歸芪通脈顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

郭 麗，陳 皓，吳作敏，于曉濤，陳恒文，金少舉，王 瑞*

（1. 漯河市第一人民醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 漯河 462300；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 心血管科，北京 100053；3. 漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥理學(xué)教研室，河南 漯河 462002）

歸芪通脈方是由黃芪、當(dāng)歸、黨參、陳皮、蜈蚣等14味藥材經(jīng)科學(xué)配伍組成的醫(yī)院制劑，具有補(bǔ)氣活血，化瘀通絡(luò)之功效，用于改善缺血性腦卒中恢復(fù)期的言語謇澀，肢體麻木等，在我院臨床療效良好，具有開發(fā)成為名優(yōu)中成藥的潛力和價值。方中君藥黃芪的主要活性成分黃芪甲苷，通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移等，對缺血缺氧性腦血管內(nèi)皮損傷起到保護(hù)作用[1]；芍藥苷是臣藥赤芍活血化瘀的功效物質(zhì)基礎(chǔ)[2]，有研究芍藥苷通過PC12細(xì)胞中的Bcl-2/Bax通路防止谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[3]；黨參炔苷是佐藥黨參質(zhì)量評價的指標(biāo)性成分之一[4]。

歸芪通脈方經(jīng)提取優(yōu)化工藝制備而成[5]，為了便于患者攜帶和服用，通過提取濃縮而后經(jīng)噴霧干燥開發(fā)成為顆粒劑。為了對該制劑進(jìn)行質(zhì)量控制，本研究采用薄層色譜法對處方中黃芪、赤芍、黨參進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC-DAD雙波長檢測法對羥基紅花黃色素A（HSYA，紅花）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（黃芪）、芍藥苷（赤芍）和橙皮苷（陳皮）4種有效成分進(jìn)行含量測定[6]，為開發(fā)治療中風(fēng)中藥新藥提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Shimadzu LC 20AD型HPLC儀（二級管陣列檢測器）；AUW-120D型電子天平（精度為十萬分之一，日本Shimadzu公司）；SB25-12D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9070型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品HSYA（批號：MUST-19082111，純度：98.11 %）、橙皮苷（批號：MUST-19030701，純度：98.46 %）均購自成都曼思特生物科技有限公司，對照品黃芪甲苷（批號：110781-201616，純度97.40 %）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：111920-201606，含量：97.60 %）、芍藥苷（批號：110736-201842，含量：97.40 %），對照藥材黨參（批號：121057-201206）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；三氯甲烷、乙酸乙酯等試劑為分析純，水為超純水。供試品歸芪通脈顆粒（批號：20200426，20200529，20200626）及陰性樣品，由漯河市第一人民醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 黃芪TLC鑒別[7-8]精密稱取歸芪通脈顆粒10 g，加水20 ml使其溶解，水飽和的正丁醇提取3次，每次30 ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次20 ml，再用水洗至中性，用無水硫酸鈉脫水，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml溶解，作為供試品溶液；同法制成陰性樣品溶液。另取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 ml含1 mg的對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的棕褐色斑點(diǎn)；紫外光下顯相同顏色的橙黃色熒光斑點(diǎn)，陰性樣品在相同位置上無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 黃芪TLC鑒別

2.1.2 赤芍TLC鑒別[9]精密稱取歸芪通脈顆粒5 g，加水20 ml使其溶解，用水飽和的正丁醇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml溶解，作為供試品溶液；同法制成陰性樣品溶液。另取芍藥苷對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）進(jìn)行試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40:5:10:0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5 %香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品在相應(yīng)位置上無干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 赤芍TLC鑒別

2.1.3 黨參TLC鑒別[4]精密稱取歸芪通脈顆粒10 g，加水20 ml，置圓底燒瓶中，加鹽酸3 ml，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液用石油醚（30～60 ℃）提取2次，每次40 ml，棄去石油醚液，再用二氯甲烷提取3次，每次20 ml，合并二氯甲烷提取液，殘?jiān)佣燃淄? ml使溶解，作為供試品溶液；同法制成陰性樣品溶液。另取黨參對照藥材1 g，加水適量，煎煮1 h，放冷，濾過，濾液濃縮至約20 ml，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:18:0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的深褐色斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖3。

圖3 黨參TLC鑒別

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Gemini Phenomenex C18（250 mm×4.6 μm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，15 %→20 % A；5～10 min，20 %→22 % A；10～20 min，22 % A；20～40 min，22 %→80 % A；40～45 min，80 % A；45～48 min，15 % A）。經(jīng)PDA全波長掃描，確定最佳檢測波長為403 nm（HSYA）、220 nm（芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷），故采用雙波長檢測。流速為0.8 ml/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為5 μl。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取對照品HSYA、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷各適量，置入10 ml量瓶，加甲醇溶解并定容，配成質(zhì)量濃度分別為255.10，146.10，116.10，204.80 μg/ml的混合對照品儲備液。

2.2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取歸芪通脈顆粒（批號：20200426）2.50 g，研細(xì)，置入25 ml量瓶，用70 %乙醇稀釋至刻度，稱重，超聲30 min，放冷稱重并補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 ml蒸干，殘?jiān)?0 %乙醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶，作為供試品溶液。

2.2.2.3 陰性樣品溶液制備 分別取缺黃芪、缺赤芍、缺紅花、缺陳皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性考察 分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，見圖4。結(jié)果表明，供試品中HSYA、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和橙皮苷與其他組分的分離度大于1.5，與對照品色譜在相應(yīng)的位置上具有相同的保留時間，陰性樣品溶液對這4種成分的測定均無干擾。

圖4 歸芪通脈顆粒高效液相色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品儲備液2.5 ml，置入5 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，逐級稀釋，制成6個濃度梯度的混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定，以質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（x），4種成分的峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.2項(xiàng)下的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照2.2.1項(xiàng)色譜條件測定并記錄峰面積。結(jié)果，4種成分峰面積的RSD分別為0.29 %，0.21 %，0.31 %，1.74 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號：20200426）2.50 g，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件分別測定峰面積。結(jié)果，4種成分峰面積的RSD分別為1.09 %，1.80 %，2.51 %，2.90 %（n=6），表明重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.6項(xiàng)下同一供試品溶液，于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果4種成分峰面積的RSD分別為1.17 %，1.07 %，2.14 %，2.98 %（n=6），表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 取同一批次已知含量的歸芪通脈顆粒適量，研細(xì)，精密稱取1.25 g，共6份，分別置入25 ml量瓶，加入一定質(zhì)量的混合對照品，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，制得供試品溶液，計(jì)算回收率及RSD，見表2～5。結(jié)果，HSYA、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷的平均回收率分別為101.04 %，98.31 %，99.33 %，98.79 %，RSD分別為1.74 %，1.12 %，1.36 %，1.51 %。表明該方法的回收率良好。

表2 HSYA加樣回收率結(jié)果（n=6）

表3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷加樣回收率結(jié)果（n=6）

表4 芍藥苷加樣回收率結(jié)果（n=6）

表5 橙皮苷加樣回收率結(jié)果（n=6）

2.3 樣品的含量測定

取10批歸芪通脈顆粒，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，見表6。將所測各成分含量平均值的80 %作為內(nèi)控指標(biāo)，暫將含量限度定為：每1 g含紅花以羥甲基紅花黃色素A（C27H32O16）計(jì)不少于0.07 mg，含芍藥以芍藥苷（C23H28O11）計(jì)不少于0.06 mg，含黃芪以毛蕊異黃酮葡萄糖苷（C22H22O10）計(jì)不少于0.04 mg，含陳皮以橙皮苷（C28H34O15）計(jì)不少于0.10 mg。

3 討論

3.1 TLC鑒別方法優(yōu)化

在鑒別黨參時先借鑒了黃芪項(xiàng)下的樣品制備方法，所得TLC色譜圖陰性有干擾且無明顯特征點(diǎn)，后將樣品酸化，置沸水浴，用二氯甲烷水解得到苷元，得到了專屬性強(qiáng)且陰性無干擾的黨參TLC色譜圖。

當(dāng)歸、川芎中均含有阿魏酸，具有抗血栓形成和抑制血小板聚集等作用[10-11]。實(shí)驗(yàn)中曾嘗試同時對當(dāng)歸、川芎進(jìn)行薄層鑒別，但發(fā)現(xiàn)供試品與對照藥材分別對應(yīng)有明顯的亮斑點(diǎn)，但缺當(dāng)歸和川芎的陰性對照溶液卻存在干擾，又經(jīng)過HPLC色譜的對比發(fā)現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)品阿魏酸的相同保留時間和位置存在干擾峰，表明當(dāng)歸和川芎的薄層鑒別不具有專屬性和特征性，故未列入標(biāo)準(zhǔn)。曾嘗試白術(shù)的薄層鑒別，但發(fā)現(xiàn)陰性有干擾，故未列入標(biāo)準(zhǔn)。本研究建立的黃芪、芍藥、黨參的薄層鑒別方法重現(xiàn)性好，分離效果好，特征斑點(diǎn)清晰且陰性無干擾，能有效控制該制劑的質(zhì)量。

3.2 HPLC含量測定方法優(yōu)化

含量測定的指標(biāo)選擇了君、臣、佐藥，首先采用HPLC-ELSD對君藥黃芪甲苷進(jìn)行含量測定，發(fā)現(xiàn)樣品制備操作復(fù)雜，誤差較大，故未列入標(biāo)準(zhǔn)。為減少誤差，選用70 %乙醇直接稀釋樣品，離心取上清的方法制備樣品，同時建立HSYA、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和橙皮苷4個含量測定，采用雙波長法進(jìn)行含量測定，HSYA（403 nm），芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和橙皮苷（220 nm），并且經(jīng)過方法學(xué)考察，專屬性強(qiáng)，精密度高，重現(xiàn)性好。

綜上所述，本研究建立歸芪通脈顆粒的定性定量方法，符合中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的技術(shù)要求，可作為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。