葡萄YUCCA家族基因的鑒定及在穗梗褪綠過程中的表達(dá)分析

李志謙， 鄒東方， 李靖雯， 葉霞， 馮建燦

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002)

生長素是植物生長重要的激素之一，參與植物生長發(fā)育、衰老、向地性和逆境脅迫等多個(gè)生物學(xué)過程[1-5]。IAA(吲哚乙酸，3-Indoleacetic acid)是植物中的主要生長激素，主要通過色氨酸依賴途徑和非色氨酸依賴途徑合成。遺傳研究表明，YUCCA(黃素單加氧酶)可以催化IPA(吲哚-3-丙酮酸，indole-3 pyruvate)生成IAA，是色氨酸依賴合成途徑中的限速酶，對生長素的合成起著重要的作用[2, 6-8]。

YUCCA是一個(gè)多基因家族，目前已在20多種植物中被鑒定得到[1, 9-12]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、楊樹(Populustrichocarpa)、水稻(Oryzasativa)、草莓(Fragariavesca)和玉米(Zeamays)等物種中的分析表明，YUCCA基因家族包括6個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)AD-binding site(黃素嘌呤二核苷酸結(jié)合位點(diǎn))和 NAPDH-binding site(還原型輔酶Ⅱ結(jié)合位點(diǎn))具有典型的GxGxxG序列，對YUCCA酶活性至關(guān)重要，F(xiàn)AD-binding site位于N端，NAPDH-binding site位于基因的中間位置。GC-motif(ExxxxxGG)(GC基序)緊鄰FAD-binding site，可以穩(wěn)定FAD-binding site，ATG-containing motif 1 (DxxxxATG)(ATG基序1)可以連接FAD-binding site和 NAPDH-binding site[13]。FMO-identify sequence motif (FxGxxxHxxxY)(黃酶素單加氧酶識別基序)在NADPH-binding domain的上游且有助于NADPH的結(jié)合[10, 14]。ATG-containing motif 2(ATG基序2)通常位于序列的C端，在A的前方有保守的F，在G的后方有保守的Y[13]。擬南芥、水稻和玉米等植物中的研究結(jié)果顯示，YUCCA基因參與植物生長發(fā)育的多個(gè)生物學(xué)過程，例如在胚胎、維管束、花、果實(shí)、根的發(fā)育過程和葉片衰老中都發(fā)揮著重要作用[2, 6, 15]。

葡萄采摘后，在貯藏過程中，易發(fā)生穗梗褪綠現(xiàn)象，嚴(yán)重影響葡萄的外觀品質(zhì)和商品價(jià)值。生長素及其合成關(guān)鍵基因YUCCA是否參與穗梗褪綠過程還未見報(bào)道。本研究對葡萄中的YUCCA家族基因進(jìn)行了鑒定，利用生物信息學(xué)手段分析了其家族成員的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域，分析了葡萄YUCCA家族基因啟動子順式元件，并檢測了陽光玫瑰葡萄采后貯藏過程中穗梗中生長素含量的變化及YUCCA家族基因的表達(dá)趨勢，研究結(jié)果將為進(jìn)一步分析葡萄YUCCA家族基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 葡萄YUCCA家族基因的全基因組鑒定

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載葡萄12X版本全基因組蛋白序列。利用擬南芥YUCCA蛋白序列在葡萄基因組網(wǎng)站中進(jìn)行篩選搜索。篩選得到的候選基因，使用Pfam(http://pfam.xfam.org/)和 SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線服務(wù)對所有假定序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證。鑒定后的基因根據(jù)其在染色體上的位置進(jìn)行命名。

1.2 葡萄YUCCA家族基因的特征和保守基序分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

從葡萄基因組網(wǎng)站中(http://www.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/)獲取YUCCA家族基因的外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)信息，然后采用在線軟件GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制圖形；蛋白序列提交MEME(http://meme-suite.org/)，設(shè)置輸出值為 5，分析蛋白保守基序；從NCBI數(shù)據(jù)庫下載獲得擬南芥和水稻的YUCCA家族基因序列，通過MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用鄰接法(neighbor-joining)和最短演化長度算法(minimal evolution)，bootstrap test設(shè)置為1 000。利用Clustal X軟件進(jìn)行多重序列比對，然后通過GeneDoc軟件對比對結(jié)果作圖。

1.3 葡萄YUCCA家族基因順式作用元件與表達(dá)分析

通過在葡萄基因組網(wǎng)站中(http://www.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/)搜索，獲得VvYUCCAs家族基因ATG上游2 000 bp的啟動子序列，然后提交PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站，分析啟動子上的順式作用元件；在陽光玫瑰葡萄(VitislabruscanaBaily×V.viniferaL.)成熟期采收果實(shí)，用1-MCP貼劑處理，以未處理的果穗作為對照，于16 ℃、相對濕度95%的條件下貯藏，處理后0、3、7、14、21 和28 d分別采集穗梗，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測YUCCA基因在穗梗中的表達(dá)情況，定量引物見表1；IAA提取方法參照文獻(xiàn)[16]，并利用LC-MS方法[17]，檢測穗梗中內(nèi)源IAA的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄YUCCA家族基因的鑒定

通過在葡萄全基因組查找，鑒定得到10個(gè)YUCCA基因，分布在第4、5、7、11和18染色體上，按這些基因在染色體上的位置進(jìn)行命名VvYUCCA1-VvYUCCA10(表1)。葡萄YUCCA家族基因開放閱讀框大小為1 134～1 569 bp，編碼377～522個(gè)氨基酸。多重序列比對結(jié)果顯示，F(xiàn)AD-binding site和GC-motif，在基因序列的N端，NAPDH-binding site結(jié)構(gòu)域位于序列中間位置(圖1)，F(xiàn)MO-identi-fying sequence結(jié)構(gòu)域位于NAPDH-binding site結(jié)構(gòu)域上游，ATG-containing motif 2位于序列的C端，序列比對結(jié)果與已報(bào)道結(jié)果一致[1,18]。

表1 葡萄YUCCA家族基因的基本信息

黑色表示相似度為100%，灰色表示相似度為75%。

2.2 葡萄YUCCA家族基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系分析

為了闡明葡萄YUCCA家族基因與其他物種之間的進(jìn)化關(guān)系，本研究將葡萄、擬南芥和水稻的YUCCA家族基因構(gòu)建進(jìn)化樹分析(圖2)。與擬南芥相似，葡萄YUCCA家族基因可以分為4個(gè)亞家族，A亞家族包括YUCCA1、8和3，B亞家族成員最少，只有YUCCA2，C亞家族包括YUCCA4和7，D亞家族成員最多，包括YUCCA5、6、9和10(圖2)。

葡萄、擬南芥和水稻中的YUCCA基因分別以綠色、紅色和藍(lán)色表示。

為了進(jìn)一步研究葡萄YUCCA家族基因在結(jié)構(gòu)上的進(jìn)化關(guān)系，本研究對葡萄中的10個(gè)YUCCA基因結(jié)構(gòu)外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，葡萄YUCCA家族基因的結(jié)構(gòu)相對簡單，A、B和D亞家族基因結(jié)構(gòu)相似，都具有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，而C亞家族的2基因則差別較大，YUCCA7和4分別有3個(gè)和5個(gè)外顯子(圖4-B)。

圖3 葡萄YUCCA家族基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析

2.3 葡萄YUCCA家族基因的順式作用元件分析

激素和外部環(huán)境條件都會對基因的表達(dá)產(chǎn)生重要的影響，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育。在葡萄基因組網(wǎng)站上查找YUCCA家族基因ATG上游2 000 bp的啟動子序列，通過在線軟件PlantCare進(jìn)行了順式元件預(yù)測(表2)。在YUCCA家族基因的啟動子中有ABA響應(yīng)元件(ABRE)、SA響應(yīng)元件(TCA)、茉莉酸響應(yīng)元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、生長素響應(yīng)元件(TGA-element)及逆境響應(yīng)元件，如低溫響應(yīng)元件LTR和MBS等。結(jié)果表明，葡萄YUCCA家族基因的表達(dá)與激素和環(huán)境條件密切相關(guān)。

表2 葡萄YUCCA家族基因啟動子順式元件分析

2.4 貯藏時(shí)間對葡萄穗梗褪綠的影響

穗梗褪綠是鮮食葡萄采后面臨的重要問題，嚴(yán)重影響果穗的外觀品質(zhì)和商品價(jià)值。1-MCP(1-甲基環(huán)丙烯，1-methylcyclopropene)是果蔬采后保鮮中常用的保鮮劑。本研究采摘了陽光玫瑰葡萄成熟期的果實(shí)，用1-MCP進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，陽光玫瑰葡萄采后貯藏7 d時(shí)，部分穗梗開始出現(xiàn)褪綠，貯藏14 d時(shí)，大部分穗梗已經(jīng)褪綠，21和28 d，穗梗完全褪綠(圖4)。

圖4 陽光玫瑰葡萄采后穗梗褪綠過程

2.5 葡萄穗梗褪綠過程中IAA含量的變化

激素之間的拮抗和協(xié)同作用在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。為了探究乙烯和內(nèi)源激素生長素對穗梗褪綠的影響，本研究采用陽光玫瑰葡萄為研究材料，用采摘后0、7、14、21和28 d的樣品，進(jìn)行內(nèi)源IAA含量測定。結(jié)果顯示，陽光玫瑰葡萄采后，IAA含量隨著貯藏時(shí)間的延長明顯升高，呈先升高、然后降低，隨后又明顯升高的趨勢(圖5)。

圖5 陽光玫瑰葡萄穗梗褪綠過程中內(nèi)源激素IAA含量的變化

2.6 葡萄YUCCA家族基因在穗梗褪綠過程中的表達(dá)分析

穗梗褪綠是葡萄采后貯藏過程中面臨的重要問題，與葡萄果粒不同，穗梗乙烯釋放量較高[19]，YUCCA家族基因可以作為節(jié)點(diǎn)基因調(diào)控乙烯生成。陽光玫瑰葡萄采后0～28 d，穗梗明顯褪綠，同時(shí)伴隨乙烯含量的升高。為了探究YUCCA家族基因是否參與穗梗的褪綠過程，本研究分析了YUCCA家族基因在陽光玫瑰葡萄采后穗梗中的表達(dá)趨勢。結(jié)果顯示，YUCCA1和YUCCA8與IAA含量呈正相關(guān)關(guān)系，表明這2個(gè)基因可能調(diào)控穗梗褪綠過程中的IAA合成，在穗梗褪綠過程中發(fā)揮重要作用(圖6)。

圖6 YUCCA家族基因在陽光玫瑰葡萄穗梗褪綠過程中的表達(dá)

3 結(jié)論與討論

生長素在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，YUCCA基因是IAA合成過程中的關(guān)鍵基因[2, 9]。截至目前，植物已報(bào)道的YUCCA家族基因除了矮牽牛只有1個(gè)成員外[20]，其他的都是多個(gè)成員，例如擬南芥中有11個(gè)、菘藍(lán)中有13個(gè)[18]、蘋果中有20個(gè)[1]、大豆中有22個(gè)[10]。越來越多的YUCCA基因在不同物種中被發(fā)現(xiàn)。本研究中，在葡萄基因組中鑒定到10個(gè)具有YUCCA家族基因保守結(jié)構(gòu)域的基因，命名為YUCCA1～YUCCA10，不均勻的分布在葡萄的5條染色體上。在6個(gè)結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)AD-binding motifs序列在葡萄的10個(gè)YUCCA基因中完全一致，表明這2個(gè)基序在植物進(jìn)化過程中高度保守。與擬南芥和水稻中的基因進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示這些基因可以分為4個(gè)亞家族，同一個(gè)亞家族的基因含有相似的蛋白基序。與蘋果和玉米中報(bào)道的結(jié)果一致[1, 11]。外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)包括外顯子的數(shù)量、位置及內(nèi)含子的長度在不同的物種或同一物種不同品種之間可能都存在區(qū)別，擬南芥中YUCCA1和YUCCA2有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，而YUCCA5沒有內(nèi)含子[21]；葡萄中同一亞家族YUCCA基因成員間有相似的外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域，表明這些基因可能存在相似功能，而不同的蛋白基序和內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)可能賦予了不同基因特殊的功能。

YUCCA家族基因功能研究在擬南芥、水稻和大豆等植物中已經(jīng)有大量報(bào)道[2, 3, 12, 22-23]。在擬南芥和水稻中，過表達(dá)YUCCA家族基因?qū)е翴AA含量明顯升高[22, 24]，通過YUCCA路徑合成的IAA對胚胎的發(fā)育過程中極性的建立至關(guān)重要[3]。擬南芥AtYUCCA6過表達(dá)后葉片衰老延遲[25]；桃PpYUC11在IAA合成和果實(shí)成熟中發(fā)揮著重要的作用[26]，與果實(shí)硬度密切相關(guān)[27]；草莓中YUCCA1過表達(dá)導(dǎo)致果實(shí)成熟期延遲，果實(shí)中內(nèi)源IAA、葉綠素含量和果實(shí)硬度較高[28]；菘藍(lán)IiYUCCA6基因在煙草中過表達(dá)后IAA含量明顯升高，且可以延緩植株衰老[18]。這些研究表明，YUCCA家族基因參與植物生長發(fā)育的多個(gè)生物學(xué)過程，且在IAA合成過程中的功能比較保守。

對葡萄穗梗褪綠過程中IAA的含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)隨著穗梗褪綠加重，IAA的含量明顯升高。表明IAA可能參與穗梗的褪綠過程。YUCCA是IAA合成的關(guān)鍵調(diào)控基因，在穗梗褪綠過程中，VvYUCCA1和VvYUCCA8與IAA含量呈正相關(guān)關(guān)系。推測這2個(gè)基因是穗梗中調(diào)控IAA合成的關(guān)鍵基因。但是，穗梗褪綠涉及多種因素的參與，例如乙烯和葉綠素降解等[19-29]，IAA是否參與穗梗褪綠過程，VvYUCCA1和VvYUCCA8是否是穗梗褪綠過程中控制IAA的合成的關(guān)鍵基因，與其他因素之間是否存在相互作用有待進(jìn)一步研究。