HS-SPME-GC-MS聯(lián)用及電子鼻分析不同提取方法油莎豆油香氣特征

辛明航，曹 旭，滕 旭，包陳力根，劉婷婷,，王大為,

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省糧食精深加工與高效利用工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.吉林省糧食精深加工與副產(chǎn)物高效利用技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食用菌加工技術(shù)集成科研基地，吉林 長(zhǎng)春 130118）

油莎豆是一種單子葉禾本科開花植物，在根莖的末端產(chǎn)生可食球形塊莖[1]，因其氣味與杏仁相似，又稱地下杏仁，油脂含量在20%～30%之間[2]。在非洲和地中海的一些地區(qū)，油莎豆油早已成為日常消費(fèi)的食用油，其脂肪酸組成豐富，含量最多的是油酸，但多不飽和脂肪酸（亞油酸和亞麻酸）含量相對(duì)較低[3-4]。此外，油莎豆油中還含有多種微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其香氣獨(dú)特且濃郁，無(wú)不愉快氣味，適合日常生活食用[5-6]。

植物油的香氣在影響消費(fèi)者選擇上具有重要作用，揮發(fā)性化合物是其產(chǎn)生獨(dú)特香氣特征的基礎(chǔ)物質(zhì)[7]。植物油中揮發(fā)性化合物的種類很多，受多種因素影響，如油料的品種產(chǎn)地、成熟程度、儲(chǔ)藏條件及提取方法的差異等[8-9]，而提取方法是影響其變化的重要因素。它們決定了揮發(fā)性化合物的組成及含量，進(jìn)而影響油脂的香氣特征[10]。

提取方法對(duì)植物油揮發(fā)性化合物的構(gòu)成有一定影響，國(guó)內(nèi)外已有一定研究，Dun Qian等[11]采用頂空-固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction，HS-SPME）聯(lián)合氣相色譜-質(zhì)譜-嗅覺(jué)（gas chromatographymass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）測(cè)定研究了熱榨和冷榨花生油揮發(fā)性物質(zhì)的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)熱榨花生油的揮發(fā)性物質(zhì)種類明顯高于冷榨花生油，且花生經(jīng)焙烤后產(chǎn)生了特有的吡嗪類物質(zhì)。彭常梅等[12]采用HS-SPMEGC-MS聯(lián)用對(duì)5 種方法提取的牡丹籽油揮發(fā)性成分進(jìn)行分析比較，得出不同提取工藝對(duì)其揮發(fā)性成分有較大影響，且α-甲基肉桂醛、己醛及棕櫚酸乙酯等是共有的揮發(fā)性化合物。周靖等[13]研究了不同制油工藝對(duì)番茄籽油品質(zhì)的影響，研究得出壓榨工藝會(huì)增加油脂氧化程度，產(chǎn)生醛、酮、酸等揮發(fā)性化合物。

油莎豆油研究多集中在提取工藝優(yōu)化上，對(duì)不同提取方法油莎豆油揮發(fā)性物質(zhì)的比較分析、根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成區(qū)分不同方法及確定不同提取方法油莎豆油香氣特征的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用超臨界CO2萃取法、壓榨法、浸出法、水酶法提取油莎豆油，運(yùn)用HSSPME-GC-MS對(duì)不同樣品的揮發(fā)性化合物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合電子鼻分析及相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV），對(duì)不同提取方法油莎豆油的進(jìn)行區(qū)分鑒定以及關(guān)鍵風(fēng)味化合物進(jìn)行確定，以期為油莎豆油揮發(fā)性成分研究提供參考，為油莎豆油品質(zhì)控制及提取方法的鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油莎豆由長(zhǎng)春市萬(wàn)龍油莎豆公司提供，產(chǎn)地為吉林省長(zhǎng)嶺縣；油莎豆經(jīng)清洗除雜，40 ℃烘箱烘干，粉碎過(guò)60 目篩后使用；二氧化碳（純度99.9%） 長(zhǎng)春氧氣廠；Cellulase 1.5L纖維素酶、Alcalase 2.4L堿性蛋白酶丹麥諾維信有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZYJ90型榨油機(jī) 江門市貝爾斯頓電器有限公司；HA121-50-02超臨界萃取裝置 南通華安超臨界萃取有限公司；TSQ9000 GC-MS聯(lián)用儀、TG-5 MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.20 μm） 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取頭、SPME手柄 美國(guó)Supelco公司；HWS12型恒溫水浴鍋 上海一恒儀器有限公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；PNE3型電子鼻 德國(guó)Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 油莎豆油的制備

1.3.1.1 超臨界CO2萃取法

參照文獻(xiàn)[14]的方法，稍作修改。適量油莎豆粉裝入超臨界萃取裝置的料缸中，設(shè)置參數(shù)：萃取壓力25 MPa、萃取溫度45 ℃、萃取時(shí)間3 h，萃取結(jié)束后分離釜接取油莎豆油，收集經(jīng)8 000 r/min離心10 min的上層清油，置于棕色瓶中4 ℃保存。

1.3.1.2 壓榨法

采用螺旋榨油機(jī)對(duì)烘干的整粒油莎豆直接進(jìn)行壓榨，得到油莎豆油經(jīng)8 000 r/min離心10 min，將上層清油置于棕色瓶中4 ℃保存。

1.3.1.3 浸出法

參照文獻(xiàn)[15]方法，稍作修改。稱取適量油莎豆粉用無(wú)脂濾紙包裹，以石油醚為溶劑，40 ℃索氏抽提4 h，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃除去石油醚，將油莎豆油置于棕色瓶中4 ℃保存。

1.3.1.4 水酶法

參照文獻(xiàn)[16]的方法，稍作修改。稱取一定量油莎豆粉，加入蒸餾水（料液比1∶7（g/mL）），調(diào)節(jié)pH 4.8，按1 200 U/g 添加纖維素酶，溫度50 ℃，酶解3 h，再調(diào)節(jié)pH 9.0，按2 400 U/g添加堿性蛋白酶，酶解3 h，然后在95 ℃條件下滅酶15 min，冷卻至室溫后離心，將油脂置于棕色瓶中4 ℃保存。

1.3.2 HS-SPME操作條件

參照文獻(xiàn)[17]，稍作修改。稱2.00 g油莎豆油于8 mL頂空玻璃瓶中，立即進(jìn)行密封，在50 ℃恒溫平衡30 min。插入完成老化的65 μm PDMS/DVB萃取頭，推出含涂層纖維頭，萃取30 min，待萃取完畢后迅速插到GC進(jìn)樣口，緩慢推出纖維頭，250 ℃解吸4 min，每個(gè)樣品做3 次重復(fù)。

1.3.3 GC-MS分析條件

GC條件：TG-5 MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.20 μm）；升溫程序：40 ℃保持4 min；以4 ℃/min升至85 ℃，保持2 min；以2 ℃/min升至110 ℃，保持15 min；以10 ℃/min升至280 ℃，保持3 min；載氣為高純度氦氣，流速1.2 mL/min，分流比5∶1，進(jìn)樣口溫度250 ℃。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸管線溫度280 ℃；離子源溫度280 ℃；溶劑延時(shí)1 min；質(zhì)量掃描范圍m/z40～550。

揮發(fā)性化合物的定性或定量：對(duì)總離子流圖中的各峰通過(guò)NIST及WILEY譜庫(kù)進(jìn)行鑒定，保留正反匹配度大于800的結(jié)果；采用峰面積歸一化法對(duì)定性的物質(zhì)進(jìn)行定量分析[18]。

1.3.4 電子鼻分析

參照文獻(xiàn)[19]方法，稍作修改。取2.00 g油莎豆油于20 mL頂空瓶中，置于室溫平衡氣體30 min，使用電子鼻電子探頭測(cè)定揮發(fā)物質(zhì)。測(cè)定條件：樣品間隔時(shí)間1 s，清洗時(shí)間80 s，歸零時(shí)間10 s，內(nèi)部流量400 mL/min，進(jìn)樣流量100 mL/min，測(cè)量時(shí)間60 s，選取56～58 s響應(yīng)值數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。電子鼻傳感器見(jiàn)表1。

1.3.5 關(guān)鍵風(fēng)味化合物確定

揮發(fā)性化合物的感覺(jué)閾值和相對(duì)含量共同決定其在氣味中的作用強(qiáng)度，參考文獻(xiàn)[20]計(jì)算ROAV，根據(jù)ROAV確定揮發(fā)性化合物對(duì)油莎豆油樣品的貢獻(xiàn)，以確定關(guān)鍵風(fēng)味化合物。定義對(duì)油莎豆油樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)度最大組分ROAVstan為100，其他組分ROAV按下式計(jì)算：

式中：CA、TA為該組分的相對(duì)含量/%、感覺(jué)閾值/（μg/kg）；Cstan、Tstan為對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的相對(duì)含量/%、感覺(jué)閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)采用Excel 2016整理，雷達(dá)圖、主成分分析（principal component analysis，PCA）采用SPSS 22.0及Origin 2018進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 油莎豆油的揮發(fā)性化合物組成分析

揮發(fā)性成分對(duì)選擇植物油具有先導(dǎo)性作用，對(duì)植物油的風(fēng)味尤為重要[21]。以相同地理環(huán)境、品種、生長(zhǎng)期的油莎豆為原料，對(duì)不同提取方法油莎豆油揮發(fā)性化合物的組成及相對(duì)含量進(jìn)行分析，除去萃取頭及色譜柱流失峰，總共對(duì)101 種揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定，包括醛類12 種、醇類10 種、酮類5 種、烷烴類15 種、烯烴類6 種、酯類26 種、酚類8 種、醚類2 種、雜環(huán)類12 種、其他5 種。揮發(fā)性化合物的總數(shù)分別為超臨界法34 種，壓榨法51 種，浸出法59 種，水酶法70 種，4 種方法的共有成分22 種（表2）。Lasekan[17]采用超臨界法提取經(jīng)焙烤后油莎豆的油脂，并對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，共鑒定出75 種揮發(fā)性化合物，顯著高于本實(shí)驗(yàn)超臨界法萃取的油莎豆油，略高于水酶法的油莎豆油，分析可能是實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)過(guò)焙烤產(chǎn)生了更多的揮發(fā)性物質(zhì)。

表2 不同提取方法油莎豆油揮發(fā)性化合物的組成及相對(duì)含量Table 2 Composition and relative content of volatile compounds in C.esculentus oils obtained by different methods

續(xù)表2

續(xù)表2

從圖1可以看出，4 個(gè)油莎豆油樣品揮發(fā)性化合物中，酯類物質(zhì)數(shù)量明顯多于其他物質(zhì)，其中水酶法數(shù)量最多（25 種），與其他方法相差不大；浸出法樣品的烷烴類化合物相對(duì)含量最大（31.07%），另外3 種方法相差不大，在5.39%～9.32%之間；醛類與雜環(huán)類物質(zhì)種類均為12 種，但醛類物質(zhì)的占比遠(yuǎn)高于雜環(huán)類物質(zhì)，且超臨界法未檢出雜環(huán)類物質(zhì)；醇類、酮類、酚類及烯烴類物質(zhì)相對(duì)含量較低、種類個(gè)數(shù)相對(duì)較少，但每種方法均有測(cè)出。上述可以表明，不同提取方法對(duì)油莎豆油揮發(fā)性物質(zhì)種類及相對(duì)含量均存在影響。

圖1 不同提取方法油莎豆油揮發(fā)性化合物種類數(shù)量（A）及相對(duì)含量（B）Fig.1 Number (A) and relative content (B) of volatile compounds in C.esculentus oils obtained by different methods

在植物油揮發(fā)性風(fēng)味中醛類化合物普遍存在，主要由不飽和脂肪酸的氧化反應(yīng)產(chǎn)生，多數(shù)醛類化合物有較好風(fēng)味，對(duì)植物油風(fēng)味起著積極貢獻(xiàn)[22]。壬醛一般為油酸、亞油酸的氧化分解產(chǎn)物，苯甲醛一般被認(rèn)為是苯丙氨酸的降解產(chǎn)物，為油莎豆油提供油脂、柑橘、杏仁及焦糖香氣[23]，在超臨界法及壓榨法油莎豆油檢測(cè)出的含量相對(duì)較高；徐星[24]對(duì)多種食用植物油的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)，在除亞麻籽油外的樣品中均檢測(cè)出壬醛及苯甲醛；α-(2-甲基亞丙基)苯乙醛為芳香醛類，產(chǎn)生于美拉德反應(yīng)，由相應(yīng)的醇醛縮合生成，具有可可、花香、蜜甜香氣等[25-26]；超臨界法油莎豆油中香蘭素相對(duì)含量最高為6.77%，只有壓榨法油莎豆油中未檢測(cè)出此物質(zhì)，Lasekan[17]的研究得出香蘭素是油莎豆油特征香氣成分之一。

醇類化合物是生成長(zhǎng)鏈酯類化合物的重要前體物質(zhì)，大部分醇類化合物的閾值相對(duì)較高[27-28]，對(duì)油莎豆油香氣貢獻(xiàn)較低。4 個(gè)樣品中均檢測(cè)出柏木腦，其閾值較低，為油莎豆油貢獻(xiàn)木香。烷烴類化合物的香氣閾值普遍較高，對(duì)植物油整體香氣貢獻(xiàn)度不大[29]；浸出法油莎豆油中檢測(cè)出的戊烷相對(duì)含量較高（25.41%），作為石油醚的主要構(gòu)成成分，這可能是由于浸出法提取油脂最終石油醚未除凈的原因；4 個(gè)樣品中檢測(cè)出主要的烯烴類物質(zhì)為α-蒎烯及D-檸檬烯，且這2 種化合物香氣閾值較低，對(duì)油莎豆油貢獻(xiàn)松木香、針葉香及檸檬香。

植物油中酯類化合物最主要的來(lái)源是由脂肪酸降解產(chǎn)生的醇與游離脂肪酸反應(yīng)產(chǎn)生，主要貢獻(xiàn)甜香味[30]。其中，鄰苯二甲酸酯及檸檬酸三乙酯常用作塑料增塑劑，這可能來(lái)源于油莎豆油制備或檢測(cè)過(guò)程中的污染；水酶法油莎豆油中酯類化合物種類（25 種）及相對(duì)含量（45.66%）明顯高于其他方法，這可能是在水存在的環(huán)境中能夠使油莎豆油產(chǎn)生更多游離脂肪酸，加速酯化反應(yīng)，彭常梅等[12]的研究也表明水酶法提取植物油可能會(huì)催化產(chǎn)生更多的酯類化合物。

雜環(huán)類化合物大部分香氣閾值較低，主要是由美拉德反應(yīng)產(chǎn)生[11,31]。浸出法油莎豆油中發(fā)現(xiàn)雜環(huán)類化合物種類最多，且絕大多數(shù)是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，其中2,5-二甲基-3-(3-甲基丁基)吡嗪相對(duì)含量最高，具有堅(jiān)果、木香味；在浸出法核桃油及亞麻籽油中也檢測(cè)出較多的雜環(huán)類化合物[10,32]。壓榨法油莎豆油中僅檢測(cè)出一種雜環(huán)類化合物，雜環(huán)類化合物產(chǎn)生較少可能是壓榨前未進(jìn)行炒籽處理或氨基酸和糖類化合物比例不恰當(dāng)造成[33]。超臨界萃取法油莎豆油中并未檢測(cè)到雜環(huán)類化合物，這可能是因?yàn)槌R法提取油莎豆油的環(huán)境條件不適合發(fā)生相關(guān)美拉德反應(yīng)，例如物料水分較低，且環(huán)境密封無(wú)空氣流通[34]。

綜上分析可知，油莎豆油呈現(xiàn)的風(fēng)味并非某一種化合物貢獻(xiàn)，而是眾多揮發(fā)性化合物作用于人的嗅覺(jué)器官產(chǎn)生，不同樣品間的揮發(fā)性化合物種類和相對(duì)含量差距較大，可以根據(jù)其變化對(duì)不同提取方法油莎豆油進(jìn)行鑒別。

2.2 油莎豆油揮發(fā)性化合物的PCA

為進(jìn)一步分析不同提取方法油莎豆油揮發(fā)性化合物的差異，對(duì)油莎豆油揮發(fā)性化合物進(jìn)行PCA[35]。如圖2A所示，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為45.2%和38.0%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為83.2%，這說(shuō)明PC1及PC2可以較好反映大部分樣品信息。4 個(gè)油莎豆油樣品的整體區(qū)分度較好，水酶法和浸出法的樣品分別處于第4、2象限，前者對(duì)PC1有正響應(yīng)值，后者對(duì)PC2有正響應(yīng)值，二者存在明顯區(qū)別；超臨界法和壓榨法的樣品共同處于第3象限，對(duì)PC1、PC2均為負(fù)響應(yīng)值，二者距離較近，說(shuō)明這2 個(gè)樣品存在一定相似性，而在圖2B中，3 個(gè)PC的累計(jì)貢獻(xiàn)率為97.8%，能夠反映樣品信息，二者具有明顯的區(qū)分度。

圖2 不同提取方法油莎豆油揮發(fā)性化合物PCA二維圖（A）和三維圖（B）Fig.2 2D (A) and 3D graphs (B) of PCA of volatile compounds in C.esculentus oils obtained by different methods

2.3 油莎豆油的電子鼻分析

圖3A結(jié)合表1可以得出，不同提取方法油莎豆油在傳感器W2W、W2S、W1W及W1S上的響應(yīng)值較大且差異明顯，而在其余6 個(gè)傳感器上響應(yīng)值幾乎重疊，說(shuō)明其對(duì)芳香成分、有機(jī)硫化物、硫化物、醇類、醛酮類及甲基類靈敏。4 種方法樣品在W1S上響應(yīng)最為敏感且差異最明顯，其次為W2S、W1W、W2W；超臨界法和壓榨法油莎豆油在W2S上，比其他2 種方法具有更高的響應(yīng)值，結(jié)合表2發(fā)現(xiàn)其可能的原因是這2 種方法樣品中醛類、酮類及醇類揮發(fā)性化合物總含量較高。

圖3 不同提取方法油莎豆油電子鼻雷達(dá)圖（A）及PCA二維圖（B）Fig.3 Electronic nose radar diagram (A) and 2D graph of PCA (B) of C.esculentus oils obtained by different methods

由圖3B可知，PC1、PC2的貢獻(xiàn)率分別為80.4%、12.6%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為93.0%，能夠反映品絕大部分信息。4 種方法油莎豆油樣品區(qū)分度較好，組內(nèi)重復(fù)性良好，說(shuō)明不同油莎豆油樣品的氣味存在較大區(qū)別，電子鼻能夠?qū)? 種提取方法油莎豆油進(jìn)行鑒別。超臨界法及壓榨法油莎豆油樣品組間距離相對(duì)較近，說(shuō)明這2 種樣品區(qū)別較小，具有一定相似性，從圖3A也可以看出，這2 種方法在各傳感器的響應(yīng)值接近，且在揮發(fā)性化合物PCA結(jié)果中二者組間距離也較近，結(jié)果具有一致性。

2.4 油莎豆油關(guān)鍵風(fēng)味化合物分析

ROAV法是評(píng)價(jià)風(fēng)味化合物對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)度的一種方法。一般根據(jù)ROAV的大小將風(fēng)味化合物進(jìn)行分類，ROAV不小于1的組分為樣品的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，0.1≤ROAV＜1的組分對(duì)樣品的總體風(fēng)味具有重要的修飾作用。

表3僅列出ROAV大于0.1的揮發(fā)性化合物，其中4 種方法油莎豆油樣品中壬醛的ROAVstan均被定義為100。超臨界法樣品關(guān)鍵風(fēng)味化合物的貢獻(xiàn)度依次為壬醛＞柏木腦＞十二醛＞4-乙烯基-2-甲氧基苯酚＞D-檸檬烯＞香蘭素＞α-蒎烯；壓榨法樣品關(guān)鍵風(fēng)味化合物的貢獻(xiàn)度依次為壬醛＞十二醛＞4-乙烯基-2-甲氧基苯酚＞柏木腦＞D-檸檬烯＞α-蒎烯＞正己醛；浸出法樣品關(guān)鍵風(fēng)味化合物的貢獻(xiàn)度依次為壬醛＞2-乙基-3,6-二甲基吡嗪＞柏木腦＞2-十一酮＞香蘭素＞D-檸檬烯＞壬醇＞椰子醛；水酶法樣品關(guān)鍵風(fēng)味化合物的貢獻(xiàn)度依次為壬醛＞柏木腦＞4-乙烯基-2-甲氧基苯酚＞十二醛＞香蘭素＞丙位十二內(nèi)酯＞D-檸檬烯＞2-戊基呋喃；其他揮發(fā)性化合物對(duì)樣品有重要的修飾作用。4 種方法油莎豆油樣品中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物共有成分為壬醛、柏木腦及D-檸檬烯，張麗涵[37]對(duì)亞麻籽油中揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)壬醛及D-檸檬烯等對(duì)亞麻籽油的呈香有較大貢獻(xiàn)。

表3 不同提取方法油莎豆油揮發(fā)性化合物的ROAVTable 3 ROAV of volatile compounds in C.esculentus oils obtained by different methods

3 結(jié)論

通過(guò)HS-SPME-GC-MS聯(lián)用及電子鼻對(duì)不同提取方法油莎豆油揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析，利用ROAV法對(duì)不同提取方法油莎豆油的關(guān)鍵風(fēng)味化合物進(jìn)行確定。結(jié)果表明，4 個(gè)油莎豆油樣品中共鑒定出101 種揮發(fā)性化合物，共有成分為22 種。不同提取方法油莎豆油揮發(fā)性化合物的組成及相對(duì)含量差距較大，超臨界法及壓榨法樣品中醛類化合物含量最大，浸出法樣品中烷烴類化合物含量最大，水酶法樣品中酯類化合物含量最大，且可以利用PCA將不同提取方法油莎豆油進(jìn)行區(qū)分；且電子鼻與HSSPME-GC-MS分析結(jié)果有良好的一致性；4 個(gè)油莎豆油樣品的關(guān)鍵風(fēng)味化合物數(shù)量之間無(wú)較大差別，壬醛、柏木腦及D-檸檬烯為共有的關(guān)鍵風(fēng)味化合物。