基于PCR-CE技術(shù)的NFC橙汁與FC橙汁鑒別

孫瑞雪，邢冉冉，張九凱，葛毅強，張葳葳，陳 穎,

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；3.中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心，北京 100045；4.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京 100083）

隨著人們生活水平的提高以及健康意識的增強，純果汁受到消費者的喜愛[1]。純果汁分為復(fù)原果汁（from concentrate，F(xiàn)C）和非復(fù)原果汁（not from concentrate，NFC）兩大類。GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》[2]中指出，采用機械方法直接制成的可發(fā)酵但未發(fā)酵，未經(jīng)濃縮的汁液制品為原榨果汁即非復(fù)原果汁；在濃縮果汁中加入其加工過程中除去的等量水分復(fù)原而成的為復(fù)原果汁。相比FC橙汁，NFC橙汁因其營養(yǎng)健康和純天然的特征，更接近甜橙原果品的品質(zhì)，消費者喜愛度更高，競爭優(yōu)勢日益顯現(xiàn)，產(chǎn)業(yè)發(fā)展也較為迅速。據(jù)統(tǒng)計，2017—2018年間，歐盟果汁市場FC果汁銷售量降低了2.6%，NFC果汁銷售量增加了2.1%[3]。根據(jù)歐睿國際公布的2019中國果汁報告顯示，2013—2018年間，國內(nèi)市場NFC果汁的零售量由580萬 升增長至4 600萬 升，市場銷售規(guī)模從3億 元增長至25.7億 元[4]。當(dāng)前，NFC橙汁的價格約為FC橙汁價格的2～3 倍[5]。在經(jīng)濟利益的驅(qū)使下，不法商販利用低價FC橙汁冒充高價NFC橙汁進行銷售，極大地損害了消費者的利益[6]。因此，開展NFC橙汁與FC橙汁的真?zhèn)舞b別方法研究，對保護消費者利益，維護果汁市場秩序具有重要意義。

關(guān)于NFC果汁與FC果汁的真?zhèn)舞b別，近年來開始成為人們的關(guān)注熱點，已有利用光譜、電子鼻、穩(wěn)定同位素質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜等技術(shù)開展的相關(guān)研究。如Shen Fei等[7]針對鮮榨橙汁中摻入濃縮橙汁的問題，利用電子鼻和傅里葉變換近紅外光譜技術(shù)，結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析方法，建立了濃縮橙汁與鮮榨橙汁線性判別分析模型，鑒別準確率分別為91.7%和87.5%。W?odarska等[8]利用同步熒光光譜技術(shù)，比較分析了市售NFC蘋果汁和FC蘋果汁的熒光特性，發(fā)現(xiàn)非酶褐變產(chǎn)物的熒光信號是區(qū)分NFC蘋果汁和FC蘋果汁的關(guān)鍵因素，結(jié)合偏最小二乘判別分析模型，可區(qū)分兩類蘋果汁。此外，近年還有學(xué)者利用實時直接分析離子源結(jié)合四極桿飛行時間質(zhì)譜對NFC橙汁和FC橙汁進行了鑒別，偏最小二乘判別分析模型預(yù)測集及驗證集準確率分別為97%和95%[6]。上述方法在一定程度上實現(xiàn)了NFC果汁和FC果汁的鑒別，但是容易受到原料產(chǎn)地、生產(chǎn)條件、品種以及果汁加工方式、貯藏條件等因素的影響，且不同品牌、批次、地域橙汁差異較大，對方法的準確性造成影響[9]。與基于代謝產(chǎn)物進行分析的方法相比，基于核酸的分子生物學(xué)技術(shù)由于其判別產(chǎn)物是遺傳物質(zhì)，不受到上述因素的影響[10-11]，能夠保證判別結(jié)果的準確性，已應(yīng)用于不同品種果汁的鑒別中。例如，柑橘與甜橙的葉綠體亮氨酸-tRNA合成酶-苯丙氨酸-tRNA合成酶間區(qū)基因（tRNA-Leu-tRNAPhe gene，TrnL-TrnF）存在8 bp堿基差異，基于該差異相關(guān)學(xué)者利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）[12]、實時PCR[13-15]等技術(shù)為柑橘汁冒充橙汁的問題提供了鑒別方法。然而，由于NFC橙汁屬于一種新型果汁，相關(guān)的標準出現(xiàn)較晚，尚需不斷完善。目前采用分子生物學(xué)技術(shù)鑒別NFC橙汁與FC橙汁的研究鮮有報道，個別文獻僅評價了加熱對橙汁DNA完整性影響[16-17]，但仍未解決如何鑒別FC橙汁冒充NFC橙汁的問題。

由于NFC橙汁與FC橙汁加工工藝不同，NFC橙汁加工條件往往相對溫和，而FC橙汁需經(jīng)過濃縮、復(fù)配、二次殺菌等工藝[18]，導(dǎo)致2 類橙汁的DNA降解程度存在差異。因此本研究按照2 類橙汁的主流生產(chǎn)工藝[19-20]，選取哈姆林、早金、特洛維塔3 種市場上常見適宜加工的甜橙品種[21]，結(jié)合自制和市售的NFC橙汁、FC橙汁，通過研究關(guān)鍵加工單元操作對甜橙葉綠體成熟酶K蛋白基因（maturase K，matK）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶基因（nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase，ndhF）的DNA降解規(guī)律的影響，挖掘NFC橙汁與FC橙汁DNA完整性的差異，建立兩類橙汁的分子生物學(xué)定性鑒別方法，以期為果汁行業(yè)有序健康發(fā)展及有效監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

特洛維塔、哈姆林、早金3 種甜橙（Citrus sinensisL.Osbeck）橙果由重慶派森百橙汁有限公司提供，產(chǎn)地為重慶忠縣；15 種市售NFC橙汁（編號NFC1～NFC15）購自北京連鎖超市。

DP320新型植物基因組提取試劑盒 天根生化科技有限公司；高保真Taq酶、高保真Taq酶緩沖液、三磷酸脫氧核糖核苷酸混合液 大連寶生物工程有限公司；無水乙醇 北京六合通公司；5067-1505 DNA 1000試劑盒美國安捷倫公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Wahlei壓榨機 德國Wahlei公司；WZB阿貝折光儀上海精密分析儀器廠；APV-2000均質(zhì)機 德國APV公司；STEPHAN UM5破碎機 德國Stephan公司；JYZ-V911多功能原汁機 九陽股份有限公司；R308真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 美國Senco公司；1083型恒溫振蕩水浴德國GFL公司；UHT殺菌機 上海銳元機械設(shè)備有限公司；5920R型冷凍高速離心機 德國艾本德公司；渦旋振蕩器、MS3芯片混勻儀 德國IKA公司；Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；2100生物分析儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

自制NFC橙汁：3 種不同品種的甜橙果實采摘后，運抵濟南果品研究院中式車間。選取新鮮無霉變的橙果，流水沖洗橙皮表面污漬，去皮、切半、破碎后進行榨汁，紗布過濾后制得鮮榨橙汁；利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在室溫下進行脫氣，再于20 MPa壓力下均質(zhì)得到均質(zhì)橙汁；最后經(jīng)巴氏殺菌（80 ℃、10 min）后迅速冷卻灌裝得到NFC橙汁。

自制FC橙汁：將NFC橙汁置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在60 ℃濃縮至（65±1）°Brix，再加入濃縮過程中去除的等量水分復(fù)原，經(jīng)二次巴氏殺菌（80 ℃、10 min）后冷卻灌裝制得FC橙汁。

關(guān)鍵加工單元橙汁：收集榨汁、均質(zhì)、巴氏殺菌（NFC橙汁）、濃縮、二次巴氏殺菌（FC橙汁）關(guān)鍵加工單元橙汁。

1.3.2 橙汁DNA提取及分析

按照天根新型植物基因組提取試劑盒（DP320）說明書提取橙汁樣品DNA。使用NanoDrop核酸蛋白分析儀檢測DNA的濃度，以A260/A280比值判斷DNA純度。

1.3.3 引物設(shè)計

基于甜橙葉綠體matK（GenBank No.AB762345.1）和ndhF（GenBank No.NC_008334）基因序列，采用Primer Premier5[22]軟件自行設(shè)計了擴增不同長度目標條帶的8對引物。采用植物通用擴增引物plant159F/R（來自RuBPCase基因）用以驗證提取DNA的質(zhì)量[23]，擴增條帶長度為159 bp。以上引物均由生工生物（上海）股份有限公司合成，具體引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences for PCR amplification

1.3.4 PCR擴增及產(chǎn)物毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）檢測

PCR擴增均采用25 μL反應(yīng)體系，包括：10×高保真Taq酶緩沖液2.5 μL，三磷酸脫氧核糖核苷酸混合液2 μL，高保真Taq酶0.2 μL，10 μmol/μL上下游引物各0.5 μL，1 ng/μL的DNA模板10 μL，加無菌去離子水至25 μL。matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R、matK4-F/R、ndhF1-F/R、ndhF2-F/R、ndhF3-F/R、ndhF4-F/R引物對的PCR擴增反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。通用引物plant159F/R的PCR擴增反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min[23]。上述8 組自行設(shè)計的引物對分別進行PCR擴增反應(yīng)后，將matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R、matK4-F/R引物對的PCR產(chǎn)物和ndhF1-F/R、ndhF2-F/R、ndhF3-F/R、ndhF4-F/R引物對的PCR擴增產(chǎn)物分別等量混合。使用生物分析儀對混合PCR擴增產(chǎn)物進行CE分析，流程如下：準備注膠平臺，加入9 μL核酸凝膠染料制備芯片，在芯片樣品孔中各加入5 μL指示條帶混合液，分子質(zhì)量標準孔中加入1 μL DNA分子質(zhì)量標準溶液，相應(yīng)標記的樣品孔中加入4 μL混合PCR擴增產(chǎn)物。利用芯片混勻儀渦旋混勻1 min后上樣分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對DNA濃度和純度進行單因素方差分析，結(jié)果表示為，方差分析采用LSD法[24]，P＜0.05，為有效統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標基因的確定和特征差異性片段組合的篩選

獲得高質(zhì)量DNA是建立NFC橙汁和FC橙汁PCR-CE鑒別方法的基礎(chǔ)。本研究中，鮮榨、均質(zhì)、巴氏殺菌、濃縮、二次殺菌前后關(guān)鍵加工單元橙汁提取的DNAA260/A280值在1.1～1.5之間，質(zhì)量濃度在4.6～9.17 ng/μL之間（表2）。基于植物通用引物plant159F/R均可擴增出長度為159 bp的目標條帶，表明本研究提取的各關(guān)鍵加工工藝中橙汁DNA（表2），適用于后續(xù)PCR鑒別方法的研究。

表2 關(guān)鍵加工單元中橙汁提取DNA的濃度和純度Table 2 Concentration and purity of DNA extracted from orange juice from key processing units

由于NFC橙汁與FC橙汁加工工藝不同，因此會造成DNA降解程度的不同。研究分析橙汁關(guān)鍵加工工藝對DNA降解的影響，闡明NFC橙汁和FC橙汁DNA降解變化情況，能夠為從DNA層面實現(xiàn)二者的區(qū)分提供依據(jù)和方法。本研究以特洛維塔甜橙為研究對象，選取NFC橙汁和FC橙汁加工過程中的榨汁、均質(zhì)、巴氏殺菌、真空蒸發(fā)濃縮、二次巴氏殺菌作為關(guān)鍵加工工藝，采用8 組引物對，對上述關(guān)鍵加工工藝處收集的橙汁樣品DNA分別進行不同長度目標條帶的擴增，研究不同加工工藝條件對橙汁matK和ndhF基因的DNA降解影響。擴增結(jié)果表明，特洛維塔甜橙經(jīng)榨汁和均質(zhì)處理得到的橙汁樣品DNA，經(jīng)8 組引物對PCR擴增后，均能得到目標條帶（圖1），說明榨汁和均質(zhì)的機械力作用對橙汁matK和ndhF基因的DNA降解影響較小。橙汁經(jīng)巴氏殺菌處理后，DNA發(fā)生降解，無法擴增出matK基因中長度為1 515 bp和ndhF基因中長度為1 807、1 044 bp的目標條帶，只能擴增出長度相對短的（972、498、276、512、372 bp）5 條目標條帶。說明巴氏殺菌可造成橙汁matK和ndhF基因的DNA降解。橙汁經(jīng)濃縮處理后，與巴氏殺菌工藝相比較發(fā)現(xiàn)，擴增結(jié)果基本一致，說明濃縮處理對橙汁matK和ndhF基因的DNA降解影響較小。FC橙汁經(jīng)二次巴氏殺菌處理后，與巴氏殺菌和濃縮處理比較而言，最大的差別在于長度為972 bp的matK基因目標條帶降解至無法檢出。由此說明，榨汁、均質(zhì)及濃縮處理對橙汁matK和ndhF基因的DNA降解影響較小，巴氏殺菌對橙汁2 個基因的DNA降解影響較大，二次巴氏殺菌處理對橙汁matK基因的DNA降解影響較大。本研究結(jié)果表明加熱會顯著影響目的基因的DNA降解，這與文獻報道一致，Chen Ying等[25]發(fā)現(xiàn)豆乳加工過程中的熱處理是導(dǎo)致豆乳DNA降解的關(guān)鍵步驟之一，而均質(zhì)處理未引起目標DNA條帶長度的顯著性變化。此外，該現(xiàn)象在其他食品基質(zhì)中也有發(fā)現(xiàn)，研究表明大豆、玉米焙烤及阿膠加工過程中的熱處理均會造成其DNA明顯程度的降解[26-28]。相比豆乳、玉米等食品基質(zhì)，橙汁的pH值（3.5～3.8）較低[29]，在加熱狀態(tài)下可加速酸催化反應(yīng)，加劇了DNA的降解程度。

圖1 橙汁加工過程中葉綠體基因matK和ndhF不同片段的PCR-CE擴增結(jié)果Fig.1 PCR-CE results obtained for different fragments of chloroplast genes matK and ndhF during orange juice processing

在本研究中，ndhF2-F/R和matK3-F/R引物對分別可擴增長度為1 044 bp和972 bp的目標條帶。經(jīng)巴氏殺菌后，長度略短且GC含量較高的matK3-F/R引物對擴增的目標條帶仍可檢出，而長度略長且GC含量較低的ndhF3-F/R引物對擴增的目標條帶無法檢出。以往研究結(jié)果表明，食品加工過程中，較短DNA片段穩(wěn)定性大于長的DNA片段[28]。除受目標條帶長度影響外，GC含量也是引起DNA降解的重要因素。當(dāng)DNA片段長度接近時，經(jīng)高溫處理后，GC含量高的片段的穩(wěn)定性要高于GC含量低的片段。Xing Fuguo等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，在米飯經(jīng)過蒸煮之后，GC含量為51.4%的Cry1Ab片段（142 bp）的穩(wěn)定性明顯高于GC含量為50.6%、48.6%的SPS片段（160 bp）和Pubi片段（142 bp）。此外，機械力作用也是引起食品DNA降解的關(guān)鍵因素[31]。本研究中橙汁榨汁和均質(zhì)處理的機械力強度不大，因此未對橙汁DNA降解產(chǎn)生顯著影響[25]。

綜上，由于NFC橙汁與FC橙汁經(jīng)ndhF1-F/R、ndhF2-F/R、ndhF3-F/R、ndhF4-F/R引物對擴增后，均可擴增出ndhF基因中長度為372 bp和512 bp的目標條帶，擴增結(jié)果一致。而NFC橙汁可分別由matK1-F/R、matK2-F/R和matK3-F/R引物對擴增出甜橙葉綠體matK基因中長度為276、498 bp和972 bp的目標條帶，F(xiàn)C橙汁僅可擴增出長度為276 bp和498 bp的目標條帶。因此，本研究選取matK基因為目標基因，將matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R引物組擴增的長度為276、498、972 bp目標條帶作為鑒別NFC橙汁與FC橙汁的特征差異性基因片段組。

2.2 貨架期內(nèi)NFC橙汁與FC橙汁特征差異性片段組穩(wěn)定性分析

市售NFC橙汁的貨架期一般為28 d。在貯藏過程中，乳酸菌發(fā)酵引起的pH值降低以及微生物菌落數(shù)量增加引起的核酸酶作用增強，會加快DNA的降解速度[31-33]。因此，為研究matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R引物組擴增的目標條帶能否在保質(zhì)期內(nèi)的NFC橙汁中穩(wěn)定存在，本研究將特洛維塔NFC橙汁與FC橙汁置于4 ℃條件下進行市售NFC橙汁貯藏模擬實驗，并分別于0、7、14、21、28 d取橙汁提取DNA后進行PCR擴增。如圖2所示，特洛維塔NFC橙汁4 ℃貯藏0～28 d后，其DNA仍可擴增出長度為276、498 bp和972 bp的目標條帶，F(xiàn)C橙汁的DNA可擴增出長度為276 bp和498 bp的目標條帶。說明在橙汁保質(zhì)期內(nèi)，用于區(qū)分NFC橙汁和FC橙汁的特征差異性基因片段組可穩(wěn)定存在，從而避免假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

圖2 matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R引物組對貨架期內(nèi)的特洛維塔NFC橙汁與FC橙汁的PCR-CE擴增結(jié)果Fig.2 PCR-CE results obtained for Trovita NFC orange juice and FC orange juice within shelf life with matK1-F/R,matK2-F/R and matK3-F/R

2.3 方法適用性分析

為驗證matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R引物組擴增的長度為276、498 bp和972 bp目標條帶組在鑒別NFC橙汁和FC橙汁中的適用性，本研究選取由特洛維塔、早金及哈姆林3 種甜橙自制的NFC橙汁和FC橙汁，提取DNA后進行PCR擴增。擴增結(jié)果顯示，陽性對照（鮮榨橙汁）和3 種NFC橙汁均可擴增出長度為276、498 bp和972 bp的目標條帶，3 種FC橙汁僅可擴增出長度為276 bp和498 bp的目標條帶（圖3），說明matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R引物組擴增的目標條帶組可適用于NFC橙汁和FC橙汁的鑒別。

圖3 matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R引物對自制NFC橙汁與FC橙汁PCR-CE擴增結(jié)果Fig.3 PCR-CE results obtained for NFC orange juice and FC orange juice manufactured in laboratory with matK1-F/R,matK2-F/R and matK3-F/R primers

2.4 市售NFC橙汁樣品的檢測

采用建立的PCR-CE方法對15 份市售NFC橙汁進行鑒定，結(jié)果如表3所示。市售NFC橙汁NFC1～NFC13樣品可擴增出276、498 bp和972 bp的目標條帶，說明該橙汁樣品中檢出可表征NFC橙汁存在的特征差異性基因片段組，進而表明NFC1～NFC13樣品中存在NFC橙汁成分。而市售NFC橙汁NFC14和NFC15樣品僅可擴增出276 bp的目標條帶，說明這2 個橙汁樣品中無法檢出可表征NFC橙汁存在的特征差異性基因片段組，進而表明樣品中不含NFC橙汁成分，存在標簽不符合的現(xiàn)象。

表3 市售NFC橙汁與FC橙汁鑒別結(jié)果Table 3 Results of identification of commercial NFC orange juice and FC orange juice

3 結(jié)論

以NFC橙汁和FC橙汁為對象，以常規(guī)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，利用不同加工工藝橙汁中葉綠體matK基因的DNA降解程度的差異，建立一種基于PCR-CE技術(shù)的NFC橙汁與FC橙汁定性鑒別方法。并對方法的穩(wěn)定性和適用性進行分析。此外，基于建立的PCR-CE方法對市售NFC橙汁樣品進行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分市售NFC橙汁存在標簽錯誤的問題。本研究可為FC橙汁、橙汁飲料完全冒充NFC橙汁等摻假問題的評判提供解決方案，為NFC橙汁的品質(zhì)評價和真?zhèn)舞b別提供技術(shù)支撐。后續(xù)可將新型熱殺菌和非熱殺菌等不同殺菌方式均納入研究范圍，并開展NFC橙汁含量定量檢測研究，以進一步完善NFC橙汁真?zhèn)螜z測方法，為有效監(jiān)控NFC橙汁質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。