宮頸鱗狀細胞癌組織核糖體結(jié)合蛋白1、E2F轉(zhuǎn)錄因子1的表達及其臨床意義

史璟，武燕*，孟紅艷，常江

在全球范圍內(nèi)，宮頸癌在女性常見惡性腫瘤中患病率居于第二位，僅次于乳腺癌，世衛(wèi)組織2012年調(diào)查顯示全球每年宮頸癌新發(fā)人數(shù)超過50萬，而我國每年新發(fā)病例占全球的28%[1]。宮頸腫瘤侵襲性較強，即便行手術(shù)治療，術(shù)后也易復發(fā)、轉(zhuǎn)移，中晚期預后欠佳[2]。宮頸鱗狀細胞癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)是宮頸癌的主要組織學類型，其發(fā)生與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激有關(guān)，當機體出現(xiàn)病毒侵襲、炎癥等情況時，細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于失衡狀態(tài)，可引起不同程度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)反應，從而介導腫瘤細胞凋亡、自噬過程[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)核糖體結(jié)合蛋白1(reticulum ribosome-binding protein 1，RRBP1)作為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激有關(guān)，敲除其表達能誘發(fā)ERS，下調(diào)細胞活力，減輕致瘤性[4]。E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F transcription factor 1，E2F-1)是轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，對細胞周期有調(diào)控作用，能調(diào)節(jié)細胞增殖與凋亡，它對腫瘤細胞能產(chǎn)生多方面的影響，既能轉(zhuǎn)錄抑制，也可轉(zhuǎn)錄激活[5]。有學者研究發(fā)現(xiàn)miR-136可通過NF-κB信號通路靶向調(diào)控E2F-1表達，抑制宮頸癌細胞增殖[6]。目前，臨床尚未明確RRBP1、E2F-1與CSCC的關(guān)系，關(guān)于CSCC的進展機制也有待進一步探討。基于上述背景，本次選取83例CSCC患者進行研究，分析RRBP1、E2F-1在CSCC組織中的表達情況及臨床價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取山西省腫瘤醫(yī)院2017年7月至2018年1月收治的CSCC患者83例作為CSCC組，另選取同期于我院行宮頸活檢的慢性宮頸炎患者80例作為對照組。納入標準：① CSCC組：診斷標準參考《臨床疾病診斷與療效判斷標準》[7]，經(jīng)病理診斷證實為CSCC，年齡>18歲；入院前未接受過放療、化療；認知功能、溝通能力正常；對研究內(nèi)容知情同意者。② 對照組：診斷標準參考《婦產(chǎn)科學》(第8版)[8]，有可疑宮頸病變且經(jīng)宮頸活檢證實為慢性宮頸炎，年齡>18歲；認知功能、溝通能力正常；對研究內(nèi)容知情同意者。排除標準：患有其他原發(fā)性腫瘤；患其他危及生命的疾病，如嚴重的心腦血管疾病、肝病、腎病等。研究方案獲我院倫理委員會批準。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 主要試劑為RRBP1抗體免疫組化試劑盒(上海彩佑實業(yè)有限公司，貨號：CY-6574R)、E2F-1抗體免疫組化試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司，貨號：s-11278R)、DAB顯色劑(上海烜雅生物科技有限公司，貨號：XY-MY-0075)。主要儀器為醫(yī)用石蠟切片機(新鄉(xiāng)市維克科教儀器有限公司，型號：VCM-1900B)、顯微鏡[奧林巴斯(北京)銷售服務(wù)有限公司，型號：CX43]、恒溫水浴箱(上海輔澤商貿(mào)有限公司，型號：HS-5001)。

1.2.2 檢測方法 分別收集CSCC組手術(shù)切除的癌組織以及對照組的活檢組織，利用免疫組化法檢測組織中RRBP1、E2F-1的表達情況，具體如下：① 蠟塊制備：獲得組織塊后，經(jīng)PBS液進行沖洗，利用10%中性甲醛液將組織塊浸泡4～8 h；將固定液倒掉，用蒸餾水、50%酒精分別清洗3次、2次，采用70%、80%、95%酒精以及無水酒精I、II逐級脫水；置于1∶1二甲苯石蠟混合液內(nèi)45 min，利用二甲苯I、II各浸泡30 min；浸入石蠟，在58℃下行1∶1二甲苯石蠟處理，時間為45 min，石蠟I、II、III共反應2.5 h，進行組織包埋；采用切片機行石蠟切片，厚度為4 μm；取石蠟塊置于50℃溫水中浸泡，經(jīng)載玻片撈片，將組織帶黏于載玻片。② 免疫組化染色：在脫蠟之前，將組織芯片放置在室溫下1 h，或經(jīng)恒溫箱(60℃)烘烤20 min，經(jīng)二甲苯I、II浸泡，時間共25 min；置于無水酒精I、II內(nèi)各2 min，然后置于95%、80%、70%酒精內(nèi)各2 min；經(jīng)PBS液清洗3次，5 min/次；加入3% H2O2去離子水反應10 min，將內(nèi)源性過氧化物酶活性滅活；PBS液清洗方式同上；加入枸櫞酸鹽緩沖液(0.01 M)，煮沸，自然冷卻，時間為20 min，PBS液清洗方式同上；滴加山羊血清封閉液，在室溫下反應20 min，將多余液體甩去；加入50 μL一抗，在37℃下反應1 h，或者在4℃下過夜；PBS液清洗方式同上；取40～50 μL二抗加入，在37℃下反應1 h；PBS液清洗方式同上；滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，在室溫下反應30～60 min；PBS液清洗方式同上；行DAB顯色，時間5～10 min，利用顯微鏡觀察著色情況；經(jīng)蘇木精復染2 min，利用自來水進行3次清洗，1 min/次；經(jīng)鹽酸酒精分化，時間為1 min，經(jīng)自來水沖洗15 min，返藍；脫水、透明以及封片，鏡檢。

表1 兩組一般資料比較例(%)]

1.3 免疫組化結(jié)果判定

判定標準[9]：經(jīng)高倍鏡(×400)觀察陽性細胞表達情況，根據(jù)陽性細胞數(shù)、陽性細胞染色程度進行評分，若出現(xiàn)棕黃、棕褐色則為陽性，陽性細胞主要在細胞核、細胞漿內(nèi)。① 染色程度評分：無色、淡黃、棕黃、棕褐色分別計0分、1分、2分、3分。② 陽性細胞數(shù)占比評分：陽性細胞≤10%、11%～50%、51%～75%、>75%分別計1分、2分、3分、4分。二者乘積即為評分結(jié)果，0～3分為陰性，4～5分為弱陽性，6～7分為中度陽性，≥8分為強陽性，其中弱陽性、中度陽性、強陽性均記為陽性。

1.4 隨訪

術(shù)后通過門診復查或電話及微信聯(lián)絡(luò)等方式對患者進行為期3年的隨訪，隨訪截止日期為2021年1月31日，記錄患者的生存情況。

1.5 統(tǒng)計學方法

經(jīng)SPSS 20.0軟件行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用例(%)表示，行χ2檢驗。等級資料用例(%)表示，行秩和檢驗。應用Kaplan-Meier曲線及Log-rank檢驗分析不同RRBP1、E2F-1表達CSCC患者術(shù)后3年的生存情況。經(jīng)多因素Cox回歸分析CSCC患者預后的影響因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者病變組織中RRBP1、E2F-1表達情況比較

CSCC組患者RRBP1、E2F-1陽性表達率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 兩組患者病變組織中RRBP1、E2F-1表達情況比較[例(%)]

2.2 CSCC患者RRBP1表達與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)RRBP1表達情況將患者分成RRBP1陽性組與陰性組。不同F(xiàn)IGO分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、脈管浸潤、人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染情況的CSCC患者癌組織中RRBP1表達情況對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同年齡的CSCC患者癌組織中RRBP1表達情況對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見下頁表3。

表3 CSCC患者RRBP1表達與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 CSCC患者E2F-1表達與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)E2F-1表達情況將患者分成E2F-1陽性組與陰性組。不同F(xiàn)IGO分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、脈管浸潤、HPV感染情況的CSCC患者癌組織中E2F-1表達情況對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同年齡的CSCC患者癌組織中E2F-1表達情況對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見下頁表4。

表4 CSCC患者E2F-1表達與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 CSCC患者RRBP1、E2F-1表達情況與無瘤生存率、總生存率的關(guān)系

隨訪3年，無失訪患者。RRBP1陽性組與RRBP1陰性組術(shù)后3年的無瘤生存率和總生存率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);E2F-1陽性組與E2F-1陰性組術(shù)后3年的無瘤生存率和總生存率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見下頁表5，K-M生存曲線見110頁圖1。

表5 CSCC患者RRBP1、E2F-1表達與無瘤生存率、總生存率的關(guān)系

圖1 不同RRBP1、E2F-1表達患者的無瘤生存和總生存曲線

2.5 CSCC患者預后影響因素的多因素Cox回歸分析

利用多因素Cox回歸分析模型對相關(guān)變量行量化賦值，以CSCC患者預后為因變量Y(生存=0，死亡=1)，結(jié)果提示FIGO分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、HPV感染以及RRBP1、E2F-1表達是CSCC患者預后的影響因素(P<0.05)，詳見110頁表6。

表6 CSCC患者預后影響因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

宮頸癌是一種常見的婦科腫瘤，病理分型以CSCC居多，目前，臨床針對CSCC已有多種治療方法，如手術(shù)切除、放療、化療等[10]。癌癥的發(fā)生可能與癌基因激活、抑癌基因活性喪失以及生長因子、細胞周期、細胞凋亡等多種因素存在關(guān)聯(lián)，是以上因素相互作用、影響的結(jié)果。臨床需盡早明確CSCC癌細胞調(diào)節(jié)、生長機制，這對腫瘤診療與預后判斷有重要意義。彭彥才等[11]研究顯示，RRBP1在食管癌中呈過表達，對預后有較大影響。國外研究提示RRBP1參與了口腔鱗狀細胞癌進展，且會影響化療耐藥性，從而影響患者的化療效果[12]。這表明RRBP1可能與腫瘤進展有關(guān)，但現(xiàn)階段臨床尚不明確RRBP1是否參與了CSCC進展，有待進一步論證。另有研究指出E2F-1也與腫瘤疾病相關(guān)，但其具備抑癌、促癌雙重作用，在不同的腫瘤類型中可呈不同表達狀態(tài)[13]。國外研究發(fā)現(xiàn)E2F-1與乳腺癌關(guān)系密切，通過對E2F-1表達進行抑制，能提升拉帕替尼和細胞毒藥物在乳腺癌中的抗腫瘤效果[14]。目前，臨床關(guān)于E2F-1與CSCC之間的關(guān)系尚未明確，仍需對此深入探討。

本次研究結(jié)果提示，CSCC組的RRBP1、E2F-1陽性表達率較對照組高，提示二者可能與CSCC發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。RRBP1由1 410個氨基酸組成，在腫瘤細胞株中呈高表達，其在癌癥中的作用機制比較復雜，可能與ERS作用有關(guān)[15]。癌癥的發(fā)生通常伴有微環(huán)境異常表現(xiàn)，如慢性炎癥、組織異常增生等，可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊機制被破壞，使錯誤折疊或者完全未折疊蛋白質(zhì)聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細胞內(nèi)環(huán)境處于紊亂狀態(tài)并誘發(fā)ERS，而RRBP1可通過作用于ERS導致腫瘤細胞凋亡減少，促進癌癥進展[16]。E2F-1在癌癥組織中的表達存在特異性，研究表明其在膠質(zhì)瘤、肝癌中呈高表達，但在前列腺癌中可見低表達，提示E2F-1在不同癌癥中的作用機制可能存在差異[17-19]。本研究顯示，E2F-1在CSCC中主要發(fā)揮促癌基因作用。這一作用機制可能在于E2F-1能與宮頸上皮細胞瘤蛋白結(jié)合，參與細胞凋亡過程，而E2F-1突變則可導致其與宮頸上皮細胞瘤蛋白結(jié)合失敗，二者無法相互作用，導致E2F-1對細胞凋亡的調(diào)控作用削弱[20]。

CSCC患者RRBP1、E2F-1表達情況與臨床病理特征存在關(guān)聯(lián)，本次研究結(jié)果提示，二者陽性表達與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤有關(guān)。董孟權(quán)等[21]發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌患者癌組織中RRBP1陽性表達率高于癌旁組織，且其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)。這進一步提示RRBP1參與了癌癥病理進展，臨床需引起重視。Iglesias P等[22]研究提示E2F-1能對細胞周期進行調(diào)節(jié)，且在E2F-1表達過度活躍的情況下，容易造成腫瘤發(fā)生。這提示E2F-1與惡性腫瘤密切相關(guān)，參與了腫瘤疾病發(fā)生與進展過程。CSCC的主要轉(zhuǎn)移途徑為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，RRBP1、E2F-1可能通過某種機制，影響細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微環(huán)境介導腫瘤進展，使癌細胞到達病灶周圍淋巴管，并形成瘤栓，一旦癌細胞進入淋巴液，則會隨其流動進入淋巴結(jié)，引起脈管浸潤，增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險，臨床可見FIGO分期增高。本研究提示RRBP1、E2F-1表達還與分化程度、腫瘤大小、HPV感染有關(guān)。分化程度越低的患者惡性程度更高，通常臨床分期也高，腫瘤轉(zhuǎn)移風險大。而腫瘤越大的患者能造成周圍組織壓迫，可能加重惡變程度。HPV感染與宮頸癌存在密切關(guān)聯(lián)，持續(xù)的高危型HPV感染可引起宮頸癌前病變，誘發(fā)宮頸癌。上述惡性轉(zhuǎn)化過程可能進一步加劇RRBP1、E2F-1的陽性表達，促進病情進展。本次研究結(jié)果顯示RRBP1、E2F-1陽性患者的總生存率均較低，且二者是CSCC患者預后的影響因素。通過上述分析發(fā)現(xiàn)，RRBP1、E2F-1陽性在高FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤的患者中較常見，這類患者腫瘤惡變程度高，侵襲性強，病情往往更嚴重，死亡風險更高。此外，F(xiàn)IGO分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、HPV感染也與患者預后有關(guān)，這些均為常見因素，臨床也需引起重視。Zhu J等[23]發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中RRBP1呈過表達，它可能是CSCC的新生診斷標志物。Yang C等[24]研究提示E2F1在宮頸癌中呈過表達，且與淋巴管侵襲、宮頸間質(zhì)深部侵襲有關(guān)，對患者的總生存期、無病生存期影響較大。這均為本研究結(jié)論提供了支持，且本研究進一步揭示了二者與CSCC患者臨床病理特征的關(guān)系，證實其表達與FIGO分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、脈管浸潤均有關(guān)，且二者均對無瘤生存率、總生存率有評估價值，臨床有望通過分析RRBP1、E2F-1表達情況，輔助CSCC患者的預后預測。

綜上所述，CSCC患者RRBP1、E2F-1表達以陽性為主，二者表達情況與患者預后密切相關(guān)。本研究局限性為選取樣本量少，隨訪時間較短，未來還需擴大樣本量，延長隨訪時間更深入分析二者作用機制。