細(xì)胞自噬在冠狀病毒感染中作用機制的研究進展

夏璐，王棟涵，徐盟龍，黨玉麗，魏戰(zhàn)勇

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河南 鄭州 450002)

細(xì)胞自噬(autophagy)是將細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器或長壽蛋白降解成小肽或氨基酸后供機體再次利用的過程。1963年，比利時生物學(xué)家克里斯汀·德迪夫在溶酶體國際會議(CIBA Foundation Symposium on Lysosomes)上首次提出“自噬”的概念。20世紀(jì)90年代，日本生物學(xué)家大隅良典發(fā)現(xiàn)自噬的作用機制?；谠诩?xì)胞自噬研究方面的突出貢獻，上述2位科學(xué)家分別于1965年和2016年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎[1]。病毒感染細(xì)胞后，自噬會通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫狀態(tài)來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。然而，細(xì)胞自噬在病毒感染中扮演的角色比較復(fù)雜。細(xì)胞自噬可以通過清除丙型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)等抑制病毒感染。同時，一些病毒則通過逃避宿主的自噬和免疫監(jiān)視、促進自身復(fù)制，如薩柯奇病毒B3型、口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)和登革熱病毒(dengue virus,DENV)等[2]。目前，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)肆虐全球，研發(fā)有效的疫苗和抗病毒藥物刻不容緩。與其他RNA病毒類似，冠狀病毒利用宿主細(xì)胞的自噬途徑促進自身復(fù)制，但是否所有的冠狀病毒都利用細(xì)胞自噬促進自身的復(fù)制和致病尚不清楚。因此，本文闡述了冠狀病毒、細(xì)胞自噬以及細(xì)胞自噬在冠狀病毒感染中的作用機制，重點分析了細(xì)胞自噬和冠狀病毒感染的關(guān)系，為冠狀病毒的預(yù)防和治療提供新思路。

1 冠狀病毒的概述

21世紀(jì)以來，冠狀病毒在全世界快速傳播，嚴(yán)重危害人類健康，給社會造成極大恐慌。截至目前，全球已累計確診新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)病例超4億人次，累計死亡人數(shù)超600萬，造成的直接經(jīng)濟損失高達數(shù)十萬億美元。冠狀病毒屬于套式病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)，在自然界中廣泛存在，可感染人、豬、牛、貓和雞等多種脊椎動物。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進化樹，冠狀病毒可以分為α、β、γ和δ這4個屬[3]。α屬冠狀病毒包括豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和豬腸道甲型冠狀病毒(swine enteric alphacoronavirus,SeACoV)等，這些病毒主要感染仔豬腸道引起腹瀉癥狀[4]。β屬冠狀病毒包括嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)和SARS-CoV-2，主要感染人的呼吸道[5]。γ屬冠狀病毒包括雞傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)，可引起雞的呼吸道、泌尿生殖道癥狀[6]。δ屬冠狀病毒包括豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)，感染仔豬后和TGEV/PEDV引起相似的臨床癥狀和病理變化，臨床上難以區(qū)分[7]。

冠狀病毒為有囊膜不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約27～32 kb，是目前已知最大的RNA病毒。冠狀病毒基因組排列順序為：5′非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)，含有1個甲基化帽子—開放閱讀框(open reading frame,ORF)1a/1b—纖突蛋白(spike protein,S)—包膜蛋白(envelope protein,E)—膜蛋白(membrane protein,M)—核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,N)—3′非編碼區(qū)(UTR)，含有1個PolyA尾巴[8]。冠狀病毒主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：S蛋白介導(dǎo)病毒的入侵和膜融合，含有主要的抗原表位；E蛋白與包膜結(jié)合；M蛋白參與子代病毒粒子的外包膜形成及出芽釋放；N蛋白參與病毒RNA的組裝。ORF1a/1b主要編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structure protein,nsp)，這些蛋白不參與構(gòu)成病毒本身結(jié)構(gòu)，但是調(diào)控病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[9]。由于冠狀病毒的S蛋白容易發(fā)生氨基酸的插入、缺失或突變導(dǎo)致病毒的變異，冠狀病毒疫苗不能起到很好的保護作用，且市場上尚無完全抑制冠狀病毒及其變異株傳播的特效藥，因此了解冠狀病毒致病機制，為研發(fā)抗病毒藥物和疫苗提供新思路是目前研究的熱點[10]。

2 細(xì)胞自噬的研究現(xiàn)狀

細(xì)胞自噬即“吃掉自己”，是真核生物中高度保守的生物進化過程，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、促進新陳代謝等方面起著舉足輕重的作用[11]。細(xì)胞內(nèi)多余或受損的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器被雙層膜囊泡(double membrane-bound vesicle,DMV)包裹后形成自噬體(autophagosome)，最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞的自我更新[12]。細(xì)胞本底水平的自噬發(fā)生在營養(yǎng)充足的條件下，可保護細(xì)胞免受錯誤折疊蛋白或受損細(xì)胞器的影響，從而防止某些疾病的發(fā)生(如神經(jīng)退行性疾病和癌癥等)。饑餓、高溫和缺氧等應(yīng)激條件也可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，通過降解大分子物質(zhì)和細(xì)胞器為細(xì)胞活動提供營養(yǎng)和能量。因此，了解自噬發(fā)生、形成及調(diào)控的分子基礎(chǔ)具有重要意義。

真核細(xì)胞介導(dǎo)自噬的方式有巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)。這3種方式都是通過溶酶體和自噬體的融合降解細(xì)胞質(zhì)蛋白，主要區(qū)別是底物和自噬泡的封閉方式不同[11]。巨自噬是通過DMVs將細(xì)胞質(zhì)成分運送至溶酶體，DMVs與溶酶體融合形成自噬體。微自噬是指溶酶體膜直接內(nèi)陷，包裹細(xì)胞質(zhì)中的待降解成分。CMA是靶蛋白上特定的序列被分子伴侶識別形成復(fù)合物，如熱休克同源蛋白70/73識別底物的特定氨基酸序列，形成復(fù)合物與溶酶體膜上的受體-溶酶體相關(guān)膜蛋白2A(Lamp-2A)結(jié)合，導(dǎo)致底物的去折疊化和降解。其中，巨自噬是最常見、最保守以及研究最多的自噬類型[13]。

2.1 細(xì)胞自噬的分子作用機制

細(xì)胞自噬在真核生物中的重要性得到越來越多關(guān)注。近年來，自噬分子水平的調(diào)節(jié)在酵母細(xì)胞中取得突破性進展。目前，從酵母系統(tǒng)中已篩選鑒定出40多個自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes,Atg)，這些基因在霉菌、植物、寄生蟲和哺乳動物中高度保守，表明自噬在整個物種應(yīng)對饑餓的進化過程中發(fā)揮重要作用[14]。自噬開始由磷脂雙分子層形成1個獨立的囊泡，這個囊泡來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)、高爾基體(Golgi)或內(nèi)體。接著，囊泡開始吞沒細(xì)胞質(zhì)成分，如蛋白質(zhì)聚集體、細(xì)胞器和核糖體，包裹這些內(nèi)容物形成DMVs。DMVs與溶酶體融合，通過溶酶體酸性蛋白酶促進自噬體內(nèi)容物的降解。此時，溶酶體通透性增加，一些氨基酸轉(zhuǎn)運載體把降解產(chǎn)物重新運送至細(xì)胞質(zhì)用于大分子的重建或代謝[15]。因此，自噬促進細(xì)胞能量再利用，去除受損的、失去功能的蛋白或細(xì)胞器，是細(xì)胞的能量/物質(zhì)再循環(huán)工廠。

細(xì)胞自噬的生物過程在分子水平上實現(xiàn)需要5個步驟：(1)雙層膜囊泡的形成；(2)Atg5-Atg12-Atg16L形成復(fù)合物并與雙層膜囊泡融合；(3)微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)的轉(zhuǎn)化并插入延伸囊泡膜，形成自噬體；(4)自噬體捕獲需要降解的物質(zhì)；(5)自噬體和溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，蛋白水解酶降解內(nèi)容物[2,16-17]。

在酵母中，雙層膜囊泡膜最初在細(xì)胞質(zhì)中被稱為自噬體前體結(jié)構(gòu)(pre-autophagosomal structure,PAS)的地方形成。哺乳動物細(xì)胞質(zhì)中不存在PAS，DMVs可能來自于ER、Golgi甚至核膜[18]。Atg1(Ulk-1)復(fù)合物是誘導(dǎo)自噬體的初始復(fù)合物，包括Atg1、Atg13和Atg17，受哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物(mammalian target of rapamycin,mTOR)的調(diào)節(jié)。TOR激酶通過感知能量變化調(diào)節(jié)Atg13的磷酸化：當(dāng)能量充足時，Atg13磷酸化，不能與Atg1相互作用；當(dāng)能量缺乏時，Atg13與Atg1、Atg17形成復(fù)合物參與自噬體的形成[19]。Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinases,PI3K)復(fù)合物，包括Vps34-Vps15-BECN1-Atg14，參與自噬體的成核。Vps34僅以磷脂酰肌醇作為底物就可生成磷脂酰肌醇三磷酸，這有利于招募其他的Atg蛋白和自噬體的延伸[20]。

自噬體的延伸需要2個泛素樣結(jié)合系統(tǒng)，即Atg5-Atg12的共軛結(jié)合以及LC3的轉(zhuǎn)化。Atg12首先被Atg7(類似泛素活化酶E1)激活，再通過Atg10(類似泛素活化酶E2)與Atg5共軛結(jié)合形成復(fù)合物，與二聚體Atg16L形成Atg5-Atg12-Atg16L形成多聚體復(fù)合物，參與自噬體的延伸[21]。LC3B屬于胞質(zhì)蛋白，發(fā)生自噬后被半胱氨酸蛋白酶Atg4蛋白水解切割成LC3B-Ⅰ，然后在Atg7和Atg3(類似泛素活化酶E2)作用下與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)結(jié)合形成LC3B-Ⅱ[22-23]。LC3B-Ⅱ參與膜的半融合和底物的降解，其在自噬體膜上的聚集和結(jié)合依賴Atg5-Atg12，可以作為檢測自噬的標(biāo)記物。

自噬體自身的DMVs膜融合完成后，與溶酶體融合，這是自噬體的成熟階段。微管抑制劑抑制自噬體與溶酶體的融合，提示細(xì)胞骨架在自噬體成熟過程中發(fā)揮作用[24]。溶酶體蛋白Lamp-1和Lamp-2等對自噬體的功能也至關(guān)重要。溶酶體組織蛋白酶B/D/L進入自噬體，降解底物產(chǎn)生氨基酸或蛋白，為細(xì)胞提供營養(yǎng)、能量、或再循環(huán)產(chǎn)生新的大分子[25]。

2.2 細(xì)胞自噬與病毒感染的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)，自噬不僅在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，與病毒感染也存在密切聯(lián)系。病毒感染細(xì)胞的生命周期可引起細(xì)胞發(fā)生自噬。CD46是麻疹病毒(measles virus,MV)粘附和入侵細(xì)胞的主要受體。MV感染細(xì)胞初期，CD46激活Golgi相關(guān)的coiled-coil結(jié)構(gòu)域招募的VSP34-BECN1復(fù)合物，進而激活免疫相關(guān)的GTP酶基因家族M蛋白依賴的信號通路誘發(fā)自噬[26]。HIV入侵細(xì)胞后，病毒囊膜與細(xì)胞膜融合的過程中促進活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生[27]?；卓蟻啿《緩?fù)制時引起的ER應(yīng)激(ER stress,ERS)和ROS的產(chǎn)生，促進細(xì)胞自噬的發(fā)生[28]。構(gòu)成病毒的組分也可引起細(xì)胞發(fā)生自噬。病毒感染細(xì)胞后，宿主細(xì)胞感知病毒的基因組和蛋白質(zhì)，直接與自噬調(diào)節(jié)蛋白相互作用，或誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激間接調(diào)節(jié)自噬。自噬在病毒感染過程中有正反2個效果。一方面，自噬通過降解病毒粒子或啟動機體的免疫防御系統(tǒng)抵御病毒的感染；另一方面，自噬被病毒“劫持”促進病毒的復(fù)制[2]。病毒為了生存，已進化形成多種策略來對抗或利用宿主自噬。

2.2.1 細(xì)胞自噬的抗病毒作用 由于自噬的典型功能是形成自噬體，將底物運送至溶酶體進行降解，因此自噬發(fā)揮抗病毒作用主要是通過以下5個方面：(1)降解病毒組分(又稱為“病毒自噬”)；(2)將病毒核酸運送至內(nèi)源的模式識別受體，激活宿主的先天免疫反應(yīng)；(3)將病毒抗原呈遞給主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ和MHC Ⅱ分子，激活宿主的適應(yīng)性免疫應(yīng)答；(4)通過調(diào)節(jié)線粒體的氧化應(yīng)激來誘導(dǎo)先天免疫應(yīng)答：(5)提高細(xì)胞的存活率[15,29]。脊髓灰質(zhì)炎病毒感染細(xì)胞形成的自噬體降解病毒RNA，半乳糖凝集素8識別暴露的β-半乳糖苷，降解和消化包裹的病毒核酸[30]。P62結(jié)合辛德畢斯病毒(sindbis virus,SINV)的核衣殼蛋白將其轉(zhuǎn)運到自噬體中進行降解，自噬體或自噬溶酶體的超微結(jié)構(gòu)中觀察到SINV的存在直接證明了這一現(xiàn)象[2]。敲除Atg5基因后，水泡性口炎病毒或仙臺病毒感染細(xì)胞后抑制了依賴于TLR7的IFN產(chǎn)生途徑[31]。

2.2.2 細(xì)胞自噬促進病毒感染 自噬不僅只有抗病毒作用，一些病毒利用很多策略逃避宿主的自噬，甚至利用自噬來促進自身的增殖[2,15,29]。RNA病毒的組裝和復(fù)制需要在細(xì)胞內(nèi)膜上進行，自噬體的雙層膜結(jié)構(gòu)聚集了大量的復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(replication-transcription complexes,RTCs)，為病毒的復(fù)制提供場所，防止RTCs觸發(fā)免疫反應(yīng)，為基因組的合成提供脂類。激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，DENV、FMDV等病毒RTCs與LC3在自噬體膜上發(fā)生共定位，提示自噬體為病毒的復(fù)制提供場所[32-33]。病毒還通過自噬調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝促進病毒的復(fù)制。DENV感染后，自噬體將脂滴運送至溶酶體耗盡生成游離脂肪酸，游離脂肪酸在線粒體經(jīng)過β氧化生成腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，為DENV的復(fù)制提供能量[34]。此外，自噬還通過抑制宿主的先天免疫反應(yīng)、降解細(xì)胞的抗病毒蛋白促進病毒的復(fù)制[2]。

3 細(xì)胞自噬在冠狀病毒感染中的作用機制

自噬與病毒之間的關(guān)系是特異性的，因此了解自噬與病毒之間的相互作用關(guān)系對研究病毒的致病機制有重要作用[29]。冠狀病毒是RNA病毒家族的重要成員，對人、豬、牛、馬、家禽、狗和貓等多種動物具有感染性。21世紀(jì)以來，人類已經(jīng)遇到SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2共3次冠狀病毒的襲擊，其廣泛的流行和較強的致病性給全球經(jīng)濟造成了巨大的損失，也給人類健康帶來了嚴(yán)重威脅[12]。目前，自噬抑制劑氯喹在體外可以抑制SARS-CoV-2增殖，臨床中已應(yīng)用于COVID-19的治療[35]。目前，關(guān)于冠狀病毒與細(xì)胞自噬的研究主要集中在細(xì)胞自噬與冠狀病毒感染的關(guān)系及其分子作用機制。

3.1 冠狀病毒誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬

冠狀病毒感染宿主細(xì)胞后，細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，產(chǎn)生病毒復(fù)制細(xì)胞器。DMVs是所有冠狀病毒感染細(xì)胞后形成的。除此之外，α和β冠狀病毒產(chǎn)生卷曲膜，γ和δ冠狀病毒產(chǎn)生帶有雙膜球體的拉鏈ER[36]。通過透射電子顯微鏡觀察PEDV和PDCoV感染后的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了DMVs、卷曲膜和拉鏈ER的存在[36-37]。這些細(xì)胞器是病毒RNA合成的場所，為病毒RTCs的高效組裝提供了平臺。同時，DMVs也為病毒RNA以及參與轉(zhuǎn)錄復(fù)制的病毒nsp提供保護屏障，使其不受宿主免疫系統(tǒng)攻擊，極大提高了病毒的復(fù)制效率[38]。SARS-CoV、MERS-CoV和IBV感染細(xì)胞后的RNA合成發(fā)生在DMVs內(nèi)部[39]。在透射電子顯微鏡下觀察到的DMVs形態(tài)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞自噬體極度相似，以此推測DMVs與自噬體的形成有一定關(guān)系，即DMVs可能是病毒感染形成自噬體的開始[40]。冠狀病毒感染細(xì)胞后，參與病毒復(fù)制的蛋白(如nsp2、nsp3和nsp8等)與內(nèi)源性LC3發(fā)生共定位，提示細(xì)胞自噬參與調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制[41-42]。冠狀病毒感染可以激活自噬并監(jiān)測到完整的自噬流。TGEV和PDCoV感染細(xì)胞后經(jīng)western blot檢測發(fā)現(xiàn)，LC3-Ⅱ的表達逐漸增加，p62的表達逐漸減少[43]。然而，ZHAO等[44]研究發(fā)現(xiàn)，在敲除Atg5基因的小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞中，MHV的復(fù)制和釋放并未受到影響。同樣，野生型和敲除Atg5基因的過表達人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2受體的小鼠成纖維細(xì)胞感染SARS-CoV后，病毒的滴度也沒有發(fā)生變化，說明細(xì)胞自噬及Atg5基因并未參與SARS-CoV的復(fù)制[45]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MHV感染細(xì)胞后非脂化LC3包裹的DMVs對病毒復(fù)制是必要的，但與細(xì)胞自噬無關(guān)[46]。因此，每種冠狀病毒具有獨特的復(fù)制需求，細(xì)胞自噬是否參與冠狀病毒的復(fù)制受冠狀病毒毒株、種屬、感染組織或細(xì)胞的差異影響。

3.2 細(xì)胞自噬影響冠狀病毒的感染

研究表明，細(xì)胞的自噬機制被冠狀病毒劫持以利于冠狀病毒的復(fù)制。ZHU等[43]證明TGEV感染豬小腸上皮細(xì)胞后線粒體氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體發(fā)生自噬，抑制細(xì)胞的凋亡途徑，從而促進了TGEV的復(fù)制。GUO等[47]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬促進PEDV的復(fù)制，用BECN1或Atg5缺失或3-MA處理的Vero細(xì)胞感染PEDV，病毒的拷貝數(shù)或滴度明顯降低；自噬激動劑雷帕霉素(rapamycin,RAPA)處理后病毒的滴度顯著增加。深入研究發(fā)現(xiàn)，冠狀病毒的相關(guān)組分如nsp3、nsp4、nsp6、N、木瓜樣蛋白酶(papain-like protease 2,PLP2)、ORF3、ORF8b和ORF9b等可以激活細(xì)胞自噬[48]。細(xì)胞共轉(zhuǎn)染表達SARS-CoV和MERS-CoV的nsp3和nsp4重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)DMVs的形成。IBV、MHV、SARS-CoV、MERS-CoV和PEDV的nsp6可誘導(dǎo)自噬體的形成并抑制自噬體的擴張[12,49]。SARS-CoV、MERS-CoV和PEDV的PLP2-TM通過與BECN1相互作用引起細(xì)胞發(fā)生自噬，促進BECN1與STING的結(jié)合，以此調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的抗病毒策略和冠狀病毒的復(fù)制[50]。PEDV和SARS-CoV-2的ORF3也可引起細(xì)胞發(fā)生自噬[51-52]。除此之外，TGEV和MHV的N蛋白也證明誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，并與LC3共定位于DMVs[43,53]。

然而一些研究用調(diào)控自噬的藥物或干擾自噬相關(guān)基因會得到相反的結(jié)果。GUO等[54]發(fā)現(xiàn)TGEV(H165株)誘導(dǎo)ST細(xì)胞發(fā)生自噬，渥曼青霉素及干擾內(nèi)源性的LC3、Atg5和Atg7處理后的細(xì)胞促進了TGEV的復(fù)制。KO等[55]研究表明，自噬抑制PEDV在IPEC-J2細(xì)胞中的復(fù)制，且RAPA可以緩解PEDV感染造成的細(xì)胞死亡。盡管細(xì)胞自噬調(diào)控冠狀病毒復(fù)制的結(jié)論受到一些質(zhì)疑，造成上述結(jié)果的差異同樣可能是使用了不同的細(xì)胞系、不同的毒株，但這也說明細(xì)胞自噬可能不是參與冠狀病毒復(fù)制的主要因素。因此，自噬如何影響冠狀病毒的復(fù)制有待進一步研究。

3.3 冠狀病毒調(diào)控細(xì)胞自噬的分子作用機制

冠狀病毒介導(dǎo)的細(xì)胞自噬受到多種分子機制的調(diào)節(jié)。BECN1是自噬泡形成的關(guān)鍵蛋白，參與早期自噬體的形成、促進自噬體與溶酶體的融合降解內(nèi)容物。冠狀病毒通過多種策略調(diào)節(jié)BECN1的活性干預(yù)細(xì)胞自噬。人冠狀病毒(human coronavirus,HCoV)NL63 nsp3的PLP-TM結(jié)構(gòu)域結(jié)合到BECN1上，抑制自噬體與溶酶體的融合，從而促進病毒的復(fù)制[50]。MERS-CoV間接調(diào)節(jié)BECN1的蛋白水平表達。MERS-CoV感染VeroB4細(xì)胞后Akt1發(fā)生磷酸化，激活E3泛素連接酶(S-phase kinase-associated protein 2,SKP2)，BECN1發(fā)生泛素化進而降解，從而抑制了自噬體與溶酶體的融合[56]。HCoV-NL63 nsp3的PLP-TM結(jié)合到BECN1/STING1上調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)，通過抑制IFN的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制[50]。其他冠狀病毒(如PEDV和SARS-CoV)的PLP-TM也可以與BECN1相互作用拮抗IFN的產(chǎn)生[57]。

冠狀病毒利用宿主細(xì)胞的運輸機制包裹ER形成DMV，細(xì)胞內(nèi)參與膜重排最多的細(xì)胞器是ER，因此一些冠狀病毒的跨膜糖蛋白嵌入ER到引起ERS也不足為奇[58]。為了恢復(fù)ER的穩(wěn)態(tài)，非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded proteins response,UPR)增加即誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬[59]。UPR信號通路主要由位于ER膜上的3種應(yīng)激感受蛋白所介導(dǎo)：肌醇依賴酶1(inositol requiring kinase 1,IRE1)、轉(zhuǎn)錄激活因子6(activating transcription factor 6,ATF6)和PKR樣ER調(diào)節(jié)激酶(protein kinase R like ER kinase,PERK)。冠狀病毒感染引起UPR的3個信號通路都參與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。IBV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬依賴IRE1介導(dǎo)的ERK1/2信號通路，而不依賴ATF6和PERK通路[60]。PEDV的ORF3蛋白通過PERK-eIF2α信號通路誘導(dǎo)ERS引起細(xì)胞發(fā)生自噬[51]。mTOR在負(fù)調(diào)節(jié)病毒感染引起的自噬過程中發(fā)揮重要作用。SARS-CoV-2的S蛋白和PEDV的nsp6則通過經(jīng)典的PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬[61-62]。

3.4 細(xì)胞自噬與SARS-CoV-2治療相關(guān)藥物

SARS-CoV-2肆虐當(dāng)下，國際疫情形勢嚴(yán)峻復(fù)雜。SARS-CoV-2感染引起人類多細(xì)胞、多組織以及多器官的急性損傷，但是目前仍沒有能夠完全抑制SARS-CoV-2傳播的有效藥物。美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)批準(zhǔn)了一些藥物用于COVID-19的治療，其中近一半的藥物是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的抑制劑(表1)[63-64]。目前，并沒有證據(jù)表明這些藥物直接作用于SARS-CoV-2，推測這些藥物可能作用于細(xì)胞，通過自噬體的累積誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、破壞病毒的復(fù)制周期。氯喹或羥基氯喹已參與臨床治療SARS-CoV-2的聯(lián)合用藥。盡管如此，服用這些藥物帶來的毒副作用仍不能被忽視，因此需要根據(jù)臨床情況合理用藥。

表1 FDA批準(zhǔn)治療COVID-19的自噬相關(guān)藥物

4 展望

冠狀病毒具有跨種傳播的能力，對人類和動物構(gòu)成巨大的潛在威脅。其中，COVID-19對全球經(jīng)濟生活造成一系列重大影響[65]。目前，全球科學(xué)家正在加緊研究SARS-CoV-2的來源和致病機制，以期為SARS-CoV-2的有效防控提供理論依據(jù)。細(xì)胞自噬通過降解途徑維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，抵御病原微生物的感染?，F(xiàn)有研究表明，自噬可能是治療冠狀病毒的潛在靶點。每種冠狀病毒都可能以獨特的方式引起細(xì)胞發(fā)生自噬，那么了解自噬與細(xì)胞內(nèi)不同途徑相互作用影響冠狀病毒復(fù)制的機制，以及探討將這些作用應(yīng)用在其他冠狀病毒感染中的可行性，是成功應(yīng)對類似SARS-CoV-2和未來新型冠狀病毒的重要因素。展望未來，在充分理解冠狀病毒感染的細(xì)胞生物學(xué)方面，研究者可以從冠狀病毒誘導(dǎo)細(xì)胞自噬研究中獲得啟示。雖然目前細(xì)胞自噬對冠狀病毒復(fù)制的必要性有待進一步確認(rèn)，但是，自噬作為了解冠狀病毒與宿主相互作用的重要途徑，對其研究有助于深入了解冠狀病毒感染引起疾病的病理特征、尋找控制冠狀病毒復(fù)制的關(guān)鍵因素以及探索調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的靶點等。此外，通過靶向宿主細(xì)胞途徑而非靶向病原體來增強宿主細(xì)胞的抗病毒能力，是應(yīng)對包括COVID-19在內(nèi)的突發(fā)及重大流行病更重要、更緊迫以及更有前途的治療措施。