唐 潔,莫 緒,張啟韓
(桂林師范高等專科學校,廣西桂林 541199)
截止到2020年,包括中國、英國、歐盟、丹麥、俄羅斯及巴西等20多個國家已經禁止或者嚴格限制使用百草枯。目前國內外應用于禁用農藥殘留的檢測技術為氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質譜法、液相色譜-串聯(lián)質譜法和免疫分析法等[1]。
色譜分析法由于檢測儀器體積龐大,對使用環(huán)境及操作者素質都有非常高的要求,同時檢測時間過長,只適合在特定的實驗室由專業(yè)人員進行操作,難以普及推廣應用;免疫分析法主要根據(jù)體外生成原理,利用抗體作為生化探測器實現(xiàn)對農殘的定性和定量分析;其中,采用酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、熒光免疫分析(Fluorescence Immunoassay,F(xiàn)IA)進行檢測都查到有相關文獻報道。但食品中農藥殘留的量往往非常低,這些方法由于其檢測靈敏度和精密度偏低,因而檢測結果達不到國家標準要求的檢出率。在免疫分析法中,利用磁微粒化學發(fā)光法技術檢測百草枯農藥殘留還未見報道[2]。
本文采用單克隆抗體、AP酶標記以及磁微粒分離技術,建立了百草枯的磁微?;瘜W發(fā)光免疫定量檢測方法。該方法是在免疫分析法基礎上發(fā)展起來的集化學發(fā)光、特異性免疫分析及磁微粒分離等技術于一體的新型檢測技術,相對于其他傳統(tǒng)分析方法,該技術具有靈敏度高、檢測范圍寬、檢測結果準確、檢測成本低及易于實現(xiàn)自動化操作等系統(tǒng)性優(yōu)勢,最低可檢測到10-18g量級,能及時有效地為監(jiān)管機構提供監(jiān)測數(shù)據(jù),為政府職能部門監(jiān)測和控制農藥濫用提供現(xiàn)實依據(jù)[3-5]。
三羥甲基氨基甲烷(Tris),西隴化工股份有限公司;氯化鈉,西隴化工股份有限公司;牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA),Sigma有限公司;甘露醇,西隴化工股份有限公司;海藻糖,西隴化工股份有限公司;BRONIDOX-L,天津希恩思生化科技有限公司;吐溫20(Tween20),上海聯(lián)邁生物工程有限公司。試劑均為分析純。
電子天平:AR224CN(奧豪斯儀器有限公司);冷凍離心機:SF-TGL-20R(上海菲恰爾);pH計:Sartoriuspp-20;蛋白測定儀:K9840(山東還能科學儀器有限公司);集熱試恒溫加熱攪拌器:DF-101S (鄭州長城科工貿有限公司);細胞破碎儀:SM-650A(南京舜瑪儀器設備有限公司);制冰機:ZBL-35(上海安亭科學儀器廠)。
1.3.1 試劑緩沖液配制
依次稱取以上物質溶解到800 mL純化水里,用鹽酸調節(jié)pH值為7.4,并定容為1 000 mL的儲備液備用,分別為Tris(0.01 mol/L)、氯化鈉 (0.15 mol/L)、BSA(0.5 mol/L)、甘露醇(0.5 mol/L)、 海藻糖(0.5 mol/L)、BRONIDOX-L(0.01 mol/L)及Tween20(0.05%)。
1.3.2 檢測試劑盒主要組份的制備
檢測試劑盒主要組份由試劑R1、試劑R2及標準液組成。
(1)PQ試劑R1配制。生產工藝流程如圖1所示,采用抗體偶聯(lián)操作工藝。①取10.00 mL磁珠微球(固體物10%),磁分離10 min,棄上清,用100 mL 0.5 mol/L、pH 5.0的MES緩沖液重懸,在混勻儀上混勻10 min;磁分離10 min,棄上清,加入100 mL 0.5 mol/L、PH 5.0的MES緩沖液重懸。②稱取 100 mg N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS),用0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩 沖 液充分溶解至10.0 mg/mL;稱取50 mg EDC,用 0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液充分溶解至 10.0 mg/mL。③在攪拌的條件下,往磁珠微球中先后加入10 mL NHS溶液和5 mL EDC溶液,混勻;④在攪拌的條件下,往磁珠微球中加入百草枯抗體10.00 mg,混勻;⑤磁分離10 min,棄上清,用 100 mL 0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液重懸,混勻;⑥磁分離10 min,棄上清,加100.0 mL 10%BSA重懸,混勻;⑦磁分離10 min,棄上清;用100 mL 0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液重懸,混勻即得。
圖1 R1生產工藝流程圖
(2)PQ試劑R2配制。R2生產工藝流程如圖2所示, 采用抗原標記操作工藝。①稱取5 mg百草枯化合物,12 mg DSS,用200 μL DMSO溶解,再加入10 μL N-甲基嗎啉,混合均勻,37 ℃反應90 min。②反應完成之后再加入1 mL的DMSO,得到百草枯活化液待用。③取1 mg AP酶溶解在0.1 mol/L Tris,pH為8.0的緩沖液中,加入600 μL百草枯活化液,反應 30 min。④反應完成之后,加入100 μL 1 mol/L甘氨酸,反應15 min。⑤用蛋白測定儀確定蛋白標記物濃度。⑥用酶標記物稀釋液稀釋至25 μg/mL。
圖2 R2生產工藝流程圖
1.3.3 標準液的制備
將百草枯國家標準物(貨號:YJ-XXXX)用 0.1 mol/L PH為7.4的PBS緩沖液溶解成1 mg/mL母液;再分別稀釋成0 ng/mL、5 ng/mL、25 ng/mL、 125 ng/mL、250 ng/mL及500 ng/mL 6個不同濃度的標準液C1~C6。
用6個不同濃度標準液對發(fā)光儀進行定標后,分別進行準確性、靈敏度、特異性、精密度以及穩(wěn)定性分析。
將1 mL高濃度標準液C5(250 ng/mL)加入到9 mL低濃度標準液C1(0 ng/mL)中,混勻后在化學發(fā)光免疫分析儀上測試混合液和低濃度標準液濃度值,各測試3次,計算平均值,回收率應在85%~115%。根據(jù)公式(1)計算結果,回收率為99.58%,在要求范圍以內。測試數(shù)據(jù)見表1。
表1 準確度測試數(shù)據(jù)
式中:R為回收率,%;V為加入高濃度標準液體積,mL;V0為低濃度標準液的體積,mL;C為混合液測試平均值,ng/mL;C0為低濃度標準液測試值,ng/mL;Cs為已知高濃度標準液濃度,ng/mL。
取標準液C1和C2作為待測樣本,在化學發(fā)光測定儀上對C1進行20次測定,C2測試3次,統(tǒng)計測量結果的發(fā)光值(RLU),計算C1的平均值(M)和標準差(Standard Deviation,SD),得出M-2SD;同時根據(jù)C1和C2之間的發(fā)光值(RLU)進行兩點回歸擬合得出一次方程,將M-2SD的RLU值代入上述方程中,求出對應的濃度值,即為產品的靈敏度,要求靈敏度不能大于5 ng/mL(國家標準要求最低殘留量)。從表2數(shù)據(jù)可以計算得出,試劑檢測靈敏度為0.37 ng/mL,遠遠小于5 ng/mL,產品具有很高的靈敏度。
表2 靈敏度測試數(shù)據(jù)
往試劑盒中滴加干擾物并在化學發(fā)光測定儀上分別測定濃度為500 ng/mL的干擾物多菌靈和毒死蜱,各測試3次,測定結果應不得高于0.5 ng/mL。從表3數(shù)據(jù)可以看出,兩組干擾物的測試結果均遠遠小于0.5 ng/mL,說明試劑盒受干擾物影響很小,具有很高的特異性。
表3 特異性測試數(shù)據(jù)
在化學發(fā)光測定儀上分別測定標準液C2和C5,各重復測試至少10次,分別計算測量值的平均值(x—)和標準差(SD)[6]。計算變異系數(shù)(Coefficient of Variation,CV),結果應≤8%。由表4可知,標準液C2和C5變異系數(shù)均小于8%,產品的精密度 很高。
表4 精密度測試數(shù)據(jù)
將制備好的試劑盒進行37 ℃加速老化7 d后,用化學發(fā)光免疫分析儀測試,對測試結果的發(fā)光值(RLU)進行對照,數(shù)據(jù)見表。從表5中統(tǒng)計結果可以看出,實驗組的蛋白活性回收率達到了95%以上,說明試劑盒穩(wěn)定性很好。
表5 穩(wěn)定性實驗結果對照表
利用磁微?;瘜W發(fā)光法技術對百草枯6個不同濃度的標準液C1~C6進行檢測,通過準確性、靈敏度、特異性、精密度以及穩(wěn)定性分析,可以得到回收率為99.58%,檢測靈敏度為0.37 ng/mL,精密度≤8%,蛋白活性回收率可達到98.17%。