劉佳豪,李 磊,彭 林
(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院,湖南邵陽 422000)
杠板歸又名貫葉蓼、蛇倒退等,屬于蓼科蓼屬(Polygonaceae)植物。杠板歸不僅能被加工成可口的菜肴,還是飼養(yǎng)牲畜的優(yōu)質(zhì)植物,是一種集食、飼于一身的植物。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),杠板歸中的黃酮能清除自由基,具有一定的抗氧化活性,因此杠板歸可作為天然抗氧化劑的來源應(yīng)用于食品等方面,如從杠板歸中提取出的黃酮搭配維生素C、維生素E組成抗氧化活性更高的物質(zhì)[1-2]。杠板歸在我國產(chǎn)量大、生長范圍廣,但沒有被大量開發(fā)利用,所以需要加強(qiáng)對杠板歸的研究,擴(kuò)大杠板歸的應(yīng)用范圍,優(yōu)化產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)。目前,杠板歸中總黃酮的提取方法有纖維素酶解法、乙醇回流提取法、超聲提取法和微波提取法等,還沒有利用表面活性劑或離子液體輔助超聲提取法相結(jié)合的有關(guān)研究[3-5]。表面活性劑超聲波協(xié)同輔助提取杠板歸中的黃酮類物質(zhì),能更大程度上使黃酮類物質(zhì)析出,提高提取效率。經(jīng)過單因素試驗(yàn),對表面活性劑輔助超聲提取杠板歸中總黃酮類化合物的條件篩選,得到最佳提取條件,并探究杠板歸黃酮提取物體外抗氧化活性,為杠板歸在食品抗氧化劑中的應(yīng)用提供理論 依據(jù)。
杠板歸,湖南省邵陽市本地采摘;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品;無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸銨、十二烷基苯磺酸鈉、十六烷基三甲基氯化銨、十八烷基三甲基氯化銨、聚乙二醇600、維生素C和1,1-二甲基-2-三硝基苯肼,均為分析純。
DZ-2BC型真空干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司;SB-4200型超聲波清洗器,寧波新芝生物科技股份有限公司;UV-2600型紫外可見分光光度計(jì),日本島津儀器有限公司;FW400A型高速萬能粉碎機(jī),北京科偉永興儀器有限公司。
1.3.1 杠板歸樣品預(yù)處理
取適量杠板歸,曬干、粉碎,過80目篩,真空干燥后放入密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 溶液的制備
①蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取干燥后的蘆丁對照品10 mg置于燒杯中,以70%乙醇溶解并定容至 50 mL容量瓶,搖勻,得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。②亞硝酸鈉溶液。稱取2.50 g NaNO2固體,定容至50 mL容量瓶,制得5%的亞硝酸鈉溶液。③硝酸鋁溶液。稱取5.00 g Al(NO3)3固體,定容至50 mL容量瓶,制得10%的硝酸鋁溶液。④氫氧化鈉溶液。稱取2.00 g NaOH固體,定容至50 mL容量瓶,制得4%的氫氧化鈉溶液。
1.3.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精確吸取0 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、 1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL和3.00 mL放入10 mL容量瓶中,加5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL,靜置6 min; 加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL,靜置6 min;再加4%的氫氧化鈉溶液2.0 mL,最后以70%的乙醇溶液定容至10 mL刻度線搖勻,靜置15 min[6-7]。
以試劑空白作為參比,在波長為510 nm處測定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度,以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度作為橫坐標(biāo),相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo),繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.4.1 表面活性劑種類對提取率的影響
稱取7份5.000 g杠板歸置于7個錐形瓶中,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%(0.050 0 g)的表面活性劑。表面活性劑種類為十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸銨、十二烷基苯磺酸鈉、十六烷基三甲基氯化銨、十八烷基三甲基氯化銨、聚乙二醇600以及空白組。用70%乙醇溶液定容,料液比為1∶20(g∶mL),40 ℃下超聲提取60 min,抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL,取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中,按照1.3.3的操作步驟測吸光度,計(jì)算出總黃酮得率。
1.4.2 表面活性劑用量對提取率的影響
稱取8份5.000 g杠板歸置于8個錐形瓶中,分 別 加 入0.025 0 g(0.5%)、0.050 0 g(1.0%)、 0.075 0 g(1.5%)、0.100 0 g(2.0%)、0.125 0 g(2.5%)、0.150 0 g(3.0%)、0.175 0 g(3.5%)和0.200 0 g(4.0%)十八烷基三甲基氯化銨,用70%乙醇溶液定容,料液比為1∶20(g∶mL),40 ℃下超聲提取60 min, 抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL, 取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中,按照1.3.3的操作步驟測吸光度,計(jì)算出總黃酮得率。
1.4.3 乙醇濃度對提取率的影響
稱取6份5.000 g杠板歸置于6個錐形瓶中,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的十八烷基三甲基氯化銨,錐形瓶中分別加入濃度不同的乙醇溶液,乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%和100%,料液比為1∶20(g∶mL),40 ℃下超聲提取60 min,抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL, 取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中,按照1.3.3的操作步驟測吸光度,計(jì)算出總黃酮 得率。
1.4.4 超聲時間對提取率的影響
精確稱取7份5.000 g杠板歸置于7個錐形瓶中,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的十八烷基三甲基氯化銨,用70%乙醇溶液定容,料液比為1∶20(g∶mL),40 ℃下超聲提取。分別在30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min和90 min時取出一個錐形瓶,做好標(biāo)記,超聲處理后抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL,取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中,按照1.3.3的操作步驟測吸光度,計(jì)算出總黃酮得率。
1.4.5 超聲溫度對提取率的影響
精確稱取6份5.000 g杠板歸置于6個錐形瓶中,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%十八烷基三甲基氯化銨,用70%乙醇溶液定容,料液比為1∶20(g∶mL),分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃下超聲提取70 min,抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL,取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中,按照1.3.3的操作步驟測吸光度,計(jì)算出總黃酮得率。
1.4.6 料液比對提取率的影響
精確稱取4份5.000 g杠板歸置于4個錐形瓶中,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%十八烷基三甲基氯化銨,用70%乙醇溶液定容,60 ℃下超聲提取70 min,考察料液比分別為1∶10(g∶mL)、1∶20(g∶mL)、1∶30(g∶mL)和1∶40(g∶mL)時對杠板歸中總黃酮提取率的影響。超聲處理后抽濾得杠板歸黃酮提取液。將提取液定容至100 mL,取5.0 mL杠板歸黃酮提取液置于10 mL容量瓶中,按照1.3.3的操作步驟測吸光度,計(jì)算出總黃酮得率。
1.4.7 總黃酮提取率計(jì)算
黃酮提取率計(jì)算如公式如下:
式中:ρ為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的提取液所計(jì)算得到的樣品黃酮質(zhì)量濃度,g/L;V0為黃酮提取液的定容體積,L;V1為顯色反應(yīng)中提取液樣品的定容體積,L;V2為所稱量的提取液樣品的體積,L;m為所稱取的質(zhì)量,g。
1.5.1 樣品制備
精確稱取5.000 g杠板歸粉末置于錐形瓶中,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%十八烷基三甲基氯化銨,在乙醇濃度為70%,料液比為1∶30,60 ℃下超聲提取70 min, 超聲處理后趁熱抽濾得杠板歸黃酮提取液,藥渣用70%的乙醇溶液沖洗3遍,抽濾、合并收集杠板歸黃酮提取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶液,得到提取浸膏,待用。
1.5.2 DPPH自由基清除
精密稱取避光冷藏的1,1-二甲基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基粉末0.005 0 g,加入無水乙醇溶解,倒入100 mL容量瓶中,用無水乙醇定容,制得 0.05 mg/L DPPH自由基溶液,避光保存,備用。
取杠板歸黃酮提取浸膏,用無水乙醇配制濃度分別為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL和 2.0 mg/mL的樣品作為杠板歸黃酮提取液,貼好標(biāo)簽。此外在貼有標(biāo)簽的試管中分別加入2 mL上述杠板歸黃酮提取液和2 mL 0.05 mg/L的DPPH自由基溶液,將試管放置于自制的避光紙盒中,輕微搖晃使其混合均勻,室溫條件下放置30 min,于517 nm處測得吸光度(A1);同樣的方法制備樣品對照組,其中采用無水乙醇替代DPPH溶液,貼好標(biāo)簽(A2);空白組也是一樣,無水乙醇替代杠板歸黃酮提取液,貼好標(biāo)簽(A0)。然后根據(jù)順序,依次測量各管吸光度值。維生素C為陽性對照。每個測試管做3組平行,結(jié)果取平均值。樣品對DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下:
式中:A0為2 mL無水乙醇+2 mL DPPH自由基溶液的吸光度值;A1為2 mL杠板歸黃酮提取液 +2 mL DPPH自由基溶液的吸光度值;A2為2 mL杠板歸黃酮提取液+2 mL無水乙醇的吸光度值。
蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=3.774 8X-0.000 7(Y為吸光度,X為濃度,單位為mg/mL),R=0.994 8>0.99。
2.2.1 表面活性劑對提取率的影響
由圖1可知,在其他條件相同的情況下,加入表面活性劑組比不加表面活性劑的空白組的總黃酮提取率高,說明表面活性劑協(xié)同超聲提取杠板歸中總黃酮的效果明顯,其中十八烷基三甲基氯化銨的提取效果最好,總黃酮提取率為5.95%。因此,在后續(xù)采用十八烷基三甲基氯化銨協(xié)同超聲提取杠板歸中總黃酮。
圖1 表面活性劑種類對提取率的影響
2.2.2 表面活性劑用量對提取率的影響
由圖2可知,開始時杠板歸中總黃酮的提取率隨著十八烷基三甲基氯化銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增大,當(dāng)十八烷基三甲基氯化銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.00%時,提取率達(dá)到最大值6.16%,隨后再增加十八烷基三甲基氯化銨的用量,提取率反而降低。這是由于隨著十八烷基三甲基氯化銨用量的增加,溶液中形成的膠束數(shù)目增多,對杠板歸中黃酮的增溶作用變強(qiáng),當(dāng)達(dá)到臨界膠束濃度后,對黃酮的增溶能力變化不大,反而對其他雜質(zhì)有了一定的增溶作用,從而導(dǎo)致黃酮的得率下降。因此,十八烷基三甲基氯化銨的最佳提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.00%。
圖2 十八烷基三甲基氯化銨的用量對提取率的影響
2.2.3 乙醇濃度對提取率的影響
由圖3可知,隨著乙醇濃度的增大,杠板歸中總黃酮的提取率也相對提高,這是因?yàn)楦馨鍤w中的黃酮類化合物在乙醇中的溶解度大于在水中的溶解度,乙醇濃度的增加能夠促進(jìn)黃酮類化合物的析出。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時,提取率達(dá)到最大值6.15%,之后再增加乙醇濃度,提取率反而下降,這可能是由于高濃度的乙醇使得杠板歸中醇溶性雜質(zhì)的溶出率增加,反而抑制杠板歸中總黃酮的提取。因此選擇最佳提取乙醇濃度為70%。
圖3 乙醇濃度對提取率的影響
2.2.4 超聲時間對提取率的影響
由圖4可知,隨著超聲提取時間的延長,杠板歸中總黃酮的提取率也在增加,當(dāng)時間達(dá)到70 min時,杠板歸中總黃酮的提取率達(dá)到最大值6.24%。隨后繼續(xù)增加超聲時長,總黃酮提取率反而下降,可能是由于長時間的超聲導(dǎo)致醇溶性雜質(zhì)的溶出率增加,反而抑制杠板歸中總黃酮的提取。因此,選定最佳超聲時長為70 min。
圖4 超聲時間對提取率的影響
2.2.5 超聲溫度對提取率的影響
由圖5可知,隨著溫度的升高,總黃酮提取率也在增加,當(dāng)溫度升至60 ℃后,提取率達(dá)到最大值6.34%,溫度超過60 ℃后,總黃酮提取率反而降低。說明當(dāng)溫度超過某一臨界值時,會阻礙表面活性劑與杠板歸的結(jié)合,導(dǎo)致提取效率降低。因此,設(shè)定杠板歸中總黃酮的最佳提取溫度為60 ℃。
圖5 超聲溫度對提取率的影響
2.2.6 料液比對提取率的影響
由圖6可知,隨著料液比的增大,杠板歸中總黃酮提取率呈先增加后降低的趨勢,當(dāng)料液比為1∶30時總黃酮的提取率達(dá)到最大值6.43%。料液比的增加會增加杠板歸與提取液之間的黃酮濃度差,使得提取率增大,隨后再增加料液比,其他雜質(zhì)也被析出,從而降低黃酮提取率。因此,料液比為1∶30時最佳。
圖6 料液比對提取率的影響
由圖7可知,隨著提取物和維生素C濃度的增加,DPPH自由基清除率也逐漸升高,表明兩種物質(zhì)都具有清除DPPH自由基的能力,并且與濃度相關(guān),隨著樣品濃度的增加,清除作用也不斷增強(qiáng),具有一定的量效相關(guān)性。當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時,DPPH自由基清除率達(dá)到91.7%,與維生素C的清除率幾乎相同,結(jié)果表明,杠板歸黃酮提取物對DPPH自由基具有良好的清除能力,具有一定的抗氧化 能力。
圖7 杠板歸黃酮提取物對DPPH自由基清除能力圖
表面活性劑協(xié)同超聲提取杠板歸中總黃酮產(chǎn)生了明顯的效果,其中增效最明顯的是十八烷基三甲基氯化銨。通過單因素試驗(yàn),得到表面活性劑協(xié)同超聲波提取杠板歸中總黃酮的最優(yōu)條件為十八烷基三甲基氯化銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.00%,乙醇濃度為70%,料液比為1∶30,60 ℃下超聲提取70 min,在此條件下,杠板歸中總黃酮提取率為6.43%。與單純的超聲提取法相比,表面活性劑協(xié)同超聲提取杠板歸中總黃酮,明顯提高了目標(biāo)產(chǎn)物的得率,降低了生產(chǎn)成本,具有良好的應(yīng)用前景。
通過杠板歸總黃酮體外抗氧化驗(yàn)證,確定了杠板歸中總黃酮的抗氧化能力特征。在DPPH自由基清除中,杠板歸總黃酮提取物在濃度為1.0 mg/mL時,DPPH自由基清除率達(dá)到91.7%,與維生素C的清除率幾乎相同。同時發(fā)現(xiàn)杠板歸黃酮提取物對DPPH自由基具備一定的清除能力,其清除能力主要依賴于自身的質(zhì)量濃度,隨著樣品濃度的增大,清除作用也不斷增強(qiáng),具有一定的量效相關(guān)性。對杠板歸黃酮抗氧化性的研究,有助于擴(kuò)大杠板歸的用途范圍,優(yōu)化產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu),為以后的研究提供參考數(shù)據(jù)。