pH值響應(yīng)性羧甲基瓊脂糖-聚多巴胺水凝膠制備及緩釋性能

郭雨寧，黃文燦，毛相朝

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

水凝膠具有理想的理化特性、可變的結(jié)構(gòu)、靈活的合成方法和良好的生物相容性，是生物醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用的新興材料。根據(jù)材料的來源，水凝膠可分為合成水凝膠和天然水凝膠。天然水凝膠中研究最為廣泛的是多糖水凝膠和多肽水凝膠。多糖因其來源豐富、制備簡單、成本低廉，同時還具有生物相容性好、生物可降解性和無免疫原性等優(yōu)勢，在生物材料中獲得了廣泛的應(yīng)用。

pH值響應(yīng)性水凝膠是指相轉(zhuǎn)變體積隨著環(huán)境中pH值值變化而變化，且溶脹程度不連續(xù)的一類刺激響應(yīng)性水凝膠。隨著pH值的變化，水凝膠的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和凝膠表面及其內(nèi)部的電荷分布改變，引起水凝膠溶脹的變化，這種性質(zhì)可以非常好的利用在遞送載體中，實現(xiàn)生物活性物質(zhì)的可控釋放。

瓊脂糖是提取自紅藻的一種線性聚合物，由交替的-半乳糖和3,6-脫水--半乳糖組成。瓊脂糖具有良好的生物相容性，被用作組織工程材料和遞送載體。而瓊脂糖在室溫下水溶性較差，導(dǎo)致其應(yīng)用受到了一定限制。為解決這一問題，需對瓊脂糖進行改性修飾，其中一種方法是向瓊脂糖中引入羧甲基，改變瓊脂糖的構(gòu)象，提高水溶性，從而改善生物活性。目前，已有相關(guān)文獻報道了羧甲基瓊脂糖（carboxymethyl agarose，CMA）的合成及表征，但將CMA用于構(gòu)建水凝膠遞送載體的研究較少。目前Khan等以CMA與聚丙烯酰胺為原料制備了高吸水性水凝膠，并證明該水凝膠作為遞送載體的潛力。但由于聚丙烯酰胺具有毒性，使該水凝膠應(yīng)用受到限制。CMA水凝膠在低含水量時具有一定的機械性能，但在高含水量時機械強度明顯下降，在極低的壓強下發(fā)生碎裂，因此需要提高CMA水凝膠的凝膠強度，使其能夠耐受胃腸道的蠕動擠壓作用。

聚多巴胺（polydopamine，PDA）是通過多巴胺氧化聚合制備的活性物質(zhì)，具有優(yōu)異的親水性、化學(xué)反應(yīng)性和生物相容性，已被廣泛用于各種材料的改性和功能化，提高材料的抗氧化活性、細(xì)胞相容性和機械強度。

本研究通過將PDA與CMA相結(jié)合，開發(fā)具有pH值響應(yīng)性且能夠提高CMA水凝膠的機械強度的水凝膠。以瓊脂糖為原料制備了CMA，通過紅外光譜、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、電子顯微鏡和熱重分析等技術(shù)對其進行表征。利用CMA和PDA之間的相互作用制備了CMA-PDA水凝膠，并研究了水凝膠的流變性、質(zhì)構(gòu)性能、pH值響應(yīng)性釋放性能和細(xì)胞相容性，進一步探究CMA-PDA水凝膠用于生物活性物質(zhì)遞送載體的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓊脂糖 美國Sigma公司；鹽酸、氫氧化鈉、氯乙酸、異丙醇、乙醇 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鹽酸多巴胺（98%） 上海麥克林生化科技有限公司；阿霉素（doxorubicin，DOX，99%）、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris，99%）、噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT，98%）試劑北京索萊寶科技有限公司。所有其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet IS10傅里葉變換紅外光譜分析儀 美國賽默飛公司；jeol 1400plus透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；QUANTA FEG250掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；AVANCE III 400M NMR儀 德國Bruker公司；TG 209F3熱重分析儀 德國耐馳公司；MCR301流變儀奧地利Anton Paar公司；TMS-TOUCH質(zhì)構(gòu)儀 美國FTC公司；FL-4600熒光分光光度計 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 CMA的制備

參考Huang Wencan等的方法并加以改進。具體方法如下：首先，在室溫下（25 ℃），準(zhǔn)確稱取10.0 g的瓊脂糖粉末分散在50 mL異丙醇中，然后向懸浮液中緩慢逐滴加50 mL 6.75 mol/L的NaOH溶液。然后在60 ℃水浴條件下，將7.5 g氯乙酸加入懸浮液中，繼續(xù)反應(yīng)2 h。接著向反應(yīng)溶液加入75%乙醇溶液終止反應(yīng)10 min。使用抽濾裝置過濾反應(yīng)溶液，并使用75%乙醇溶液洗滌。最后，將過濾后得到的固形物在50 ℃熱風(fēng)烘箱中干燥24 h，并在25 ℃貯存以備進一步使用。

1.3.2 CMA的表征

使用傅里葉變換紅外光譜分析儀對CMA和瓊脂糖進行表征。使用KBr壓片法進行測試，測試范圍為4 000～400 cm，每次測試重復(fù)掃描64 次以消除背景噪聲。

使用透射電子顯微鏡觀察質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖水溶液和CMA溶液的溶解度差異。

使用掃描電子顯微鏡觀察CMA凝膠和瓊脂糖凝膠的微觀結(jié)構(gòu)差異。將凝膠在－80 ℃預(yù)冷后，使用冷凍干燥機將其冷凍干燥。在真空條件下，對樣品噴金處理，在加速電壓20 kV條件下進行掃描，觀察結(jié)果。

使用NMR儀對CMA和瓊脂糖進行表征。將樣品溶解在二甲基亞砜-中，記錄在二甲基亞砜-中H-NMR（400 MHz）和C-NMR（100 MHz）的NMR圖譜。每次實驗的掃描次數(shù)取決于樣品質(zhì)量濃度（40～50 mg/mL）。

使用熱重分析儀對CMA和瓊脂糖進行表征，稱取干燥的瓊脂糖粉末和CMA粉末置于熱重分析儀中，測試溫度為30～800 ℃，加熱速率5 ℃/min，觀察曲線變化趨勢。

1.3.3 PDA的制備

參考Luo Hongyong等的方法。準(zhǔn)確稱取多巴胺1.0 g，加入1 L pH 8.5的10 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，在有氧條件下超聲4 h，得到PDA溶液。

1.3.4 水凝膠的制備

稱取0.4 g CMA于10 mL去離子水中，將混合溶液加熱至CMA完全溶解，將溶液倒入10 mm×10 mm×10 mm硅膠模具中，4 ℃冷卻2 h，冷卻后得到CMA水凝膠。

稱取0.4 g CMA于10 mL PDA溶液中，混合溶液加熱至CMA完全溶解，將溶液倒入10 mm×10 mm×10 mm 硅膠模具中，4 ℃冷卻2 h，冷卻后得到CMA-PDA水凝膠。

稱取0.4 g CMA于10 mL PDA溶液中，加入20.0 mg DOX作為模型藥物。將混合溶液加熱至CMA完全溶解，將溶液倒入10 mm×10 mm×10 mm硅膠模具中，4 ℃冷卻2 h，冷卻后得到載DOX的CMA-PDA水凝膠。

1.3.5 水凝膠流變性能測試

將CMA和CMA-PDA水凝膠切割為厚度為1 mm的水凝膠薄片，使用流變儀對水凝膠進行流變測試。在溫度為25 ℃、形變量1%條件下進行，頻率掃描為0.01～10 Hz。每組實驗均為3 個平行。

1.3.6 水凝膠質(zhì)構(gòu)性能測試

將CMA 和CMA-PDA 水凝膠制備成10 m m×10 mm×10 mm的正方體，使用質(zhì)構(gòu)儀對CMA和CMAPDA水凝膠的質(zhì)構(gòu)性能進行表征，采用100 N力量感應(yīng)元和35 mm圓盤探頭測試水凝膠的硬度、內(nèi)聚性與凝膠強度。每組實驗均為3 個平行。

1.3.7 水凝膠響應(yīng)性體外釋放性能測試

使用0.10 mol/L鹽酸和0.10 mol/L氫氧化鈉配制pH值分別為2.0、6.2、6.8、7.4的PBS溶液。將含有2 mg/mL DOX的水凝膠添加到10 mL不同pH值的PBS溶液中，分別在1、2、3、4、5 h和6 h后取出200 μL溶液，使用熒光分光光度計檢測波長確定DOX濃度（激發(fā)光波長480 nm，發(fā)射光波長592 nm）。每組實驗均為3 個平行。

1.3.8 水凝膠細(xì)胞相容性測試

取5.0 g水凝膠于燒杯中，按0.2 g/mL的比例加入DMEM培養(yǎng)基，室溫浸泡24 h，得到水凝膠浸提液，滅菌后備用。

水凝膠的體外細(xì)胞毒性測定使用MTT法。將L929細(xì)胞復(fù)蘇后傳代2～3 代，接種于96 孔板上，調(diào)節(jié)至初始密度10/mL，在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，實驗組每孔加入100 μL水凝膠浸提液，空白組每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)基。將96 孔板置于5% CO培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h后，使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，每孔加入50 μL MTT溶液，在黑暗環(huán)境下于5% CO培養(yǎng)箱中37 ℃反應(yīng)4 h。取出平板，棄去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，搖動平板，在波長570 nm處測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 CMA的合成與表征

2.1.1 CMA合成

瓊脂糖在堿性介質(zhì)中進行堿化和羧甲基化，使用氯乙酸對瓊脂糖進行羧甲基取代。圖1顯示了瓊脂糖的羧甲基化過程。

圖1 CMA制備原理Fig.1 Principle of carboxymethyl agarose preparation

2.1.2 CMA的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

如圖2所示，瓊脂糖圖譜中，在3 441 cm處有一個很強的O—H鍵伸縮振動吸收峰，在2 897 cm處出現(xiàn)C—H伸縮振動吸收峰，在1 070 cm處是C—O—C振動吸收峰。與瓊脂糖相比，CMA的紅外光譜基本相同，但出現(xiàn)了1 745 cm和1 374 cm兩個新的特征吸收峰。1 745 cm處為羧基的羰基吸收峰，1 374 cm1處屬于羧甲基的剪切振動特征吸收峰，并且1 235 cm處亞甲基的吸收峰強度增強。而930、892、793、770、738、715、690 cm處瓊脂糖的特征峰在羧甲基化后未發(fā)生明顯變化。根據(jù)以上結(jié)果可以認(rèn)為，成功制備了CMA。

圖2 瓊脂糖和CMA紅外光譜Fig.2 FTIR spectra of agarose and carboxymethyl agarose

2.1.3 CMA NMR分析結(jié)果

如圖3所示，對瓊脂糖的H-NMR譜圖進行分峰。瓊脂糖的氫譜與CMA的氫譜峰形基本相同。除了瓊脂糖的質(zhì)子峰外，CMA中亞甲基C7的質(zhì)子出現(xiàn)在4.46處。CMA的C-NMR光譜結(jié)果表明，在174.31為羧基碳的信號峰和75.11為亞甲基碳的信號峰。

圖3 瓊脂糖和CMA NMR圖Fig.3 NMR spectra of agarose and carboxymethyl agarose

2.1.4 CMA熱重分析結(jié)果

如圖4所示，30～100 ℃的熱質(zhì)量損失為結(jié)晶水的脫除引起，瓊脂糖與CMA的質(zhì)量損失一致，均為8%。150～800 ℃的質(zhì)量損失階段對應(yīng)瓊脂糖的裂解反應(yīng)?？梢钥闯觯珻MA在178 ℃即開始分解反應(yīng)，低于瓊脂糖的起始分解溫度（250 ℃），說明引入羧甲基后，CMA的穩(wěn)定性降低。瓊脂糖和CMA在150～800 ℃的質(zhì)量損失分別為72%和67%。

圖4 瓊脂糖與CMA熱重分析結(jié)果Fig.4 Thermogravimetric analysis of agarose and carboxymethyl agarose

2.1.5 CMA掃描電鏡結(jié)果

通過掃描電鏡觀察瓊脂糖和CMA水凝膠凍干樣品的微觀形態(tài)，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯霏傊呛虲MA在凝膠骨架的結(jié)構(gòu)上有一些相似之處，都具有空間網(wǎng)絡(luò)的微觀結(jié)構(gòu)。瓊脂糖凝膠骨架結(jié)構(gòu)比CMA致密，凝膠內(nèi)孔結(jié)構(gòu)更小，而CMA凝膠的孔結(jié)構(gòu)大且疏松。

圖5 瓊脂糖和CMA掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of agarose and carboxymethyl agarose

2.1.6 CMA透射電鏡結(jié)果

用透射電鏡觀察CMA粉末在水溶液中的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示。在引入羧甲基后，CMA的溶解性得到了顯著的提高，通過1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的瓊脂糖溶液和CMA進行觀察，能夠明顯觀察到溶液的透光率有明顯區(qū)別，見圖6A。瓊脂糖溶解度較差，因此其水溶液相比于水溶性較好的CMA更渾濁。進一步使用透射電鏡觀察2 種水溶液中多糖顆粒的分散性，由于CMA之間的氫鍵作用減弱，并且可以觀察到相比于瓊脂糖顆粒，CMA顆粒的粒徑更小，因此，CMA顆粒在水溶液中具有更好的分散性。

圖6 瓊脂糖和CMA溶液及透射電鏡圖Fig.6 TEM images of agarose and carboxymethyl agarose

2.2 水凝膠流變性能表征

對水凝膠的流變學(xué)性質(zhì)進行表征，測量CMA水凝膠和CMA-PDA水凝膠儲能模量（’）和損耗模量（’’）隨頻率變化的結(jié)果，結(jié)果如圖7所示。

圖7 CMA水凝膠和CMA-PDA水凝膠的流變學(xué)測試結(jié)果Fig.7 Results of rheological test of CMA and CMA-PDA hydrogels

由圖7A可知，在整個頻率范圍內(nèi)，所有水凝膠的’均大于’’，所有水凝膠都顯示出主要的彈性固體行為。圖7B結(jié)果顯示，水凝膠的tan值均小于1，表明所有水凝膠由其彈性行為而不是黏性決定。CMA-PDA水凝膠的’和’’均大于CMA水凝膠，表明PDA的加入提高了水凝膠的黏彈性。并且CMA-PDA水凝膠的tan值大于CMA水凝膠，表明PDA的加入提高了水凝膠吸收外加能量的能力。

2.3 水凝膠質(zhì)構(gòu)性能表征

如表1所示，添加PDA后，CMA-PDA水凝膠的硬度和凝膠強度均有所提高，而CMA-PDA水凝膠的內(nèi)聚性相比CMA水凝膠有所下降。質(zhì)構(gòu)結(jié)果表明，PDA的加入提高了水凝膠的硬度和凝膠強度，降低了水凝膠的內(nèi)聚性。

表1 CMA水凝膠和CMA-PDA水凝膠的質(zhì)構(gòu)性能Table 1 Texture properties of CMA and CMA-PDA hydrogels

2.4 pH值響應(yīng)性釋放

以DOX為模型，研究水凝膠在不同pH值條件下的釋放情況。通過帶負(fù)電荷的CMA鏈和帶正電荷的DOX分子之間的靜電相互作用和DOX與PDA之間的-相互作用，將DOX加載到了CMA-PDA水凝膠中，并研究負(fù)載DOX的水凝膠在模擬腸道環(huán)境（pH 7.4）、腫瘤組織環(huán)境（pH 6.8、pH 6.2）和胃環(huán)境（pH 2.0）的PBS溶液中的釋放DOX的能力，結(jié)果如圖8所示。

圖8 CMA-PDA水凝膠pH值響應(yīng)性釋放曲線Fig.8 pH responsive release curves of CMA-PDA hydrogels

由圖8可知，CMA-PDA水凝膠表現(xiàn)出了明顯的pH值響應(yīng)性。在pH 2.0酸性條件下，水凝膠中DOX的釋放速度明顯高于pH 6.2、6.8、7.4的環(huán)境中，在釋放20 min后，pH 2.0環(huán)境中DOX的累積釋放率已經(jīng)達(dá)到31.24%，而pH 6.2、6.8、7.4的環(huán)境中，DOX的釋放率僅為20.26%、20.12%和16.11%。盡管高濃度的DOX對腫瘤細(xì)胞的殺傷性更強，但過快的釋放會使DOX的有效率下降，并且對周圍正常組織細(xì)胞造成傷害。在釋放初期，CMA-PDA水凝膠都表現(xiàn)出了DOX的快速釋放。前期快速的釋放有利于DOX達(dá)到一定的濃度，從而控制腫瘤的生長。在pH 2.0條件下，釋放6 h后，DOX的釋放速率逐漸減小并最終趨于平緩。而在pH 6.2、6.8、7.4的環(huán)境中，釋放超過2 h后，DOX的釋放速率趨于平緩。在釋放8 h后，在pH 6.2、6.8、7.4的環(huán)境中，水凝膠分別累積釋放了41.36%、37.88%和34.53%的DOX，而pH 2.0條件下，DOX釋放率達(dá)到77.83%。

2.5 水凝膠細(xì)胞相容性

合適的pH值觸發(fā)生物活性物質(zhì)釋放時，一個關(guān)鍵的問題是水凝膠作為傳遞載體在遞送過程中是否具有潛在毒性。在選擇合適的遞送載體時，水凝膠載體的細(xì)胞毒性是一個需考慮的重要因素。因此，一種安全的遞送載體必須低毒甚至無毒性。

以L929成纖維細(xì)胞為模型，將細(xì)胞與水凝膠浸提液和DMEM培養(yǎng)基孵育，分別測定細(xì)胞活性，并使用顯微鏡觀察孵育后細(xì)胞形態(tài)，以評價CMA-PDA水凝膠的細(xì)胞相容性。圖9顯示了孵育后的L929細(xì)胞形態(tài)。與DMEM培養(yǎng)基組相比，可以觀察到水凝膠浸提液處理后，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，說明水凝膠無細(xì)胞毒性。如圖10所示，以DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照，CMA-PDA水凝膠提取液共孵育的細(xì)胞活性均保持在95%以上。結(jié)果表明，該水凝膠具有良好的生物相容性，細(xì)胞毒性可忽略不計，可用作遞送載體。

圖9 細(xì)胞形態(tài)Fig.9 Cell morphology

圖10 CMA-PDA水凝膠的細(xì)胞活性Fig.10 Cell compatibility of CMA-PDA hydrogels

3 討論

通過氯乙酸取代的方法制備CMA，通過傅里葉變換紅外光譜、H-NMR、C-NMR、熱重分析、掃描電鏡、透射電鏡等對其進行了表征。傅里葉變換紅外光譜結(jié)果表明，CMA光譜出現(xiàn)了1 745 cm和1 374 cm兩個新的特征吸收峰，并且1 235 cm處亞甲基的吸收峰強度增強。瓊脂糖的結(jié)構(gòu)特征峰在羧甲基化后未發(fā)生明顯變化，說明羧甲基化沒有破壞瓊脂糖的主要結(jié)構(gòu)。H-NMR、C-NMR的結(jié)果進一步表明成功制備了CMA，氫譜可以觀察到羧甲基亞甲基氫的質(zhì)子峰，碳譜觀察到羧甲基中亞甲基碳和羧基碳的信號峰，峰形較尖，強度和瓊脂糖骨架中碳的信號強度相當(dāng)，說明只在-半乳糖的C6位上進行了較完全的羧甲基化，C2和C5位均沒有被羧甲基化。熱重分析結(jié)果表明CMA的保濕性提高、熱穩(wěn)定性下降，這是由于CMA中存在大量的羧甲基，阻礙了CMA的鏈纏結(jié)、減弱了鏈間氫鍵的強度，進而導(dǎo)致了較低的熱穩(wěn)定性，經(jīng)過羧甲基改性后，CMA中的C元素含量提高，熱解最終形成的殘留物增加，因此，CMA的殘余質(zhì)量高于瓊脂糖。與羧甲基淀粉的結(jié)果類似，羧甲基后瓊脂糖的熱穩(wěn)定性也降低。掃描電鏡結(jié)果與Tuvikene和Kaity等的研究結(jié)果基本一致。根據(jù)Xia Kai和Cao Mingzhao等對羧甲基瓊脂的研究認(rèn)為，羧甲基取代基的引入削弱了凝膠內(nèi)部的氫鍵，阻礙了雙螺旋的形成，使凝膠結(jié)構(gòu)變疏松，難以形成大的瓊脂糖螺旋結(jié)構(gòu)，從而形成類似于片狀的CMA結(jié)構(gòu)。透射電鏡結(jié)果表明，CMA顆粒更小，溶解度和水分散性提高，結(jié)合水的能力更強。

以CMA與PDA為原料，構(gòu)建CMA-PDA水凝膠作為遞送載體。對水凝膠的流變性能進行表征，結(jié)果表明，PDA的加入提高了水凝膠的黏彈性。水凝膠黏彈性的提高是由于PDA的加入，能夠在水凝膠內(nèi)部與CMA形成氫鍵，從而形成更致密氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而能夠耗散外加應(yīng)力導(dǎo)致的能量變化。水凝膠的質(zhì)構(gòu)結(jié)果進一步證明了PDA的加入提高了水凝膠的硬度和凝膠強度。CMA-PDA水凝膠表現(xiàn)出明顯的pH值響應(yīng)性，原因是在酸性條件下，大量的氫離子破壞了CMA鏈上的羧基與DOX的結(jié)合，并且提高了DOX氨基的質(zhì)子化程度，進一步破壞了PDA與DOX之間的-鍵相互作用，使得DOX更容易從PDA表面解離，從而使水凝膠結(jié)合DOX的能力下降，導(dǎo)致DOX大量的釋放出來。與Khan等合成的水凝膠載體相比，CMA-PDA水凝膠合成過程中避免了使用丙烯酰胺，水凝膠的安全性得到了提高。相比Hyun等合成的水凝膠載體，CMA-PDA水凝膠表現(xiàn)出更好的DOX緩釋能力。通過細(xì)胞相容性實驗驗證了CMA-PDA水凝膠沒有潛在的細(xì)胞毒性，可以安全應(yīng)用于生物活性物質(zhì)遞送。

4 結(jié)論

以瓊脂糖為原料，通過氯乙酸取代引入了羧甲基，并對其進行表征，結(jié)果表明成功制備CMA。同時以CMA與PDA為原料，成功制備具有pH值響應(yīng)性的CMA-PDA水凝膠，并對其流變性能和質(zhì)構(gòu)性能進行表征。以CMAPDA水凝膠為載體進行DOX的釋放研究，觀察DOX的可控釋放，結(jié)果表明水凝膠對DOX具有緩釋作用。此外，MTT實驗證明CMA-PDA水凝膠細(xì)胞相容性良好?；诖?，認(rèn)為CMA-PDA水凝膠具有作為遞送載體的潛力。