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    阿膠活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定及活性篩選

    2022-06-02 08:42:58王瑩雪樊雨梅于志鵬
    食品科學 2022年10期
    關鍵詞:殘基阿膠靶標

    王瑩雪,樊雨梅,廖 峰,于志鵬

    (1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧 錦州 121013;2.國家膠類中藥工程技術研究中心,東阿阿膠股份有限公司,山東 聊城 252201;3.海南大學食品科學與工程學院,海南 ???570228)

    阿膠是采用馬科動物驢的鮮皮或干皮經(jīng)去毛漂泡、煎煮、濃縮,并加入冰糖、豆油等輔料制成的固體膠,也被稱為驢皮膠,主要成分是膠原蛋白、多肽和硫酸皮膚素,其中蛋白質(zhì)含量較高約為60%~80%。阿膠具有補血止血、增強免疫、抗疲勞、抗衰老、抑制腫瘤、促進骨愈合和滋陰潤肺等作用?,F(xiàn)代藥理研究表明阿膠可能對白血病K562細胞和肺癌PG細胞等癌細胞的生長具有抑制作用,可以抑制荷瘤S180肉瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤生長并延長模型小鼠的存活時間。體外細胞實驗證明阿膠酶解物對阿爾茲海默癥(老年癡呆癥)具有改善作用,抑制了神經(jīng)元樣PC12細胞中的乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase,AChE)活性,阻止了過氧化氫誘導的AChE異常惡化,提高了淀粉樣蛋白的清除率。

    阿膠發(fā)揮主要功效的組分以多肽和蛋白質(zhì)為主,尤其酶解后的小分子阿膠肽分子質(zhì)量在1 000 Da以下,分子質(zhì)量的降低使阿膠具有較好的溶解性,更容易被機體消化吸收,減輕了阿膠的滋膩性,提高了阿膠的生物利用率。另外,樊雨梅等證明了阿膠低聚肽清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)陽離子自由基和減輕HO誘導的成纖維細胞氧化損傷的效果優(yōu)于阿膠。因此,從分子質(zhì)量低于1 000 Da的阿膠多肽中篩選降壓肽、抗老年癡呆肽和抗腫瘤肽等活性肽具有重要的商業(yè)價值和應用前景。

    本研究利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技術分離鑒定阿膠模擬胃腸道消化產(chǎn)物中活性肽的結(jié)構(gòu),重點圍繞六肽、七肽和八肽與受體靶標進行分子對接,篩選具有降血壓、抗腫瘤和抗老年癡呆活性的阿膠肽。本研究將有助于揭示阿膠發(fā)揮多種生物活性的組分及其作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    阿膠(批號:1502004) 東阿阿膠股份有限公司。

    純水、乙腈、甲酸、三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)(均為質(zhì)譜純) 美國Fisher Scientific公司;碳酸氫銨(生化純) 美國Sigma公司。

    1.2 儀器與設備

    10 kDa超濾管(Amicon ultra,Centrigμgal Filter) 德國Merck Millipore公司;EASY-nLC 1000超高壓納升級液相色譜儀、Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀、納升級肽段分析柱(Acclaim PepMap C,75 μm×250 mm) 美國Thermo Scientific公司;alpha1-2LD冷凍干燥機 德國Christ公司;制冰機 日本松下公司;sep-Pak C除鹽柱(100 mg) 美國Waters公司。

    1.3 方法

    1.3.1 消化液的配制

    根據(jù)2015版《中國藥典》規(guī)定的方法,取5 mL鹽酸(12 mol/L)加水至19 mL配制成稀鹽酸,取0.82 mL稀鹽酸,加約40 mL水和0.5 g胃蛋白酶,搖勻使其充分溶解,調(diào)節(jié)pH值至1.3,加水定容至50 mL,制成人工胃液。取0.34 g磷酸二氫鉀,加25 mL水使其溶解,用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8,另外稱取0.5 g胰蛋白酶加適量水溶解,兩液混合后,加水定容至50 mL,制成人工腸液。

    1.3.2 阿膠胃腸道消化產(chǎn)物的制備

    取2 g阿膠粉末溶于50 mL 60 ℃熱水中,稱取10 mL放入圓底燒瓶中,加入10 mL人工胃液,封口,置于37 ℃恒溫振蕩水浴鍋內(nèi)水浴2 h。胃液消化結(jié)束后,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8,加入20 mL人工腸液,繼續(xù)恒溫攪拌4 h。消化結(jié)束后,將混合溶液進行冷凍干燥,收集固體粉末避光保存。

    1.3.3 阿膠活性肽的分離

    取120 mg模擬胃腸道消化后的阿膠固體粉末溶于1 mL 1%甲酸溶液中,冰上超聲10 min使其充分裂解。隨后4 ℃、20 000×離心30 min取上清液。吸取400 μL上清液使用10 kDa超濾管超濾(10 000×)至40 μL,收集濾液得到阿膠活性肽溶液。

    1.3.4 阿膠活性肽的除鹽

    首先用含0.1% TFA和80%乙腈的水溶液200 μL活化除鹽柱,再用含0.1% TFA和1%乙腈的水溶液400~600 μL平衡除鹽柱。將阿膠活性肽溶液緩慢流過平衡后的除鹽柱收集多肽,鹽等其他非疏水性小分子流出。加入含0.1% TFA和0.5%乙腈的水溶液200 μL清洗除鹽柱,洗去殘留鹽類。最后,用含0.1% TFA和80%乙腈的水溶液300 μL將除鹽柱中的多肽洗脫下來,洗脫液收集到EP管中冷凍干燥。

    1.3.5 阿膠活性肽的LC-MS/MS分析

    1.3.5.1 LC條件

    流動相:A為0.1%甲酸溶液,B為0.1%甲酸-乙腈溶液。進樣量2 μL,上樣流速500 nL/min,分離流速300 nL/min。梯度洗脫條件:0~105 min,95%~70% A、5%~30% B;105~110 min,70%~10% A、30%~90% B;110~112 min,10% A、90% B;112~113 min,10%~95% A、90%~5% B;95% A、5% B保持7 min。

    1.3.5.2 MS條件

    離子源噴霧電壓2.2 k V,加熱毛細管溫度320 ℃,在MS和MS/MS間切換采集。全掃描MS:掃描范圍/400~1600,掃描分辨率120000(/200處),離子最大引入時間50 ms,自動增益控制(automatic gain control,AGC)設定為1.0×10。MS/MS:掃描分辨率15 000,掃描范圍/110~2 000,最低離子強度50 000,離子最大引入時間100 ms,AGC設定為1.0×10,母離子選擇設定為1.6 Da。

    1.3.6 Proteome Discoverer軟件搜庫定性分析

    通過Proteome Discoverer(version 2.4.0.305)軟件應用Sequest HT搜索引擎對質(zhì)譜原始文件(raw文件)進行搜索。檢索參數(shù):無固定修飾,可變修飾為甲硫氨酸氧化、蛋白N端乙?;灰患壻|(zhì)譜精度1.0×10,二級質(zhì)譜精度0.02 Da;Uniprot數(shù)據(jù)庫Equus asinus(Mnemonic:EQUAS)種屬;肽段及蛋白假陽性率≤1%;肽段最少包含6 個氨基酸。

    1.3.7 阿膠源活性肽的活性篩選

    通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲得降血壓靶標血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme,ACE),抗老年癡呆靶標AChE、丁酰膽堿酯酶(butyrylcholinesterase,BChE)、-淀粉樣前體蛋白裂解酶1(-site amyloid precursor protein cleavage enzyme 1,BACE1)和抗腫瘤靶標氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)的X射線晶體結(jié)構(gòu)。通過Discovery Studio(DS)2017 R2(Dassault Systemes Biovia,San Diego,CA,USA)軟件對受體靶標去除水分子、添加氫原子后,在“Receptor-Ligand Interactions”模塊中定義其活性中心,活性中心(,,)及對接半徑()信息見表1。通過DS軟件的“Macromolecules”模塊繪制肽的結(jié)構(gòu),利用“Minimize Ligands”和“Prepare Ligands”工具在CHARMm力場下對肽的結(jié)構(gòu)進行能量優(yōu)化。通過“Receptor-Ligand Interactions”模塊的“CDOCKER”工具對受體和肽進行分子對接,根據(jù)-CDOCKER_Energy值分別篩選潛在降血壓、抗老年癡呆和抗腫瘤效果較好的活性肽。

    表1 受體靶標的活性中心及對接半徑Table 1 Active centers and docking radia of receptor targets

    2 結(jié)果與分析

    2.1 阿膠模擬胃腸道消化產(chǎn)物中活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定

    對阿膠模擬胃腸道消化產(chǎn)物中的活性肽進行質(zhì)譜分析和搜庫定性分析。結(jié)果顯示,全部譜圖數(shù)為65 813 個,數(shù)據(jù)庫中能匹配到的譜圖數(shù)有2 015 個,共鑒定到519 種阿膠活性肽。MS分析結(jié)果顯示,檢測到的肽段氨基酸數(shù)目在6~33 個之間,分子質(zhì)量分布在661.4~2 851.4 Da之間,共來源于8 種蛋白,大部分肽段是驢源膠原蛋白和血紅蛋白的酶解產(chǎn)物。其中有248 種肽來自驢源I型膠原蛋白-1鏈(138.9 kDa),有198 種肽來自驢源I型膠原蛋白-2鏈(128.6 kDa),有43 種肽來自驢源血紅蛋白亞基(15.2 kDa),有23 種肽來自驢源血紅蛋白鏈(16 kDa),有3 種肽來自驢源巨噬細胞移動抑制因子(12.4 kDa),有1 種肽來自驢源細胞色素C氧化酶亞基II(26 kDa),有1 種肽來自驢源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(片段)(8.8 kDa),還有2 種肽來自驢源白蛋白(68.5 kDa)。肽匹配圖譜(peptidespectrum matches,PSMs)值越大表示肽段在阿膠中的相對含量越高,PSMs≥21的肽段共有13 個,其氨基酸序列、PSMs、分子質(zhì)量及其所屬蛋白的檢測信息見表2??梢娤鄬孔罡叩碾亩问荌SVPGPMGPSGPR(甲硫氨酸氧化修飾),其次為SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR和ISVPGPMGPSGPR,這3 種肽段是阿膠多肽中的主要肽段,其二級譜圖見圖1。

    表2 消化后的阿膠活性肽的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 2 Mass spectrometric identification of active peptides from digested Ejiao

    圖1 ISVPGPMGPSGPR(甲硫氨酸氧化修飾)(a)、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR(b)和ISVPGPMGPSGPR(c)的二級譜圖Fig.1 Secondary mass spectra of ISVPGPMGPSGPR(1×Oxidation[M7]) (a),SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR (b),and ISVPGPMGPSGPR (c)

    SGQPGTVGPAGVR是馬科動物(馬、驢及其雜種)皮相比于牛皮和豬皮所特有的標記肽,在本研究中被鑒定出來;GASGPAGVR是馬和雜種相比于驢的皮中所特有的標記肽,在本研究中沒有被鑒定出來,與先前的研究一致。阿膠消化后的活性肽中含有蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)和色氨酸(Trp)8 種人體必需氨基酸,與前人的研究一致。多肽的疏水性有助于增強其抗氧化特性,多肽中疏水性氨基酸含量越高,其抗氧化作用越強。在519 種阿膠活性肽中,有515 種肽含有Phe、Val、Leu、Ile、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、Trp和Met中的一種或幾種,這些疏水性氨基酸有可能增強阿膠的抗氧化能力。

    2.2 阿膠源活性肽的ACE抑制活性的篩選

    在55 個六肽、七肽和八肽中,有42 個阿膠活性肽可與降血壓靶標ACE發(fā)生不同程度的結(jié)合,具有潛在的ACE抑制活性。對接結(jié)果中的-CDOCKER_Energy值代表受體與配體之間的結(jié)合親和力,該值越高則表示受體與配體的結(jié)合親和力越高,即結(jié)合得越容易、越緊密。與ACE結(jié)合的-CDOCKER_Energy值最高的3 個肽依次為KGETGLR(193.40 kcal/mol)、TGEQGDR(176.23 kcal/mol)和VQLSGEEK(172.73 kcal/mol),可以作為ACE抑制劑的候選物,其中KGETGLR是最具潛力的降壓肽,其與ACE的相互作用見圖2。ACE主要有3 個活性口袋:S1(Ala354、Glu384和Tyr523)、S2(Gln281、His353、His513、Lys511和Tyr520)和S1’(Glu162)。KGETGLR、TGEQGDR和VQLSGEEK均通過吸引電荷和氫鍵相互作用與ACE殘基Glu376和Asp377結(jié)合并形成鹽橋,通過氫鍵相互作用與ACE殘基His353、Glu384、Gln281和Ala356結(jié)合。因此,殘基His353、Glu384和Gln281是促使阿膠肽與受體ACE緊密結(jié)合的關鍵氨基酸,氫鍵相互作用和靜電相互作用(鹽橋、吸引電荷相互作用)在阿膠肽與ACE的結(jié)合中起著關鍵作用,與文獻報道的研究結(jié)論相似。

    圖2 KGETGLR-ACE相互作用2D圖(a)和3D圖(b)Fig.2 Two-dimensional (a) and 3D diagram (b) of the interaction between KGETGLR and ACE

    2.3 阿膠源活性肽的抗老年癡呆活性的篩選

    在5 5 個六肽、七肽和八肽與抗老年癡呆靶標AChE、BChE和BACE1的分子對接結(jié)果中,有23 個肽與受體AChE對接成功,有41 個肽與受體BACE1對接成功,其中22 個均可與AChE和BACE1發(fā)生不同程度結(jié)合的阿膠活性肽具有抗老年癡呆活性的可能性更大。在這22 個多肽中,SGLDGAKG、NGLTGAK和GNIGPAGK是與AChE和BACE1 結(jié)合的-CDOCKER_Energy 值綜合 最高的3 個肽,其與A ChE 結(jié)合的-CDOCKER_Energy值分別是143.17、126.23 kcal/mol和124.79 kcal/mol,與BACE1結(jié)合的-CDOCKER_Energy 值分別是134.24、129.11kcal/mol和111.38 kcal/mol,可以作為抗老年癡呆藥物的候選物。其中SGLDGAKG是最具潛力的抗老年癡呆肽,其與AChE和BACE1的相互作用分別見圖3、4。

    圖3 SGLDGAKG-AChE相互作用2D圖(a)和3D圖(b)Fig.3 Two-dimensional (a) and 3D diagram (b) of the interaction between SGLDGAKG and AchE

    AChE的活性中心包括外圍陰離子位點(Tyr70、Asp72、Tyr121、Trp279、Tyr334)和催化位點(Trp84、Gly118、Gly119、Ala201、Tyr130、His440、Ser200、Glu327、Tyr330、Phe331),其中芳香族殘基Trp279和Trp84發(fā)揮關鍵作用。SGLDGAKG、NGLTGAK和GNIGPAGK均通過吸引電荷和氫鍵相互作用與AChE殘基Glu199結(jié)合并形成鹽橋,通過氫鍵相互作用與AChE殘基Tyr121結(jié)合;另外,SGLDGAKG通過π-烷基與A ChE 殘基Trp 279 結(jié) 合,NGLTGAK 和GNIGPAGK均通過π-陽離子與AChE殘基Trp84結(jié)合。因此,Tyr121、Trp279和Trp84是促使阿膠肽與受體AChE緊密結(jié)合的關鍵氨基酸,氫鍵相互作用和靜電相互作用(鹽橋、吸引電荷相互作用、π-陽離子)在阿膠肽與AChE的結(jié)合中起著關鍵作用,與文獻報道的研究結(jié)論相似。

    已有研究表明,Asp32和Asp228是BACE1的活性催化中心。SGLDGAKG、NGLTGAK和GNIGPAGK均通過吸引電荷相互作用與BACE1殘基Lys321結(jié)合并形成鹽橋,通過吸引電荷和氫鍵相互作用與BACE1殘基Asp228結(jié)合并形成鹽橋,通過氫鍵相互作用與BACE1殘基Thr231和Gly230結(jié)合。另外,殘基Asp32可通過氫鍵相互作用與SGLDGAKG結(jié)合,通過吸引電荷和氫鍵相互作用與NGLTGAK結(jié)合并形成鹽橋,但并未與GNIGPAGK產(chǎn)生相互作用,這可能是GNIGPAGK與BACE1結(jié)合的-CDOCKER_Energy值比SGLDGAKG和NGLTGAK小的原因。因此,殘基Lys321、Asp228、Thr231、Gly230和Asp32可能在阿膠肽與受體BACE1的緊密結(jié)合中起著重要作用,同樣氫鍵相互作用和靜電相互作用(鹽橋、吸引電荷相互作用)是阿膠肽與BACE1結(jié)合的主要作用力,與文獻報道的結(jié)論相似。

    圖4 SGLDGAKG-BACE1相互作用2D圖(a)和3D圖(b)Fig.4 Two-dimensional (a) and 3D diagram (b) of the interaction between SGLDGAKG and BACE1

    2.4 阿膠源活性肽的抗腫瘤活性的篩選

    在55 個六肽、七肽和八肽中,有10 個阿膠活性肽可與抗腫瘤靶標APN發(fā)生不同程度的結(jié)合,分別是ANGLTGAK(146.52 kcal/mol)、TGEQGDR(144.63 kcal/mol)、NGLTGAK(132.21 kcal/mol)、ADGVAGPK(123.17 kcal/mol)、MGLMGPR(107.10 kcal/mol)、PAGPTGAR(103.43 kcal/mol)、ASGPAGPR(99.50kcal/mol)、PQGVQGGK(89.95 kcal/mol)、PAGPAGPR(78.39 kcal/mol)和ASGPMGPR(75.25 kcal/mol),具有潛在的抗腫瘤活性,可以作為抗腫瘤藥物的候選物。

    APN的活性位點由3 個口袋組成:S1(Glu355、His388)、S1’(Glu411、His392、Tyr477)和S2’。雖然ANGLTGAK、TGEQGDR和NGLTGAK與APN結(jié)合的-CDOCKER_Energy值最高,但是ANGLTGAK與殘基Arg381和His388發(fā)生不利的供體-供體沖突,TGEQGDR與殘基Glu411發(fā)生不利的受體-受體沖突,NGLTGAK僅與APN活性口袋中的殘基Glu355和Glu411產(chǎn)生吸引電荷相互作用和形成鹽橋。而ADGVAGPK不僅可與APN活性口袋中的殘基Glu355和Glu411產(chǎn)生吸引電荷相互作用和形成鹽橋,與APN活性口袋中的殘基His388和Tyr477產(chǎn)生π-烷基相互作用,另外還可與APN殘基Glu389產(chǎn)生吸引電荷相互作用并形成鹽橋,與APN殘基Arg381、Ala351、Gly352、Gln213、Ala353、Met354、Asn350、Asn900、Ser895和Ser897產(chǎn)生氫鍵相互作用(圖5)。因此,ADGVAGPK是阿膠模擬胃腸道消化產(chǎn)物中最具潛力的抗腫瘤肽,殘基Glu355、Glu411、His388和Tyr477是促使阿膠肽與受體APN緊密結(jié)合的關鍵氨基酸,同樣氫鍵相互作用、靜電相互作用(鹽橋、吸引電荷相互作用)和疏水相互作用(π-烷基)在阿膠肽與APN的結(jié)合中起著關鍵作用,與文獻報道的研究結(jié)論相似。

    圖5 ADGVAGPK-APN相互作用2D圖(a)和3D圖(b)Fig.5 Two-dimensional (a) and 3D diagram (b) of the interaction between ADGVAGPK and APN

    3 結(jié)論

    本研究利用LC-MS/MS技術從阿膠模擬胃腸道消化產(chǎn)物中分離鑒定出519 種活性肽,其分子質(zhì)量均分布在661.4~2 851.4 Da之間,富含人體必需氨基酸和疏水性氨基酸,大多來源于驢源膠原蛋白和血紅蛋白,其中相對含量最高的肽段是ISVPGPMGPSGPR。利用分子對接技術對阿膠模擬消化產(chǎn)物中的六肽、七肽和八肽進行活性篩選,篩選出了最具潛力的降壓肽KGETGLR、抗老年癡呆肽SGLDGAKG和抗腫瘤肽ADGVAGPK。氫鍵相互作用和靜電相互作用(鹽橋、吸引電荷相互作用)在阿膠多肽的降血壓、抗老年癡呆和抗腫瘤活性中都起著至關重要的作用。本研究為開發(fā)阿膠肽粉、阿膠肽膏、阿膠多肽含片、阿膠多肽膠囊、阿膠多肽沖劑、阿膠多肽口服液等一系列具有降血壓、抗老年癡呆和抗腫瘤功效的阿膠活性肽保健品提供了理論依據(jù)。

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