DCE-MRI定量參數(shù)評(píng)估直腸癌分化程度及Ki67表達(dá)的應(yīng)用價(jià)值研究

李 玉，張鳳翔（通訊作者），張 芳

（1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 014000；2.鄂爾多斯市中心醫(yī)院 影像科，內(nèi)蒙古 017000）

直腸癌因其高發(fā)病率和高死亡率已經(jīng)成為當(dāng)今關(guān)系公共衛(wèi)生健康的重要問題。分子細(xì)胞學(xué)知識(shí)的進(jìn)步以及生物標(biāo)志物的檢測對(duì)腫瘤預(yù)測、早期診斷和改善預(yù)后非常重要［1］，一個(gè)可靠的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)協(xié)助臨床進(jìn)行精準(zhǔn)治療大有裨益［2］。Ki67是已知的直腸癌中預(yù)測腫瘤行為和預(yù)后的可靠指標(biāo)，Ki67的高表達(dá)與直腸癌的侵襲性和預(yù)后不良密切相關(guān)［3］。然而，有創(chuàng)性的組織免疫學(xué)檢測難以重復(fù)，且活檢樣本可能因?yàn)椴蓸拥臈l件、技術(shù)等外在因素的影響而不能全面反映腫瘤表達(dá)的異質(zhì)性。DCE-MRI圖像清晰，且定量分析可以評(píng)價(jià)腫瘤組織的灌注及滲透特性，因此在科研與臨床工作中廣泛應(yīng)用［4］。本文旨在探究DCE-MRI定量參數(shù)Ktrans值、Kep值和Ve值與直腸癌分化程度及生物學(xué)指標(biāo)Ki67表達(dá)高低之間的關(guān)系，探究通過無創(chuàng)方式反映腫瘤的病理進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，為協(xié)助臨床診療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供一定的指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究收集2020年10月至2021年12月于鄂爾多斯市中心醫(yī)院行DCE-MRI掃描的直腸腺癌患者43例，其中男 28例，女15例，年齡（67±11.4）歲，其中高分化組16例、中分化組21例、低分化組6例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①檢查前未進(jìn)行放化療；②術(shù)后病理學(xué)診斷為直腸腺癌；③檢查后一周內(nèi)行直腸癌根治術(shù)，且術(shù)后病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①圖像質(zhì)量差，無法進(jìn)行后處理者；②有MRI檢查禁忌癥者；③腫瘤體積太小無法準(zhǔn)確測量者。

1.2 MRI檢查方法

告知患者提前做好腸道清潔準(zhǔn)備，檢查前5分鐘內(nèi)通過注射鹽酸消旋山莨菪堿20mg抑制腸道蠕動(dòng)，避免運(yùn)動(dòng)偽影造成的影響。采用HDXT GD 3.0T磁共振掃描儀及腹部線圈，患者取仰臥位，DCEMRI掃描前行MRI常規(guī)平掃。掃描序列如下：①軸位 T1WI：TR550ms、TE8.9ms、FOV46x46cm、 層 厚6mm； ② 軸 位 抑 脂 T2WI：TR5280ms、TE140ms、FOV46x46cm、層厚 6mm；③冠狀位抑脂 T2WI：TR5640ms、TE110ms、FOV43x45cm、層厚 5mm；④矢狀 位 T2WI：TR5220ms、TE109ms、FOV32x32cm、 層厚 5mm； ⑤ T2WI 小 FOV：TR5220ms、TE109ms、FOV32x32cm、層厚 3mm；⑥軸位 DWI：TR5000ms、TE94.2ms、b=800s/mm2、FOV40x 40cm、 層 厚 6mm。DCE-MRI動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描，采用美國GE公司的LAVA序列。 參數(shù)如下：TE1.1ms，TR2.9ms，F(xiàn)OV40x40cm，層厚3.6mm。以病變?yōu)橹行膾呙?個(gè)蒙片（反轉(zhuǎn)角度為3°，6°，9°，12°，15°）后，以 12°翻轉(zhuǎn)角進(jìn)行動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描，應(yīng)用磁共振專用高壓注射器通過肘靜脈套管（20G）團(tuán)注美國GE藥業(yè)的造影劑歐乃影（釓雙胺注射液），劑量為 0.2mmol/kg，速率為 3.5ml/s，注射完畢后緊接追加20ml生理鹽水沖管，對(duì)比劑注射同時(shí)連續(xù)進(jìn)行40個(gè)期相的動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描?？倰呙钑r(shí)間為7分5秒。

1.3 圖像分析及處理

使用OmniKinetics軟件對(duì)DCE-MRI定量參數(shù)Ktrans值、Kep值和Ve值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。獲取動(dòng)脈輸入函數(shù)（Arterial Input Function，AIF）曲線模型，以病灶強(qiáng)化最為明顯的區(qū)域?yàn)橹行?，手?dòng)繪制病灶感興趣 區(qū) （Region Of Interest，ROI），ROI 大 小 約 3.0-3.5cm2，且每個(gè)ROI測量3-5次取平均值。采用Extended Tofts Linear雙室模型，獲得Ktrans（容積轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)）、Kep（速率常數(shù)）、Ve（細(xì)胞外間隙分?jǐn)?shù)）的參數(shù)圖譜，并自動(dòng)生成Excel表格，最后整理數(shù)據(jù)。以上所有DCE-MRI定量資料的分析獲取均由2名中級(jí)以上影像科醫(yī)師各自獨(dú)立分析完成后取平均值。見圖1。

圖1 患者男，65歲，腸鏡提示直腸癌，病理提示中分化腺癌。1A：T2WI圖像示直腸左前壁不均勻增厚 ；1B：Ktrans偽彩圖，病變區(qū)Ktrans=0.750/min ；1C：Kep偽彩圖，病變區(qū)Kep=0.458/min ；1D：Ve偽彩圖，病變區(qū)Ve=0.631

1.4 免疫組化檢測Ki67

將取下的腫瘤標(biāo)本于福爾馬林溶液固定后，采用石蠟包埋組織切片（4μm）用二甲苯預(yù)處理，梯度酒精水化。待應(yīng)用pH值為6.0的檸檬酸鹽緩沖液沖洗切片后進(jìn)行烘干冷卻。然后在室溫下應(yīng)用磷酸鹽緩沖鹽水清洗后加入抗體、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑、蘇木精復(fù)染色等完成切片染色。Ki67陽性的定位位于細(xì)胞核，顯示為在相應(yīng)部位呈現(xiàn)棕黃色顆粒。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（×400）進(jìn)行陽性細(xì)胞率的計(jì)算，同一視野中陽性細(xì)胞數(shù)與1 000個(gè)癌細(xì)胞之間的百分比為其增殖指數(shù)。最終的結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為［5］：鏡檢細(xì)胞中若Ki67陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性（-），10%～50%為陽性（+），陽性細(xì)胞率>50%為強(qiáng)陽性（++）。且將其分為兩組，其中Ki67低于50%的列為低表達(dá)組，高于50%的列為高表達(dá)組。見圖2。

圖2 直腸癌組織中Ki67表達(dá) （免疫組化×200）A：Ki67高表達(dá)；B：Ki67低表達(dá)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理使用Rstudio軟件進(jìn)行分析，使用ggplot2、ggsignif、pROC包繪圖。所有計(jì)數(shù)資料待驗(yàn)證其正態(tài)性后，將符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述；Ki67高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；直腸癌高分化組、中分化組、低分化組組間比較采用Mann-Whithey U檢驗(yàn)的方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；比較不同DCE-MRI定量參數(shù)對(duì)診斷Ki67表達(dá)的靈敏度、特異度，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分化程度與DCE-MRI定量參數(shù)的關(guān)系

在直腸癌不同分化程度的組間比較中（見表1），Ktrans值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （F=5.969，P=0.005），Kep值和 Ve值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （F=1.111，P=0.339；F=0.121，P=0.886）。直腸癌高分化組的 Ktrans值為0.378±0.261/min，直腸癌中分化組的 Ktrans值為 0.742±0.627/min，直腸癌低分化組的 Ktrans值為 1.143±0.336/min。其中，高分化組Ktrans明顯低于中分化組及低分化組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.029，P=0.002）；而中分化組和低分化組之間的Ktrans無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.082）（見圖 3）。

圖3 直腸癌不同分化組DCE-MRI定量參數(shù)Ktrans箱圖

表1 不同分化程度直腸癌的DCE-MRI定量參數(shù)比較（±s）

表1 不同分化程度直腸癌的DCE-MRI定量參數(shù)比較（±s）

變量 高分化組 中分化組 低分化組 F P Ktrans0.378±0.261 0.742±0.627 1.143±0.336 5.969 0.005 Kep 0.344±0.251 0.363±0.244 0.521±0.309 1.111 0.339 Ve 0.421±0.611 0.454±0.373 0.349±0.194 0.121 0.886

2.2 Ki67表達(dá)水平與DCE-MRI定量參數(shù)的關(guān)系

在 Ki67 低表達(dá)組（n=16）和高表達(dá)組（n=27）的比較中，兩組間Ktrans和Kep值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （t=2.682，P=0.014；t=2.386，P=0.0023）， 兩組間的 Ve值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-0.135，P=0.800）。 Ki67高表達(dá)組的Ktrans值及Kep值顯著高于低表達(dá)組且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 不同Ki67表達(dá)水平的DCE-MRI定量參數(shù)比較（±s）

表2 不同Ki67表達(dá)水平的DCE-MRI定量參數(shù)比較（±s）

變量 ki67高表達(dá)組 ki67低表達(dá)組 F P Ktrans 0.822±0.598 0.460±0.382 2.692 0.014 Kep 0.451±0.257 0.286±0.230 2.386 0.023 Ve 0.394±0.356 0.379±0.225 -0.135 0.800

2.3 DCE-MRI的定量參數(shù)對(duì)直腸癌腫瘤細(xì)胞中Ki67表達(dá)水平的ROC曲線分析

ROC曲線分析顯示，Ki67兩組間診斷Ktrans值的臨界值為0.675/min，靈敏度和特異度分別為73%、41%；兩組間Kep值的臨界值為0.214/min，靈敏度和特異度分別為87%、53%。Ki67兩組間診斷Ve值靈敏度及特異度均較低（46%，37%），見表3。

表3 不同Ki67表達(dá)水平的DCE-MRI定量參數(shù)效能分析

3 討論

動(dòng)態(tài)增強(qiáng)磁共振（DCE-MRI）的工作原理是通過靜脈注射順磁性釓類造影劑后，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)掃描出多期圖像，進(jìn)而從影像的不同表現(xiàn)中研究器官或腫瘤組織中造影劑的攝取情況［6］。因?yàn)樵煊皠┑臄z取量取決于微循環(huán)，所以將圖像經(jīng)過處理后可獲得與微循環(huán)相關(guān)的灌注參數(shù)［7］。Ktrans（min-1）是指體積轉(zhuǎn)移常數(shù)，它描述的是造影劑從血漿轉(zhuǎn)移到組織的速率，間接反映腫瘤局部微血管的血流狀態(tài)及通透表面積。Kep（min-1）是指轉(zhuǎn)移速率常數(shù)，它描述了造影劑從血管外細(xì)胞外間隙到血漿室的回流速率，間接反映腫瘤微血管的生長狀態(tài)。Ve（%）是指從血管外細(xì)胞外間隙滲透到血漿室中的部分體積，其大小代表EES中對(duì)比劑的容量，反映腫瘤細(xì)胞的增殖及壞死情況［8］。

DCE-MRI作為新興的現(xiàn)代化影像技術(shù)，可以綜合組織形態(tài)學(xué)和血流動(dòng)力學(xué)變化的特征，從而進(jìn)一步評(píng)估腫瘤的分化程度［9］。從本研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，直腸癌高分化組的Ktrans值顯著低于中、低分化組，很有可能是因?yàn)榉只潭鹊偷哪[瘤因組織缺氧情況嚴(yán)重，進(jìn)而刺激血管進(jìn)入再生狀態(tài)，灌注量明顯增加，血管滲透面積隨之增大。除此之外，分化程度低的腫瘤在細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織學(xué)上均表現(xiàn)出更高的異質(zhì)性。由于細(xì)胞密度的增高，細(xì)胞間質(zhì)變小，因而Ktrans值更高。本研究中的Kep值和Ve值與腫瘤分化程度高低均沒有明顯相關(guān)性，這與Shen等（2016）［9］研究結(jié)果相一致。雖然Kep值和Ve值與腫瘤的血管外、細(xì)胞外空間組成有關(guān)，但在不同分化狀態(tài)的病變中，血管外、細(xì)胞外空間的組成并沒有明顯差異。Ki67是一項(xiàng)反映細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，在細(xì)胞分裂進(jìn)展中起到重要作用，且其表達(dá)的高低程度與細(xì)胞增殖高度相關(guān)［10-11］。本研究結(jié)果顯示，Ki67高表達(dá)組的Ktrans值、Kep值均高于低表達(dá)組的值，但Ve值的高低與腫瘤細(xì)胞中Ki67表達(dá)的多少無明顯相關(guān)性。Ki67高表達(dá)提示腫瘤增殖更加活躍，微血管增多，微循環(huán)加速，因此Ktrans、Kep值升高。本研究DCEMRI定量參數(shù)的ROC曲線分析顯示，Ktrans、Kep對(duì)評(píng)估直腸癌Ki67表達(dá)程度具有較高的靈敏度，可為直腸癌ki67表達(dá)程度提供參考。當(dāng)然，本研究也存在一定的不足。首先，進(jìn)行收集且符合入組標(biāo)準(zhǔn)的樣本量偏少。其次，Ki67表達(dá)程度需進(jìn)一步細(xì)化分組，進(jìn)行與DCE-MRI定量參數(shù)的相關(guān)性研究。這些不足可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成偏倚。后續(xù)為了確保DCEMRI定量參數(shù)在直腸癌診療中的可參考性，還需要對(duì)大量樣本進(jìn)行研究。

綜上所述，DCE-MRI定量分析彌補(bǔ)了常規(guī)磁共振只進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)估的不足，能在一定程度上無創(chuàng)地反映直腸癌分化程度和Ki67表達(dá)情況，為臨床診療提供依據(jù)。