降解核苷作用乳酸菌的篩選及其潛在降尿酸功能

王家彬，潘 力

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

腸道微生物主要指定植于腸道內(nèi)的微生物菌群，其數(shù)量與人類(lèi)細(xì)胞的數(shù)量相似。利用人類(lèi)糞便樣品的微生物測(cè)序和動(dòng)物模型中的腸道微生物移植，腸道微生物群與人類(lèi)健康和疾病的關(guān)系開(kāi)始被眾人所知。乳酸菌是一類(lèi)可將糖類(lèi)發(fā)酵轉(zhuǎn)化成乳酸的革蘭氏陽(yáng)性菌，作為人體腸道內(nèi)的正常菌群一員，可以很容易地作為天然功能性食品納入基本飲食，因此也被越來(lái)越多地用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，而且它們已被證明能夠有效地改善胃腸健康和某些代謝綜合征，包括糖尿病和精神類(lèi)疾病等。

高尿酸血癥是臨床上最常見(jiàn)也是危害最大的慢性疾病之一，其典型特征是尿酸形成增加或尿酸排泄減少。血液中尿酸含量的升高會(huì)增加患痛風(fēng)和心血管疾病、糖尿病、肥胖和慢性腎臟病的風(fēng)險(xiǎn)。此外，高尿酸血癥也可能影響腸道微生物體內(nèi)平衡和腸道上皮完整性。治療高尿酸血癥的關(guān)鍵是降低尿酸濃度?，F(xiàn)行治療手段除以藥物治療之外，一般都要輔以嚴(yán)格的飲食控制，盡可能減少外源性嘌呤類(lèi)物質(zhì)攝入。在臨床常用的治療高尿酸血癥藥物主要包括別嘌呤醇（黃嘌呤氧化酶抑制劑）和苯溴馬?。ㄒ种颇I尿酸鹽的重吸收）。由于本病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，并且服藥的同時(shí)還需嚴(yán)格控制飲食，患者治療依從性不髙。因此，如何利用乳酸菌參與高尿酸血癥的預(yù)防和治療成為當(dāng)前的熱點(diǎn)之一。已有研究表明，某些乳酸菌可以通過(guò)降解或者吸收核苷競(jìng)爭(zhēng)性減少腸道上皮對(duì)核苷的吸收，從而減少尿酸的生成。金方等研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌ZM15能夠在體外降解核苷酸與核苷，同時(shí)在體內(nèi)可能通過(guò)與腸道上皮細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)吸收相應(yīng)核苷酸與核苷，使模型大鼠的血尿酸水平顯著降低。由于尿酸在產(chǎn)生過(guò)程中，其前體物質(zhì)依次為黃嘌呤、次黃嘌呤、肌苷/鳥(niǎo)苷、核苷酸等，其含量均與最終血液中的尿酸含量有關(guān)。有研究表明，乳酸菌無(wú)法降解尿酸和嘌呤類(lèi)物質(zhì)（黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和次黃嘌呤），而核苷攝取是嘌呤和嘧啶進(jìn)入腸上皮細(xì)胞的主要途徑，因而提前降解核苷便是乳酸菌調(diào)節(jié)血尿酸的主要作用方式。目前有一些研究人員通過(guò)這種原理篩選降尿酸的菌株，本研究選用相同的原理篩選潛在降尿酸的菌株。有研究表明乳桿菌DM9218可以治療高果糖誘導(dǎo)的腸道失調(diào)的小鼠，檢測(cè)到DM9218能夠降低果糖喂養(yǎng)小鼠的血清尿酸水平和黃嘌呤氧化酶活性，起到了治療作用。然而，目前關(guān)于乳酸菌調(diào)節(jié)尿酸的研究還相對(duì)較少，乳酸菌在高尿酸血癥中的應(yīng)用前景還沒(méi)有得到廣泛探索。因此，尋找高效的天然降尿酸乳酸菌，豐富國(guó)內(nèi)降尿酸乳酸菌的菌種庫(kù)，成為當(dāng)前重要的任務(wù)。

本研究首先以國(guó)內(nèi)外的特色食源性物質(zhì)為來(lái)源，通過(guò)傳統(tǒng)分離方法和分子生物學(xué)鑒定方法（16S rDNA序列分析法）相結(jié)合，分離篩選乳酸菌株。之后采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法體外評(píng)價(jià)收集得到的乳酸菌株對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷的降解作用，從而篩選具有潛在降尿酸能力的菌株。然后，通過(guò)在體外建立黃嘌呤氧化酶篩選模型評(píng)價(jià)菌株的黃嘌呤氧化酶抑制能力，最終篩選到1 株同時(shí)具有高效核苷降解和黃嘌呤氧化酶抑制能力的菌株。本實(shí)驗(yàn)旨在豐富我國(guó)在降血尿酸乳酸菌的菌種庫(kù)，為乳酸菌制劑及其功能性產(chǎn)品的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為開(kāi)發(fā)預(yù)防和治療高尿酸血癥藥物提供理論基礎(chǔ)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品為采集自國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)的特色食源性物質(zhì)，包括菌種類(lèi)產(chǎn)品（喜他康、SWASON）、自制泡菜、貴州白酸湯和國(guó)內(nèi)酸奶（簡(jiǎn)愛(ài)、香滿(mǎn)樓）。

1.1.2 試劑

革蘭氏染色試劑 廣州環(huán)凱生物科技有限公司；DreamGreen PCR Master Mix 諾唯贊生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 上海捷瑞生物工程有限公司；引物由天一輝遠(yuǎn)（廣州）基因科技有限公司合成；肌苷、鳥(niǎo)苷、別嘌呤醇、別嘌呤醇、NaClO、HPO、KPO、HClO（HPLC級(jí)） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基與溶液

MRS（Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、吐溫80 1.08 g/L、MnSO·4HO 0.05 g/L、MgSO·7HO 0.2 g/L、無(wú)水乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、酪蛋白10 g/L、牛肉提取物10 g/L、酵母提取物4 g/L、KHPO2 g/L（pH 5.7±0.2）。固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂。所有材料在使用前121 ℃滅菌20 min。

HPLC流動(dòng)相：稱(chēng)取0.122 5 g NaClO，加入1 000 mL容量瓶中并以超純水定容，振蕩混勻。吸取100 μL高氯酸鈉溶液，加入預(yù)先盛有200 mL超純水的HPLC流動(dòng)相儲(chǔ)存瓶中，另取10 mL HPO（色譜級(jí)），緩緩加入HPLC流動(dòng)相儲(chǔ)存瓶中，充分振蕩，補(bǔ)足至1 000 mL，在搖床內(nèi)以180 r/min振蕩混勻10 min。最終流動(dòng)相組成為0.1 μmol/L NaClO-0.187 mol/L HPO-dd HO。

黃嘌呤氧化酶液的制備：將黃嘌呤氧化酶（100 U）用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.5）溶解為0.5 U/mL，置于4 ℃保存。

黃嘌呤底物的制備：底物黃嘌呤先用少量0.1 mol/L NaOH溶液超聲溶解，再用0.2 mol/L PBS（pH 7.5）定容成2 mmol/L黃嘌呤底物溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；光學(xué)顯微鏡 德國(guó)ZEISS公司；移液槍、高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；浸入式水平電泳系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；NanoDrop 1000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；M200多功能酶標(biāo)儀 德國(guó)Tecan公司；1220 Infinity HPLC裝置 美國(guó)Agilent公司；Athena C-WP色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 德國(guó)CNW公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌株的分離純化

1.3.1.1 乳酸菌株的初篩

取出之前保存在4 ℃冰箱中的樣品，在超凈臺(tái)中加入0.1 g菌粉類(lèi)樣品到含有1 mL無(wú)菌生理鹽水的EP管中，使其完全溶解，其他含有溶液的樣品（如泡菜）則直接用移液器吸取1 mL樣品于干凈的EP管中，用0.85%生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0～10），每個(gè)梯度做3 次平行實(shí)驗(yàn)。待不同濃度梯度的稀釋液中樣品完全溶解均勻后，按稀釋濃度從低到高的順序各取300 μL稀釋液分別接入MRS固體培養(yǎng)基中，并用無(wú)菌涂布器均勻涂開(kāi)。待其吸收后放置到37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，時(shí)間為2 d。取培養(yǎng)后平板上的單一菌落進(jìn)行劃線(xiàn)分離，一般重復(fù)此分離純化步驟2～3 次，即可獲得形態(tài)一致的純化單一菌落。

1.3.1.2 乳酸菌株的復(fù)篩

挑取上一步具有典型乳酸菌細(xì)胞形態(tài)的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)，并在光學(xué)顯微鏡的油鏡下觀察其顏色變化及形態(tài)特征，進(jìn)一步判斷是否為乳酸菌株（乳酸菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌株）。

1.3.2 乳酸菌株的鑒定

1.3.2.1 細(xì)菌基因組DNA提取

將保藏菌株分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在厭氧環(huán)境中37 ℃培養(yǎng)18 h得到菌液。對(duì)其中的細(xì)菌按試劑盒法進(jìn)行DNA的提取。之后每個(gè)樣品取2 μL用超微量分光光度計(jì)NanoDrop1000測(cè)定濃度，測(cè)定后將DNA保存在4 ℃，以備后用。

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增及16S rDNA測(cè)序

PCR擴(kuò)增模板及引物依次為實(shí)驗(yàn)獲得乳酸菌基因組DNA及通用引物模板，如表1所示。

表1 引物序列Table 1 List of primers used in this study

配制總體積為50 μL的PCR擴(kuò)增體系。分別加入25 μL DreamGreen Mix、各0.5μL的引物27F和1492R、2 μL的DNA模板和22 μL ddHO。每個(gè)片段按上述體系擴(kuò)增兩管。PCR結(jié)束之后，將最終得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至天一輝遠(yuǎn)（廣州）基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)測(cè)定16S rDNA的序列進(jìn)行菌種鑒定。測(cè)序完成后將獲得的序列結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，從而確定菌株種屬。

1.3.3 乳酸菌株對(duì)核苷體外同化能力的評(píng)價(jià)

1.3.3.1 核苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

采用HPLC系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)肌苷和鳥(niǎo)苷。將33.7 mg肌苷和35.7 mg鳥(niǎo)苷溶解在100 mL 100 mmol/L KPO溶液（以HPO調(diào)至pH 7.0）中制成肌苷-鳥(niǎo)苷溶液。0.22 μm水系濾膜過(guò)濾后，將5、8、11、14、17 μL和20 μL肌苷-鳥(niǎo)苷溶液分別注入配有紫外波長(zhǎng)檢測(cè)器和色譜柱的HPLC裝置。流速1 mL/min，設(shè)定時(shí)間40 min。在254 nm波長(zhǎng)處測(cè)定肌苷和鳥(niǎo)苷的含量，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)插值法進(jìn)行定量。

1.3.3.2 乳酸菌株對(duì)核苷降解能力的測(cè)定

為了評(píng)價(jià)乳酸菌株對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷的降解能力，將保藏菌株按照3%的量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧條件下活化2 代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。之后取乳酸菌培養(yǎng)液2 mL，4 ℃、6 000 r/min離心10 min。然后用1 mL 0.85% NaCl溶液洗滌2 次，調(diào)整菌懸液濃度為1×10CFU/mL。再用750 μL肌苷-鳥(niǎo)苷溶液懸浮，37 ℃、120 r/min孵育60 min。之后將溶液4 000×、4 ℃離心10 min。取上清液270 μL。在上清液中加入30 μL 0.1 mol/L HClO溶液，充分混合以防止進(jìn)一步降解。過(guò)濾后將20 μL的混合物注入HPLC裝置，設(shè)定時(shí)間40 min。按上述得到的核苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算剩余肌苷和鳥(niǎo)苷含量。根據(jù)下式計(jì)算不同菌株對(duì)肌苷或鳥(niǎo)苷的降解速率和降解率：

式中：為降解速率/（g/（L·min））；為肌苷或鳥(niǎo)苷殘留量/（g/L）；為肌苷或鳥(niǎo)苷質(zhì)量濃度/（g/L）；為核苷降解率/%。

1.3.4 胞內(nèi)物和胞外物對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷的降解作用

為了闡明核苷被降解的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)菌株的胞外分泌物和胞內(nèi)物進(jìn)行了提取，并通過(guò)上述方法測(cè)定它們對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷的降解情況。將乳酸菌株以3%的接種量到MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧條件下進(jìn)行2 次傳代培養(yǎng)，取2 mL培養(yǎng)液4 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀。1 mL生理鹽水洗滌菌體3 次，收集實(shí)驗(yàn)菌體并調(diào)整菌體濃度為1×10CFU/mL。懸浮于1 mL肌苷-鳥(niǎo)苷緩沖液，37 ℃放置8 h后4 ℃、6 000 r/min離心10 min，取450 μL上清液（胞外分泌物）與450 μL肌苷-鳥(niǎo)苷緩沖液，37 ℃培養(yǎng)60 min后加入100 μL終止劑高氯酸，取20 μL混合液經(jīng)過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾用于HPLC分析。菌體沉淀重懸于1 mL生理鹽水，超聲波破碎（200 W，工作時(shí)間5 s，停頓5 s）5 min后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取450 μL上清液（胞內(nèi)物）與450 μL肌苷-鳥(niǎo)苷緩沖液混合，37 ℃培養(yǎng)60 min后加入100 μL終止劑高氯酸，0.22 μm濾膜過(guò)濾后，取20 μL混合液用于HPLC分析。

1.3.5 高效降解核苷菌株對(duì)黃嘌呤氧化酶體外抑制能力的評(píng)價(jià)

對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制能力評(píng)價(jià)方法參考Umamahesari等方法并稍作改動(dòng)。取0.75 mL黃嘌呤底物溶液，0.75 mL提取液混勻，最后加入0.5 mL預(yù)先在25 ℃保溫20 min的黃嘌呤氧化酶液（0.5 U/mL）啟動(dòng)反應(yīng)，在波長(zhǎng)295 nm的紫外條件下記錄反應(yīng)時(shí)間內(nèi)（0～42 min，每隔6 min記錄一次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)）的吸光度變化。對(duì)照樣中把黃嘌呤氧化酶液用PBS替換。黃嘌呤氧化酶的活性用黃嘌呤氧化酶的抑制率表達(dá)。由于黃嘌呤在295 nm波長(zhǎng)處有吸光度，所以需扣除不加樣品和酶的吸光度。每個(gè)樣品做3 次平行實(shí)驗(yàn)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為295 nm的反應(yīng)液。以別嘌呤醇為陽(yáng)性對(duì)照，黃嘌呤氧化酶抑制率按式（3）計(jì)算：

式中：為含有黃嘌呤氧化酶不含樣品的吸光度；為不含黃嘌呤氧化酶和樣品的吸光度；為含有黃嘌呤氧化酶和樣品的吸光度；為含有樣品但不含黃嘌呤氧化酶的吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌株的分離篩選

用無(wú)菌的生理鹽水溶液對(duì)不同的特色食源性物質(zhì)進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度做3 次平行實(shí)驗(yàn)，隨后取稀釋樣品300 μL在MRS固體培養(yǎng)基上涂板后進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)多次分離純化后，最終篩選得到22 株疑似乳酸菌株，其在MRS平板上的菌落形態(tài)如圖1所示。大多數(shù)菌株中間凸起呈半透明，表面上是光滑的點(diǎn)狀菌落，邊緣規(guī)則且無(wú)褶皺；另外少部分菌落表面相對(duì)暗淡粗糙，中間斑點(diǎn)呈乳黃色，邊緣不規(guī)則。

圖1 乳酸菌菌落形態(tài)鑒定Fig.1 Colony morphology of lactic acid bacterial strains

進(jìn)一步的鏡檢結(jié)果如圖2所示，收集得到的22 株菌在革蘭氏染色試劑的作用下均呈紫藍(lán)色，表明為革蘭氏陽(yáng)性菌。鏡檢視野內(nèi)菌落形態(tài)均一，在細(xì)胞形態(tài)上分別呈現(xiàn)為桿狀（有長(zhǎng)有短）、圓狀（橢圓狀），排列形態(tài)為單個(gè)排列或呈鏈條狀排列。結(jié)合菌落平板形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，初步判斷為乳酸菌。

圖2 菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.2 Gram staining microscopic examination of strains

2.2 乳酸菌株的鑒定

以細(xì)菌基因組總DNA為模板，對(duì)收集到的22 株乳酸菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終獲得1 500 bp左右的PCR產(chǎn)物，送至天一輝遠(yuǎn)（廣州）基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將得到的各菌株16S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，以確定菌株類(lèi)型和種屬關(guān)系，進(jìn)而對(duì)菌種間、菌屬間的差異性予以判斷，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌分類(lèi)。BLAST的比對(duì)結(jié)果如表2所示。

表2 乳酸菌鑒定結(jié)果比對(duì)Table 2 Comparison of results of lactic acid bacterial identification

至此，本實(shí)驗(yàn)中分離得到的22 株乳酸菌株可分類(lèi)為：8 株鼠李糖乳桿菌（）、2 株干酪乳桿菌（）、2 株瑞士乳桿菌（）、2 株植物乳桿菌（）、1 株嗜酸乳桿菌（）、1 株嗜熱鏈球菌（）、1 株活動(dòng)乳桿菌（）、1 株布氏乳桿菌（）、1 株短乳桿菌（）、1 株戊糖乳桿菌（）、1 株戊糖乳球菌（）、1 株解淀粉乳酸桿菌（）。

2.3 酸菌株對(duì)核苷體外同化能力的評(píng)價(jià)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，肌苷在本色譜條件下保留時(shí)間為24.379 min，鳥(niǎo)苷保留時(shí)間為35.105 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別為=45 571＋14.802（=1）、=47 022－122.09（=0.999 8）。其中為峰面積，為質(zhì)量濃度（g/L）。

乳酸菌對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷的體外同化能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3、4所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 株供試乳酸菌均具有一定的核苷分解能力。但大部分供試菌株對(duì)肌苷與鳥(niǎo)苷降解速率均小于2×10g/（L·min）。效果最好的菌株為L(zhǎng)B1lac20，對(duì)肌苷的降解速率為0.004 6 g/（L·min），降解率為91.19%；對(duì)鳥(niǎo)苷的降解速率為0.004 8 g/（L·min），降解率為89.67%。與本實(shí)驗(yàn)其他菌株相比，對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷的降解能力顯著。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，菌株對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷同化能力之間存在很強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，可能是由于鳥(niǎo)苷和肌苷屬于同一類(lèi)物質(zhì)，可由同一酶催化降解。這表明在所測(cè)試的菌株中可能存在核苷水解酶。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Tsuboi等的研究結(jié)論基本一致。在具體菌株對(duì)核苷的分解速率上，本實(shí)驗(yàn)篩選出的優(yōu)選菌株LB1lac20遠(yuǎn)超楊殿斌等篩選出的其他菌株，僅次于植物乳桿菌DM9218?？紤]到反應(yīng)條件及菌種類(lèi)型的不同，本研究篩選得到的LB1lac20依舊具有很高的研究?jī)r(jià)值。與麻菊美等的研究結(jié)果相比，LB1lac20對(duì)肌苷的降解率高于其篩選出的最高效菌株5-1，但鳥(niǎo)苷的降解率低于此菌株（89.37%）。

表3 不同乳酸菌對(duì)肌苷的體外降解情況Table 3 In vitro degradation rates of inosine by different lactic acid bacteria

表4 不同乳酸菌對(duì)鳥(niǎo)苷的體外降解情況Table 4 In vitro degradation rates of guanosine by different lactic acid bacteria

此外，作為泡菜來(lái)源的LB1lac20，具有價(jià)格低廉、無(wú)藥物毒副作用等優(yōu)勢(shì)，雖然效果不及合成藥物，但是具有安全性和高效性并存的特點(diǎn)，并且可以作為日常飲食參與，患者依從度高。而泡菜是蔬菜利用乳酸菌發(fā)酵而成的低鹽發(fā)酵食品，因其獨(dú)特的生化特點(diǎn)、營(yíng)養(yǎng)和感官特性也被大眾廣泛接受。而已有研究表明，泡菜具有抗氧化，抑菌，抗動(dòng)脈粥樣硬化等功效，開(kāi)發(fā)具有益生功能的乳酸菌制劑也是當(dāng)前泡菜中乳酸菌的一大研究趨勢(shì)。綜合考慮菌株對(duì)肌苷及鳥(niǎo)苷的分解率及其天然優(yōu)勢(shì)，選擇分解兩種核苷速率均為最佳的菌株LB1lac20作為候選菌株進(jìn)行下一階段實(shí)驗(yàn)。

2.4 胞內(nèi)物和胞外物對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷的降解作用

對(duì)比不加LB1lac20的對(duì)照組（圖3A），本實(shí)驗(yàn)菌株LB1lac20胞外物（圖3C）不能起到降解作用，而胞內(nèi)物（圖3D）在60 min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)對(duì)核苷有明顯的降解作用，對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷的降解率分別可以達(dá)到55.87%和32.26%。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)菌株LB1lac20的胞外產(chǎn)物不能降解肌苷和鳥(niǎo)苷，甚至一些生命活動(dòng)不需要的肌苷和鳥(niǎo)苷會(huì)被排出胞外，造成肌苷和鳥(niǎo)苷的含量增加。而胞內(nèi)提取物可以起到降解肌苷和鳥(niǎo)苷的作用，但效果會(huì)低于同等時(shí)間內(nèi)菌懸液（圖3B）的降解率。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果明確顯示乳酸菌對(duì)核苷酸與核苷的降解作用是胞內(nèi)完成，這也與金方等得出的結(jié)論一致。此外，之前有研究表明，DM9505可以通過(guò)其編碼的肌苷水解酶，降解果糖代謝中間產(chǎn)物肌苷和間接對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)等多種機(jī)制共同作用減少尿酸的生成，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)可能是胞內(nèi)的核苷水解酶系在發(fā)揮作用。核苷水解酶破壞核苷的糖苷鍵，釋放含氮堿和戊糖。核苷攝取是嘌呤和嘧啶進(jìn)入腸上皮細(xì)胞的主要途徑，某些乳酸菌可以通過(guò)降解或者吸收核苷競(jìng)爭(zhēng)性減少腸道上皮對(duì)核苷的吸收，從而減少尿酸的生成。這些核苷酶廣泛存在于植物和微生物中，但尚未在哺乳動(dòng)物中檢測(cè)到。

圖3 LB1lac20對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷的降解Fig.3 Chromatograms showing LB1lac20 degradation of inosine and guanosine

2.5 高效降解核苷菌株對(duì)黃嘌呤氧化酶體外抑制能力的評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)LB1lac20作為黃嘌呤氧化酶抑制劑的能力，利用尿酸生成法建立體外篩選模型。在反應(yīng)體系中，黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤底物生成尿酸和超氧陰離子，而尿酸在295 nm紫外條件下有特征吸收峰，利用紫外分光光度法通過(guò)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)吸光度的變化，即尿酸生成量，衡量黃嘌呤氧化酶的活性變化。同時(shí)使用別嘌呤醇作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。別嘌呤醇主要通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶的活性進(jìn)而達(dá)到抑制尿酸生成的目的，它可以和黃嘌呤氧化酶的活性中心結(jié)合生成別嘌呤二醇（又稱(chēng)氧嘌呤醇），別嘌呤二醇和黃嘌呤氧化酶結(jié)合形成不具有催化作用的復(fù)合體，即達(dá)到了抑制黃嘌呤氧化酶活性的作用。LB1lac20作為黃嘌呤氧化酶抑制劑的效果如圖4所示。

圖4 黃嘌呤氧化酶體外抑制能力的評(píng)價(jià)結(jié)果Fig.4 In vitro xanthine oxidase-inhibitory capacity of LB1lac20

當(dāng)黃嘌呤氧化酶濃度為0.5 U/mL時(shí)，比較其在不同反應(yīng)時(shí)間（6～42 min）下的抑制能力。結(jié)果表明，在12 min別嘌呤醇（0.2 mg/mL）最先對(duì)黃嘌呤氧化酶起到抑制作用，對(duì)黃嘌呤氧化酶的敏感度高于LB1lac20菌懸液、胞內(nèi)物和胞外物。在18 min活菌懸液和其胞內(nèi)提取物也開(kāi)始黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生抑制作用。胞外分泌物在24 min開(kāi)始對(duì)黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生了微弱的抑制作用。在12～42 min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，別嘌呤醇、活菌懸液、胞內(nèi)提取物和胞外分泌物的抑制率均隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，之后則基本達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)。最終當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到42 min，別嘌呤醇（0.2 mg/mL）、活菌懸液、胞內(nèi)提取物和胞外分泌物最終對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率分別達(dá)66.61%、21.27%、19.60%和3.90%。結(jié)果表明此菌株的活菌懸液和胞內(nèi)提取物顯示出良好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，進(jìn)一步證實(shí)此菌株具有很大的降尿酸潛力。此外，LB1lac20菌懸液及其胞內(nèi)提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制能力較為接近，并且遠(yuǎn)高過(guò)其胞外分泌物，其黃嘌呤抑制能力可能主要來(lái)源于胞內(nèi)?？傊ㄟ^(guò)建立尿酸生成法建立體外篩選模型，LB1lac20被證明具有一定的黃嘌呤氧化酶抑制能力，未來(lái)可以作為黃嘌呤氧化酶抑制劑參入到日常飲食中，并用于高尿酸血癥的預(yù)防和治療，具有很大的應(yīng)用前景和價(jià)值。

3 結(jié)論

高尿酸血癥是目前危害人類(lèi)健康最為常見(jiàn)的代謝綜合征之一，治療關(guān)鍵為降低血尿酸濃度。降解核苷是乳酸菌降低尿酸含量的主要方式，本研究也選用相同原理篩選具有潛在降尿酸能力的菌株。此外，黃嘌呤氧化酶是嘌呤分解代謝過(guò)程中的一種關(guān)鍵性的酶，它可以催化次黃嘌呤和黃嘌呤直接生成尿酸。因此當(dāng)體內(nèi)黃嘌呤氧化酶活性異?；钴S時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致大量尿酸的生成，從而引發(fā)高尿酸血癥。因而，黃嘌呤氧化酶抑制劑也是當(dāng)前研究降尿酸藥物的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)以國(guó)內(nèi)外特色食源性物質(zhì)為來(lái)源，利用常規(guī)的菌種分離方法（梯度稀釋法、涂布培養(yǎng)法等）和現(xiàn)代的分子生物學(xué)方法（16S rDNA序列比對(duì)法）分離鑒定乳酸菌株。然后借助HPLC法分別鑒定了20 株收集得到的乳酸菌株其體外降解肌苷和鳥(niǎo)苷的能力，成功篩選出1 株具有高效體外降核苷活性的優(yōu)勢(shì)菌株LB1lac20。此菌種分離自國(guó)產(chǎn)泡菜，對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷的降解率均達(dá)到90%以上，是一株很有潛力的降尿酸乳酸菌株。因此本實(shí)驗(yàn)選擇LB1lac20作為后續(xù)研究菌株。在此基礎(chǔ)上對(duì)該菌株的胞內(nèi)物和胞外物進(jìn)行提取，并再次借助HPLC法對(duì)其胞內(nèi)物和胞外物對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷的降解能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。證實(shí)其高效的核苷降解能力主要是由于胞內(nèi)物的作用產(chǎn)生。為了進(jìn)一步分析菌株LB1lac20的潛在降尿酸作用，利用尿酸生成法對(duì)尿酸生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵酶（黃嘌呤氧化酶）進(jìn)行體外抑制能力測(cè)定，并用臨床藥物別嘌呤醇作為陽(yáng)性對(duì)照，分析菌株LB1lac20對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用效果。結(jié)果表明此菌株的菌懸液和胞內(nèi)提取物均具有良好的黃嘌呤氧化酶抑制能力。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)的LB1lac20是1 株很有潛力的降尿酸乳酸菌株，未來(lái)可參與到高尿酸血癥的預(yù)防和治療中，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。后續(xù)可以進(jìn)一步研究其在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的功效，以得到更直接準(zhǔn)確地調(diào)控尿酸能力。