度較低時(shí)，抗氧化活性較低，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到3 mg/mL時(shí)，莼菜多糖和Vc對(duì)DPPH自由基的清除率分別達(dá)到39.62%和100%，可見莼菜多糖也具有較強(qiáng)的抗氧化活性.因此莼菜多糖作為一種天然活性物質(zhì)，具有一定的開發(fā)潛力.

圖8 不同質(zhì)量濃度的Vc與莼菜多糖對(duì)DPPH的清除率Fig.8 The clearance rate of DPPH of Vc and polysaccharides with different concentration

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用超聲輔助提取得到莼菜多糖，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了多糖的提取工藝，其最佳提取條件為超聲波功率200 W、液料比42.82∶1、提取時(shí)間30.66 min、提取溫度73.04 ℃，此條件下多糖提取率為6.454%.此外，通過(guò)DPPH法得到莼菜多糖最大的DPPH自由基清除率為39.62%，具有較強(qiáng)的抗氧化活性.本研究為莼菜多糖的開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù).