短尾鐵線蓮不同部位水浸提液對刺槐幼苗根系生長及生理特性的化感作用

于東立, 郭韶鑫, 馮志培, 范貝貝, 楊喜田

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002)

刺槐(RobiniapseudoacaciaL.)抗逆性強，具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)價值，是中國華北太行山區(qū)主要的造林樹種[1-3]。為更利于森林可持續(xù)經(jīng)營，目前該地區(qū)常通過對刺槐人工林進(jìn)行撫育間伐來增加森林蓄積量和改變林分結(jié)構(gòu)[4]。然而，間伐處理使刺槐人工林林冠層結(jié)構(gòu)及林下生境條件發(fā)生改變[5-7]，林下形成的較好的光照環(huán)境，這導(dǎo)致木質(zhì)藤本植物短尾鐵線蓮(Clematisbrevicaudata)大量繁殖[8-10]，并通過纏繞刺槐向上攀長，造成太行山區(qū)大面積的刺槐林生長衰弱甚至死亡[11-14]，嚴(yán)重阻礙了刺槐人工林的可持續(xù)經(jīng)營。

植物化感作用是植物通過向周圍環(huán)境中釋放化感物質(zhì)，從而影響鄰近植物萌發(fā)和生長的效應(yīng)[15]。例如，半夏[16]、勁陟黃芪[17]、豬毛蒿[18]、油菜[19]等通過釋放代謝物質(zhì)(黃酮類和香豆素等)到環(huán)境中，對周圍其他植物的生長和存活產(chǎn)生直接或間接的作用。近年來，化感作用在人工林培育工作中越來越受到重視[20-21]。國內(nèi)外大量研究也已表明皂苷類、黃酮類和香豆素為主要的化感物質(zhì)[22-26]。根據(jù)上述現(xiàn)象，短尾鐵線蓮對刺槐的影響，除物理攀援等因素外，是否存在化感作用還未見報道。因此，從化感角度入手，開展短尾鐵線蓮對刺槐生長和生理影響的研究變得較為重要。

植物化感物質(zhì)分布在植物的根、莖和葉等組織部位。目前，利用不同組織水浸提液是研究植物間化感作用最常用且直接有效的手段[27-28]。然而，植物不同部位接受化感信號反應(yīng)不同[29-30]，也已有研究表明根系受化感作用的影響較為強烈[31-32]。因此，本研究以刺槐幼苗為研究對象，通過對比分析短尾鐵線蓮不同部位(根、莖和葉)水浸提液對刺槐幼苗根系生長和生理特性的影響，以期為從化感作用角度研究刺槐與短尾鐵線蓮的生長關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)，對刺槐人工林如何采取合理的經(jīng)營措施具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地點位于河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)生態(tài)試驗站(34°43′N，112°42′E)遮雨、四周通風(fēng)且透光的網(wǎng)室，光照為自然光。該地區(qū)年平均溫度為14.2 ℃，極端最高溫度為43 ℃，極端最低溫度為-17.9 ℃，全年日常時數(shù)約為2 400 h，年平均降水量為640.9 mm，無霜期約為220 d。

試驗中所用的短尾鐵線蓮來自于河南省濟源市南山林場(35°01′N，112°28′E)，林場位于太行山南段，屬于溫帶大陸性氣候，年平均氣溫為13.4 ℃，年平均降水量為650 mm，全年無霜期為235 d。刺槐種子也來源于此，發(fā)芽率約為86%。

1.2 試驗方法

1.2.1 浸提液的制備 對太行山南段野生短尾鐵線蓮進(jìn)行破壞性采樣，整株挖掘。迅速帶回實驗室，將其分為根、莖和葉3部分，然后放在陰暗通風(fēng)處一起陰干，將其粉碎，分別過0.25 mm篩，獲得短尾鐵線蓮根、莖和葉干粉。參考高玉蓮等[19]的方法制備浸提液，具體步驟為：取3種干粉各100 g，加入1 L蒸餾水充分震蕩，浸24 h后過濾，分別得到質(zhì)量濃度為100 g·L-1的根、莖和葉浸提液。向3種浸提母液加蒸餾水，分別稀釋至5、10、20、30和50 g·L-1，蒸餾水(0 g·L-1)作為對照組(CK)。

1.2.2 試驗設(shè)計 運用盆栽方法，于2018-04-02號將預(yù)處理的露白刺槐種子播種在塑料營養(yǎng)缽中(上口徑20 cm，下口徑13 cm，高25 cm)，每盆3粒，長葉后定苗1株。栽培基質(zhì)為沙子、蛭石和珍珠巖的混合物(V∶V∶V=3∶1∶1)。為避免其他因素的影響，均不噴灑農(nóng)藥和施肥。

育苗3個月后，分別量取300 mL上述5個質(zhì)量濃度梯度的短尾鐵線蓮的根、莖和葉水浸提液對長勢基本一致(株高：(12.25±0.58) cm；地徑：(3.25±0.16) mm)的90株刺槐幼苗進(jìn)行澆灌。同時，用等量的蒸餾水澆灌對照組的6株刺槐苗。每隔1周施加1次，每次添加的浸提液均重新配置，連續(xù)施加13周。整個試驗期間，所有處理每隔3 d澆1次水。于2018-10-15對各處理進(jìn)行破壞取樣。另外，施加浸提液和澆水時，為避免浸提液溢出營養(yǎng)缽底部且分布均勻，將營養(yǎng)缽4等分，每等分處放置有1個進(jìn)水管(高25 cm×內(nèi)徑5 cm)，進(jìn)水管與營養(yǎng)缽基質(zhì)接觸處設(shè)有大小均勻的小孔。

1.3 指標(biāo)測定

采用WILLIAMSON[33]的方法計算化感效應(yīng)指數(shù)(response index，RI)，即：

RI=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T

式中：C代表對照組CK；T代表處理組；當(dāng)RI>0為促進(jìn)作用；RI<0為抑制作用；RI絕對值大小表示化感作用強度的大小。

于2018-10-15對各處理刺槐幼苗采用破壞性取樣，整株挖掘，將根系分離。每種浸提液質(zhì)量濃度下每個組織部位水浸提液澆灌的3刺槐幼苗根系用于測定生物量；另外的3株用于測定生理活性。

(1)根系生物量：放入75 ℃烘箱72 h烘干，稱質(zhì)量(精確至0.000 1 g)，得到根系生物量。

(2)生理指標(biāo)測定：采集的根系迅速用編號的錫箔紙包好，放入液氮速凍，帶回實驗室放入-80 ℃冰箱保存?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)G-250顯色法[34]測定。超氧化物歧化酶活性(SOD活性)采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，過氧化氫酶活性(CAT)采用紫外吸收法檢測[35]，丙二醛(MDA)含量測定方法參照趙世杰等[36]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和計算，用SPSS 25分別對不同組織部位水浸提液和不同質(zhì)量濃度間刺槐幼苗根系生物量的化感效應(yīng)指數(shù)(RI)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(可溶性蛋白和MDA)和抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-ANOVA)，用Turkey法進(jìn)行差異性檢驗(α=0.05)。利用Origin 2018進(jìn)行圖表繪制。圖中數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 短尾鐵線蓮水浸提液對刺槐幼苗根系生物量的影響

與CK(RI=0)相比，短尾鐵線蓮根、莖和葉3種水浸提液澆灌刺槐幼苗后，刺槐根生物量的生長隨質(zhì)量濃度變化呈倒“V”趨勢，即先增長后減小(圖1)。3種水浸提液質(zhì)量濃度在5 、10 和20 g·L-1時對刺槐根系生長均有促進(jìn)作用，其中葉水浸提液在5 g·L-1時對刺槐幼苗根系的促進(jìn)作用強于另外2種水浸提液；在20 g·L-1時，莖水浸提液的促進(jìn)作用卻強于另外2種；在30 g·L-1時，根和莖水浸提液對刺槐幼苗的根系起促進(jìn)作用，而葉水浸提液則抑制了刺槐根系的生長；3種水浸提液均在50 g·L-1時均對刺槐幼苗根系的生長起抑制作用，莖浸提液的抑制作用強于另外2種。

注：不同小寫字母表示相同浸提液不同質(zhì)量濃度之間差異性顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示相同質(zhì)量濃度不同浸提液之間差異性顯著(P<0.05)。

2.2 短尾鐵線蓮水浸提液對刺槐幼苗根系可溶性蛋白和丙二醛(MDA)含量的影響

刺槐幼苗根系的可溶性蛋白含量隨短尾鐵線蓮根、莖和葉水浸提液質(zhì)量濃度(5、10、20、30和50 g·L-1)的升高而降低(表1)，其中葉浸提液對刺槐根系的可溶性蛋白含量的影響最高，與對照(CK)相比，30和50 g·L-1的水浸提液使刺槐根系的可溶性蛋白含量顯著降低1.99 和2.90 mg·g-1(P<0.05)。莖浸提液質(zhì)量濃度在10 g·L-1時，相較于CK顯著增加了刺槐幼苗根系的可溶性蛋白含量，增幅為13.96%(P<0.05)；但在20 g·L-1時卻使其根系可溶性蛋白含量增加了3.94% (P>0.05)。刺槐根系的可溶性蛋白含量隨葉水浸提液質(zhì)量濃度的升高而降低，與CK相比，在5、10和20 g·L-1時無顯著差異 (P>0.05)；而在30和50 g·L-1時顯著減少了35.29%和51.49% (P<0.05)。在20、30和50 g·L-1時，刺槐根系可溶性蛋白的含量受到短尾鐵線蓮葉浸提液的抑制作用顯著大于根浸提液和莖浸提液 (P<0.05)。

與刺槐幼苗根系的可溶性蛋白含量變化規(guī)律相反，根系中的MDA含量均隨短尾鐵線蓮3種浸提液濃度的升高而增加(表1)。50 g·L-1時3種浸提液處理下刺槐幼苗根系的MDA含量比CK顯著增加38.09、25.25和18.99 nmol·g-1(P<0.05)。其中，根浸提液處理下的MDA含量增加最明顯，在浸提液質(zhì)量濃度為50 g·L-1時，比CK顯著增加38.09 nmol·g-1(P<0.05)。10 g·L-1的莖浸提液使刺槐幼苗根系的MDA含量顯著增加11.13 nmol·g-1(P<0.05)。30和50 g·L-1的莖和葉浸提液處理的刺槐幼苗的根系MDA含量均比CK顯著增加15.56和25.25 nmol·g-1，18.52和18.99 nmol·g-1(P<0.05)。在20和50 g·L-1時，根浸提液對刺槐根系MDA含量的促進(jìn)作用顯著大于莖浸提液和葉浸提液(P<0.05)。

表1 短尾鐵線蓮不同部位水浸提液對刺槐根系可溶性蛋白和丙二醛(MDA)含量的影響

2.3 短尾鐵線蓮水浸提液對刺槐幼苗根系抗氧化酶活性的影響

2.3.1 短尾鐵線蓮水浸提液對刺槐幼苗根系POD活性的影響 與CK(RI=0)相比，短尾鐵線蓮根、莖和葉3種水浸提液澆灌刺槐幼苗后，根系POD活性隨質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)先增大后減少的變化趨勢(表2)。其中，根浸提液對刺槐幼苗根系POD活性的影響最大，與對照(CK)相比，20 g·L-1的水浸提液使刺槐根系的POD活性顯著增加了51.81%(P<0.05)；在50 g·L-1時卻使其根系POD活性顯著減少了39.86% (P<0.05)；且在此質(zhì)量濃度下根浸提液對刺槐根系POD活性的抑制作用顯著強于莖、葉浸提液(P<0.05)。與CK相比，莖浸提液在5、10和20 g·L-1時無顯著性增加(P>0.05)；50 g·L-1時顯著減少了24.67%(P<0.05)。葉浸提液在質(zhì)量濃度10、20和30 g·L-1時，對刺槐根系POD活性均有顯著增加，增幅為25.19%、36.09%和5.66%(P<0.05)；在50 g·L-1時，POD活性顯著減少30.0% (P<0.05)。

2.3.2 短尾鐵線蓮水浸提液對刺槐幼苗根系SOD活性的影響 與根系POD活性變化規(guī)律相似，刺槐SOD活性隨短尾鐵線蓮根、莖和葉3種水浸提液濃度的升高，整體呈現(xiàn)先增大后減少的變化趨勢(表2)。根浸提液在質(zhì)量濃度10 、20 、30 g·L-1時，使刺槐幼苗根系SOD活性顯著增加，增幅為14.41%、52.09%和39.85% (P<0.05)；且在20、30 g·L-1時，對刺槐根系SOD活性的促進(jìn)作用顯著大于莖、葉浸提液 (P<0.05)。葉浸提液在5和10 g·L-1時，與CK相比，刺槐幼苗SOD活性不顯著下降1.18%和2.02% (P>0.05)；在20 g·L-1時SOD活性增至最大，增加18.19% (P<0.05)。在50 g·L-1時，3種浸提液澆灌下刺槐幼苗根系SOD活性均顯著小于CK (P<0.05)；莖浸提液對刺槐幼苗SOD活性的抑制最大 (P<0.05)，且與CK相比減少49.11%。

2.3.3 短尾鐵線蓮水浸提液對刺槐幼苗根系CAT活性的影響 刺槐幼苗根系CAT活性隨浸提液質(zhì)量濃度的變化如表2所示。根浸提液在5、10和20 g·L-1時，與CK相比，刺槐幼苗根系CAT活性沒有顯著增大；當(dāng)質(zhì)量濃度30和50 g·L-1時，根系CAT活性受到抑制，其中50 g·L-1時受到顯著抑制，減少37.67% (P<0.05)。莖浸提液澆灌下刺槐幼苗根系CAT活性出現(xiàn)“減少-增大-減少”的變化規(guī)律；在20 g·L-1時，CAT活性不顯著增大，與CK相比增大21.62%；在較高質(zhì)量濃度(30和50 g·L-1)時CAT活性受到抑制，50 g·L-1時，根系CAT活性顯著減少63.05%(P<0.05)。葉浸提液澆灌下CAT活性變化與莖浸提液澆灌下相似，在20 g·L-1時，CAT活性顯著增大40.00%；在30和50 g·L-1時CAT活性顯著受到抑制，減少34.70%和50.70% (P<0.05)。

表2 短尾鐵線蓮不同部位水浸提液對刺槐幼苗根系抗氧化酶活性的影響

3 結(jié)論與討論

植物之間的相互作用是化感作用的一種常見現(xiàn)象，絕大多數(shù)情況下是抑制作用[15]。但師小平等[37]也指出，化感作用的產(chǎn)生是化感物質(zhì)積累到一定的濃度后形成的，在低于這個濃度時，植物的生長不會受到影響，甚至還會對植物的生長起到促進(jìn)作用。

本研究中，不同部位短尾鐵線蓮水浸提液在低質(zhì)量濃度時對刺槐幼苗根系的生長起促進(jìn)作用，而較高質(zhì)量濃度時卻抑制其生長。同時，莖浸提液對刺槐幼苗根系生長的化感作用大于另外2種浸提液。這與前人的相關(guān)研究較為相似[27,38]。莖浸提液對刺槐幼苗根系的影響相對較大，這可能與木質(zhì)藤本植物的生物特性有關(guān)。莖的生物量越大，釋放的化感物質(zhì)也會更多，對支撐木的影響也會更大，通過雨水淋溶等進(jìn)入植物根系從而影響刺槐根系的生長，與李鳳蘭等[27]研究結(jié)果一致。

植物體內(nèi)可溶性蛋白含量是反映植物整體代謝的重要指標(biāo)之一，在細(xì)胞免疫方面也發(fā)揮了重要作用。當(dāng)植物受到脅迫時，體內(nèi)的可溶性蛋白會受到抑制[39]。浸提液質(zhì)量濃度較高時，不同浸提液處理下的刺槐幼苗根系可溶性蛋白含量均有顯著減少，與程巍等[40]研究一致。隨著浸提液質(zhì)量濃度的增大，刺槐幼苗受到的化感脅迫也增大，導(dǎo)致刺槐幼苗蛋白質(zhì)與酶的合成受到抑制或者是化感物質(zhì)進(jìn)到刺槐幼苗細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性，從而表現(xiàn)為含量降低[41]。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)受害的重要標(biāo)志之一[42]。當(dāng)浸提液質(zhì)量濃度較高時，刺槐幼苗根系的MDA含量與CK相比顯著增大，且根浸提液處理下MDA含量大于另外2種。與李潔等[43]研究結(jié)果相似。植物遭受脅迫后，體內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生和消除失去平衡，ROS產(chǎn)生的含量顯著升高，造成氧化脅迫[41]。浸提液較高質(zhì)量濃度時，刺槐幼苗的抗氧化能力不足以抵抗化感脅迫，致使膜質(zhì)過氧化作用增強，MDA含量升高。

植物體內(nèi)ROS含量較高時，體內(nèi)抗氧化酶(SOD、POD和CAT)相互作用，避免膜脂過氧化對細(xì)胞造成傷害[44]。本研究發(fā)現(xiàn)，浸提液質(zhì)量濃度較低時，3種浸提液處理下刺槐幼苗根系抗氧化酶SOD、POD和CAT活性均有不同程度的增大。表明刺槐幼苗受到短尾鐵線蓮化感脅迫后，其自身的抗氧化酶積極響應(yīng)，自身活性增強以此來抵抗細(xì)胞內(nèi)活性氧造成的傷害。浸提液質(zhì)量濃度為50 g·L-1時，3種抗氧化酶活性顯著小于CK，說明這種通過提高抗氧化酶活性來抵抗化感脅迫的應(yīng)激反應(yīng)只在一定受害程度內(nèi)有效[45-46]，不能有效清除刺槐幼苗根系積累的ROS，致使ROS在體內(nèi)逐漸積累，對植株造成不可逆的傷害。SOD、POD和CAT活性在浸提液較低質(zhì)量濃度下，變化規(guī)律略有不同，這可能是短尾鐵線蓮水浸提液中的化感物質(zhì)對刺槐幼苗不同抗氧化酶活性的影響程度不同[19,42]。

綜上所述，短尾鐵線蓮對刺槐幼苗存在一定的化感作用，且短尾鐵線蓮莖浸提液對刺槐幼苗根系生長以及抗氧化酶整體影響較大，可能與短尾鐵線蓮這種藤本植物特性有關(guān)[11-13]，一方面生物量更大的莖中含有的某種化感物質(zhì)更多，在體內(nèi)運輸?shù)降叵赂挡糠謥碛绊懘袒备档恼ＩL發(fā)育，另一方面釋放到環(huán)境中的化感物質(zhì)能夠通過雨霧淋溶的方式進(jìn)入到土壤環(huán)境中，進(jìn)而影響刺槐根系的正常生長發(fā)育[36]。