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    白啤中二肽基肽酶-IV抑制肽的虛擬篩選及活性分析

    2022-06-02 08:42:40田文慧孫麗平胡淑敏莊永亮
    食品科學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:啤酒質(zhì)譜位點(diǎn)

    田文慧,孫麗平,張 翠,胡淑敏,莊永亮,,尹 花,

    (1.啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266021;2.昆明理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,云南 昆明 650500)

    二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)是一種細(xì)胞表面的絲氨酸蛋白酶,其主要作用是優(yōu)先將氨基末端第2個(gè)氨基酸為丙氨酸(Ala)或脯氨酸(Pro)的寡肽的氨基末端前2 個(gè)氨基酸殘基剪切去除。DPP-IV可分解腸道細(xì)胞分泌的胰高血糖素樣肽-1(glucagonlike peptide-1,GLP-1),而GLP-1可以通過(guò)刺激胰島素、抑制升糖素以及讓胰島素細(xì)胞重生等方式降低血糖。因此,DPP-IV抑制劑可以使DPP-IV失活,從而提高GLP-1,預(yù)防糖尿病的發(fā)生。研究表明,生物活性肽具有生理活性好、功能廣泛、安全性高等特點(diǎn),目前,尋找DPP-IV抑制活性肽逐漸成為熱點(diǎn)研究。

    常規(guī)的生物活性肽篩選方法主要是通過(guò)超濾、陰陽(yáng)離子層析、凝膠柱層析及高效液相色譜等分離手段,結(jié)合體內(nèi)外活性評(píng)價(jià)進(jìn)行肽段的確定。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì),通過(guò)在線數(shù)據(jù)及虛擬篩選手段研究肽的活性,可以減少工作強(qiáng)度、降低人工成本和縮短研發(fā)周期,同時(shí)提高活性肽的鑒定成功率。Zhao Wenzhu等通過(guò)虛擬篩選,在線預(yù)測(cè)了多肽的潛在活性、溶解性、吸收、代謝、毒性等,從雞蛋蛋白中鑒定出3 條新的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶和DPP-IV抑制肽ADF、MIR和FGR。

    目前,生物活性肽的來(lái)源比較廣泛,有乳制品、谷類、蛋、魚、肉、藻類等。在釀造酒中,活性肽的研究主要集中在紅酒、黃酒和白酒,對(duì)啤酒中肽的研究較少。啤酒是經(jīng)典的發(fā)酵食品,釀酒原料中的蛋白質(zhì)可被降解為肽并轉(zhuǎn)移至啤酒終產(chǎn)品中。同時(shí),發(fā)酵過(guò)程中微生物的胞外分泌、發(fā)酵結(jié)束后微生物細(xì)胞的自溶等也可能向啤酒終產(chǎn)品中引入肽類。白啤是經(jīng)典啤酒的一種,白啤酒中的“白”指的是酒體未經(jīng)過(guò)濾、不澄清、呈白色。因大麥芽和小麥芽比例、釀造工藝和酵母菌株不同,白啤酒具有獨(dú)特的風(fēng)格,營(yíng)養(yǎng)豐富,口感愉悅,因此,本實(shí)驗(yàn)以白啤為研究對(duì)象,采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜及軟件鑒定其肽段,對(duì)潛在生物活性肽進(jìn)行篩選,并對(duì)其進(jìn)行吸收、代謝、毒性及分子對(duì)接進(jìn)行預(yù)測(cè),定向解析出具有潛在DPP-IV抑制活性的肽段。以期為啤酒產(chǎn)業(yè)的綜合性發(fā)展提供理論支持和數(shù)據(jù)參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    青島白啤,產(chǎn)品批號(hào)0532342949,500 mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)4.1%,以下簡(jiǎn)稱白??;合成的肽段(純度98%)由南京杰肽生物科技有限公司提供;DPP-IV活性檢測(cè)試劑盒 美國(guó)開曼(密歇根州安娜堡)化學(xué)公司;乙酸乙酯(分析純) 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;乙腈、甲酸(均為質(zhì)譜級(jí)) 德國(guó)Merck公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品前處理

    白啤樣品過(guò)濾除氣,量取300 mL,在50 ℃條件下濃縮至50 mL,濃縮液用乙酸乙酯等體積萃取3 次,將萃取后的水樣用于肽段分析。

    1.3.2 肽段分析條件

    色譜條件:色譜柱:Infinitylab Poroshell 120 EC-C(2.1 mm×100 mm,1.9 μm),柱溫30 ℃;流動(dòng)相:A為乙腈(0.1 %甲酸),B為超純水(0.1 %甲酸);進(jìn)樣量2 μL;流速0.2 mL/min;梯度洗脫:0~1 min,5% A、95% B;1~2.5 min,5%~10% A、95%~90% B;2.5~12.5 min,10%~25% A、90%~75% B;12.5~20 min,25%~52.5% A、75%~47.5% B;20~22 mi n,52.5%~95% A、47.5%~5% B;22~24 min,95%~5% A、5%~95% B;24~30 min,5% A、95% B。

    質(zhì)譜條件:采用電噴霧正離子源,噴霧電壓3.2 kV,數(shù)據(jù)采集范圍/200~2 000,質(zhì)譜數(shù)據(jù)掃描模式為Full MS-dd MS,一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜的分辨率分別為35 000和17 500。

    肽段的分子質(zhì)量及氨基酸序列利用和Peaks 7.5軟件進(jìn)行解析,篩選出置信度(average local confidence,ALC)大于85%的肽段。

    1.3.3 白啤活性肽的初選

    1.3.3.1 生物活性預(yù)測(cè)

    使用Peptide Ranker程序(http://bioware.ucd.ie/-compass/biowareweb/Serverpages/Peptide-ranker.php)對(duì)已鑒定肽段進(jìn)行生物活性可能性分析,選擇生物活性評(píng)分≥0.5的肽段作為潛在的生物活性肽。應(yīng)用BIOPEP程序(http://www.uwm.edu.pl/Biochemia/biopep/start_biopep.php)中的“profiles of potential biological activity”功能進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,定義活性肽的潛在生物活性及可能存在的活性位點(diǎn)氨基酸序列。

    1.3.3.2 活性肽的性質(zhì)分析

    通過(guò)PepSMI(https://www.novoprolabs.com/tools/convert-peptide-to-smiles-string)將肽段氨基酸序列轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)化分子線性輸入規(guī)范(simplified molecular input line entry system,SMILES)格式,使用admetSAR(http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/predict/)預(yù)測(cè)肽段的吸收、代謝和毒性等性質(zhì)。本研究主要評(píng)價(jià)指標(biāo)為血腦屏障透過(guò)(blood-brain barrier penetration,BBB)、人體腸道吸收(human intestinal absorption,HIA)、細(xì)胞色素(cytochrome P450,CYP450)綜合抑制率和急性口服毒性。

    1.3.4 分子對(duì)接

    1.3.4.1 肽段結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

    選取Peptide Ranker評(píng)價(jià)≥0.5且性質(zhì)分析良好的肽段進(jìn)行分子對(duì)接。利用SYBYL-X 2.1.1軟件中Build Protein功能構(gòu)建肽段的結(jié)構(gòu),并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)置參數(shù)Max Iterations 5 000和Gradient 0.005,確保肽結(jié)構(gòu)的能量最小化。

    1.3.4.2 DPP-IV結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

    DPP-IV(PDB ID:5J3J)的晶體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載(http://www.rcsb.org/pdb)。利用SYBYL-X 2.1.1軟件中Surflex-Dock對(duì)DPP-IV進(jìn)行結(jié)構(gòu)處理,把原受-配復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中的配體分子從受體的口袋中分離,除去水分子和其他小分子,加氫、加電荷。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道,選擇DPP-IV活性位點(diǎn)的6 個(gè)氨基酸殘基Arg125、Glu205、Arg358、Tyr547、Ser630、Tyr662生成口袋。

    1.3.4.3 分子對(duì)接方法及評(píng)價(jià)

    應(yīng)用SYBYL中的Surflex-dock模塊對(duì)肽段與DPP-IV進(jìn)行柔性對(duì)接。根據(jù)分子對(duì)接的步驟設(shè)定相關(guān)參數(shù),采用了一致性打分函數(shù)Concensus Score(C-Score)評(píng)價(jià)對(duì)接結(jié)果一致性,C-Score>4.0表示對(duì)接成立;以總得分Total-Score(T-Score)、氫鍵個(gè)數(shù)和氫鍵距離為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),T-Score越高,氫鍵個(gè)數(shù)越多,鍵長(zhǎng)越短表明結(jié)合能力越強(qiáng)。基于評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)篩選出最佳結(jié)合構(gòu)象,對(duì)獲得的最佳結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行進(jìn)一步探討,分析和預(yù)測(cè)肽段與DPP-IV的相互作用情況。

    1.3.5 體外DPP-IV抑制活性驗(yàn)證

    采用試劑盒(熒光法)對(duì)DPP-IV抑制率進(jìn)行測(cè)定。樣品孔依次加入10 μL DPP-IV、10 μL樣品溶液、30 μL緩沖液,對(duì)照孔加入10 μL DPP-IV、40 μL緩沖液,空白孔加入50 μL緩沖液,最后加入50 μL底物啟動(dòng)反應(yīng)。37 ℃檢測(cè)熒光值(激發(fā)波長(zhǎng)360 nm,發(fā)射波長(zhǎng)465 nm),記錄30 min內(nèi)的結(jié)果,按下式計(jì)算DPP-IV抑制率:

    式中:為對(duì)照孔熒光值減去空白孔熒光值的熒光曲線斜率;為樣品孔熒光值減去空白孔熒光值的熒光曲線斜率;為稀釋倍數(shù)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果與分析

    2.1 白啤主要的肽段分析及活性評(píng)價(jià)

    啤酒在釀造發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了多種化學(xué)變化,肽段形成比較復(fù)雜,基于蛋白質(zhì)庫(kù)的搜索方法可能會(huì)忽略一些新肽鏈的形成,因此,采用Peaks軟件中從頭測(cè)序方法,直接利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行肽鏈的鑒定,結(jié)果如表1所示。白啤中共篩選出68 條ALC≥85%的肽段。肽段的長(zhǎng)度為4~14 個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量在400~1 700 Da之間,符合生物活性肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。先前研究認(rèn)為,啤酒中的肽類物質(zhì)主要來(lái)源于谷蛋白,谷蛋白是一類儲(chǔ)存蛋白質(zhì),含有大量的谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)和Pro。在白啤鑒定出的肽段中,有25 條含有Gln、27 條含有Glu、22 條含有Pro。此外,白啤中一些肽段具有連續(xù)的Gln、Glu或Pro序列,如LAVMQQQQQQ、LPQQQAQFK、PPVPHDTD、EELR、TLLSNEEK等。這些肽鏈的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)符合來(lái)源于谷蛋白的特征。另外,利用BIOPEP分析鑒定出的肽段,68 條肽段均未有相應(yīng)報(bào)道。

    表1 白啤中鑒定的肽段及其生物活性預(yù)測(cè)評(píng)分Table 1 Peptide Ranker scores of major peptides identifeid in white beer

    續(xù)表1

    2.2 抑制DPP-IV活性肽的篩選

    2.2.1 Peptide Ranker篩選

    Peptide Ranker是通過(guò)內(nèi)置到1神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)肽段進(jìn)行評(píng)分,該算法基于不同生物活性肽功能類別共有的一般特征預(yù)測(cè)肽段的生物活性,能夠?qū)π滦蜕锘钚噪倪M(jìn)行有效篩選。本研究設(shè)置活性評(píng)價(jià)閾值為0.5,篩選得到4 條肽段(表2),分別是SSLW、VPFPHTP、PMAPLPRGSP、LLLP。運(yùn)用BIOPEP中“profiles of potential biological activity”功能預(yù)測(cè)4 條肽段的潛在生物活性及活性位點(diǎn)氨基酸序列,結(jié)果見表2。通過(guò)BIOPEP的生物活性預(yù)測(cè)可以看出,篩選的4 條肽段存在潛在的DPP-IV抑制活性。

    表2 肽段DPP-IV抑制活性預(yù)測(cè)及活性位點(diǎn)氨基酸序列分析Table 2 Amino acid sequence analysis of active sites in DPP-IV inhibitory peptides

    2.2.2 氨基酸活性位點(diǎn)篩選

    DPP-IV是一種多功能的蛋白水解酶,首先選擇結(jié)構(gòu)上在N端2位具有Pro或Ala殘基的底物,從此類肽段的N末端切割二肽(Xaa-Pro-或Xaa-Ala-),將其轉(zhuǎn)化為無(wú)活性甚至拮抗的形式。因此,報(bào)道的DPP-IV抑制肽大多數(shù)結(jié)構(gòu)中具有Pro和Ala,尤其是N端的第2個(gè)氨基酸為Pro或Ala,這類結(jié)構(gòu)的多肽具有較強(qiáng)的DPP-IV抑制活性。根據(jù)文獻(xiàn)對(duì)于已有DPP-IV抑制肽結(jié)構(gòu)特征的報(bào)道,Peptide Ranker評(píng)分較低的肽段中仍有一些符合DPP-IV抑制肽結(jié)構(gòu)規(guī)律的肽段。因此,本研究根據(jù)氨基酸活性位點(diǎn)對(duì)白啤鑒定出的多肽進(jìn)行篩選,DPP-IV抑制可能性較高的肽段有13 條,如表3所示。

    表3 白啤DPP-IV抑制可能性較高肽段Table 3 Possible DPP-IV inhibitory peptides in white beer

    2.3 肽段的性質(zhì)分析

    采用admetSAR數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選肽段的吸收、代謝、毒性進(jìn)行預(yù)測(cè),如表4所示。血腦屏障是指腦毛細(xì)血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成的血漿與腦細(xì)胞之間的屏障和脈絡(luò)叢組成的血漿和腦脊液之間的屏障,與體內(nèi)其他膜屏障相比,血腦屏障通過(guò)形成通透屏障而嚴(yán)格地限制化合物的滲透,許多化合物和靶向藥物由于無(wú)法在腦組織中達(dá)到足夠的濃度而不能產(chǎn)生期望的治療作用。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,白啤篩選出的肽段中13 條能通過(guò)血腦屏障??诜》肿踊钚噪闹饕ㄟ^(guò)胃腸吸收,活性肽的HIA性質(zhì)有助于預(yù)測(cè)其通過(guò)小腸的吸收概率,文獻(xiàn)表明人體小腸吸收率小于等于30%時(shí),HIA數(shù)值為負(fù)值,反之為正值。結(jié)果表明,篩選的17 條肽段中有6 條在人體小腸可被吸收。代謝預(yù)測(cè)指標(biāo)選擇CYP450綜合抑制率,CYP450是一個(gè)能夠催化氧化底物中反應(yīng)惰性化學(xué)鍵的單加氧酶家族,主要存在于肝臟微粒體中,同時(shí)也少量分布于小腸、肺、腎、腦中,其主要生物學(xué)功能是參與內(nèi)源物質(zhì)的生物合成和代謝及外源物質(zhì)的生物氧化和降解,是代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,17 條肽段的CYP450綜合抑制率均為負(fù)數(shù),表明肽段能提高CYP450酶系的活性,加快肽段在體內(nèi)的代謝速度。毒性預(yù)測(cè)指標(biāo)選擇急性口服毒性,結(jié)果表明,17 條肽段的急性口服毒性均為三級(jí)毒性(LD為500~5 000 mg/kg),毒性較低。因此,綜合肽段的性質(zhì)分析,篩選出SSLW、VPFPHTP、LAKLQR、HAQQQVPVEVMR、FPQQRAELA、PPVPHDTD 6 條肽段進(jìn)行下一步分析。

    表4 白啤中肽段的性質(zhì)分析Table 4 Absorption,metabolism and toxicity characteristics of peptides from white beer

    2.4 分子對(duì)接

    分子對(duì)接是研究分子間相互作用,并預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和結(jié)合力的常用方法。為了進(jìn)一步篩選具有較高抑制DPP-IV活性的肽段,采用分子對(duì)接軟件SYBYL-X 2.1.1進(jìn)行對(duì)接模擬,評(píng)價(jià)篩選的6 條肽段與DPP-IV的結(jié)合能力(表5)。結(jié)果表明,篩選的6 條肽段中有4 條與DPPIV結(jié)合能力較好,肽段HAQQQVPVEVMR和PPVPHDTD的T-Score小于6,表明其與DPP-IV的結(jié)合能力較弱。其中VPFPHTP與LAKLQR的T-Score較高,因此,選擇該2 條肽段進(jìn)行進(jìn)一步分析。

    表5 白啤中肽段的分子對(duì)接得分Table 5 Molecular docking scores of peptides from white beer

    2.5 分子對(duì)接構(gòu)象分析

    分子對(duì)接構(gòu)象分析是直觀確認(rèn)肽段抑制酶活機(jī)理的主要方法之一。圖1~3分別為VPFPHTP、LAKLQR的二級(jí)質(zhì)譜圖以及其與DPP-IV對(duì)接的最佳構(gòu)象圖。圖2A和圖3A中紅色代表正電荷,紫色代表負(fù)電荷,肽段被活性口袋緊緊包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部,表明兩者結(jié)合穩(wěn)定。

    圖1 篩選肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 Secondary mass spectra of selected peptides

    圖2 VPFPHTP與DPP-IV(PDB:5J3J)結(jié)合的最佳構(gòu)象Fig.2 Optimal conformation for the interaction of VPFPHTP with DPP-IV (PDBI:5J3J)

    圖3 LAKLQR與DPP-IV(PDBI:5J3J)結(jié)合的最佳構(gòu)象Fig.3 Optimal conformation for the interaction of LAKLQR with DPP-IV (PDB:5J3J)

    如表6所示,與DPP-IV的結(jié)合中,VPFPHTP可與Asn710、Tyr256、Asp663、Arg669、Tyr631、Gly632、Val546形成9 條氫鍵,存在12 種疏水作用;LAKLQR與Tyr631、Trp659、His740、Asn710、Asp709形成7 條氫鍵,存在13 種疏水作用。從氫鍵的數(shù)量和鍵長(zhǎng)以及疏水作用的結(jié)果可以看出,兩條肽段與DPP-IV相互作用明顯,可有效抑制兩種酶的活性。

    表6 活性肽與蛋白酶作用方式Table 6 Action modes of active peptides and protease

    2.6 活性驗(yàn)證

    對(duì)篩選出的2 條肽段VPFPHTP和LAKLQR進(jìn)行體外抑制DPP-IV活性評(píng)價(jià)。VPFPHTP和LAKLQR對(duì)DPP-IV有明顯抑制活性,其IC值分別為(63.68±3.03)μmol/L和(686.91±12.01)μmol/L,該結(jié)果證實(shí)本研究建立的篩選生物活性肽的方法較為可靠。肽段VPFPHTP的抑制能力較好,活性強(qiáng)于已報(bào)道的肽段IPIPATKT和TKLPVAF,稍弱于LPVPQ和ELHQEEPL。從篩選過(guò)程看,VPFPHTP來(lái)源于Peptide Ranker篩選,LAKLQR來(lái)源氨基酸活性位點(diǎn)篩選,因此在活性肽的初選過(guò)程中需要兩種方法的結(jié)合。不過(guò),從分子對(duì)接中發(fā)現(xiàn),VPFPHTP的T-Score低于LAKLQR,因此,在分子對(duì)接的分析過(guò)程中還需要考慮更多影響因素,方法需進(jìn)一步完善。

    3 結(jié)論

    建立一種從白啤中快速篩選生物活性肽的方法。利用本方法自白啤中鑒定得到68 條肽段,使用Peptide Ranker程序篩選出4 條具有潛在生物活性的肽段,又通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道的氨基酸活性位點(diǎn)篩選出13 條肽段。通過(guò)肽段性質(zhì)和分子對(duì)接評(píng)價(jià)最終篩選出2 條具有潛在的高DPP-IV抑制作用的肽段,利用分子對(duì)接模型理論探析了2 條肽段對(duì)DPP-IV抑制作用機(jī)理,并對(duì)篩選的肽段進(jìn)行體外活性驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)研究了啤酒中存在的生物活性肽,并解析了其活性作用機(jī)理,為啤酒產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分研發(fā)以及精深加工提供了理論支持。

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