外泌體源miRNA在子宮內(nèi)膜癌中的研究進(jìn)展

陳潔，洪于賀，尹樂樂，沈媛*

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)在女性最常見的惡性腫瘤中排名第六，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，其在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率及死亡率均有上升趨勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)我國的EC發(fā)病率逐年增長3.7%[1]。EC的臨床表現(xiàn)多見陰道不規(guī)則流血、陰道排液等，晚期可出現(xiàn)惡病質(zhì)表現(xiàn)。雖然臨床上可以通過陰道流血或排液增多等癥狀來初步判斷EC，但明確診斷需要進(jìn)一步完善檢查，因部分患者對(duì)診刮、宮腔鏡等檢查存在恐懼心理而推遲檢查，延誤最佳診治時(shí)機(jī)，確診時(shí)可能已經(jīng)處于疾病晚期，從而增加了EC的病死率。經(jīng)診刮明確子宮內(nèi)膜是否存在病變時(shí)，因病灶大小不明確、取材醫(yī)師無法準(zhǔn)確掌握病灶分布位點(diǎn)，可能遺漏局限小病灶，從而增加EC漏診率，有文獻(xiàn)報(bào)道分段診刮對(duì)宮頸受累診斷的漏診率高達(dá)17.65%[2]。此外，許多發(fā)病年齡介于30～50歲的子宮內(nèi)膜不典型增生患者因有生育需求而選擇孕激素治療，可能因此漏診早期EC，錯(cuò)過治療時(shí)機(jī)。當(dāng)前治療EC仍以手術(shù)為主，根據(jù)高危因素選擇是否聯(lián)合放化療。晚期EC因擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、分化差，預(yù)后也差。盡管輔助治療使得患者的預(yù)后有所改善，但總體上5年生存率無明顯提高。因此，尋找有效的早期診斷標(biāo)志物和精準(zhǔn)的治療靶點(diǎn)極其重要。

外泌體(exosome)是細(xì)胞在受到環(huán)境刺激或活化時(shí)分泌釋放的一種脂質(zhì)雙分子層囊泡，直徑約30～100 nm，可將所攜帶的生物活性物質(zhì)，例如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)等等，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，從而在運(yùn)輸物質(zhì)、傳遞信息、監(jiān)督免疫、介導(dǎo)血管形成及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等諸多生理病理過程中扮演重要角色，是一種新的細(xì)胞間交互方式[3]。miRNA屬于非編碼RNA，長度約19～25個(gè)核苷酸，參與調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后部分[4]。外泌體源miRNA(exosomal-microRNA，exo-miRNA)是一類可調(diào)控靶基因的非編碼蛋白質(zhì)單鏈RNA分子[5]，可發(fā)揮類似RNA干擾作用，通過與靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3’非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)形成特殊的雙螺旋結(jié)構(gòu)后再解旋形成兩條單鏈RNA，其中一條單鏈RNA與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體結(jié)合，形成miRNA蛋白復(fù)合體，從而降解靶mRNA或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因的蛋白表達(dá)。目前有研究表明exo-miRNA與EC的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，可能在該疾病進(jìn)展中有重大影響。現(xiàn)對(duì)exo-miRNA在EC中的研究進(jìn)展作一綜述，以期為EC的早期診治提供新思路。

1 外泌體

外泌體是細(xì)胞主動(dòng)分泌產(chǎn)生的囊性小泡，通過細(xì)胞內(nèi)吞途徑，將胞質(zhì)中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、ctDNA及miRNA等聚集在囊泡內(nèi)，再經(jīng)過囊泡與質(zhì)膜的融合，最終裂解釋放，將其攜帶的生物活性物質(zhì)排出細(xì)胞外[6]，以自分泌、旁分泌、體內(nèi)循環(huán)等方式到達(dá)相鄰或遠(yuǎn)端的靶細(xì)胞，通過細(xì)胞膜間的直接接觸或者具有抗原活性的表面質(zhì)膜上的特異性受體傳遞信息[5]，從而起到相應(yīng)的細(xì)胞間交互作用。這種自發(fā)性分泌外泌體的生理現(xiàn)象存在于神經(jīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞中，因?yàn)橥饷隗w存在于胸水、腹水、尿液等各種體液或組織細(xì)胞中[7]，故臨床上應(yīng)用液體活檢在早期診斷腫瘤、評(píng)估疾病進(jìn)展及預(yù)后等方面具有重要價(jià)值。

此外，外泌體作為機(jī)體自身的分泌物，具有質(zhì)膜穩(wěn)定、分布廣泛、便于獲取等藥物載體的基本特征，具備毒性低、免疫原性低、滲透性良好、可定向運(yùn)送藥物等優(yōu)點(diǎn)[8]，故其可作為藥物載體的選擇之一，主要以直接轉(zhuǎn)染法、間接轉(zhuǎn)染法、穿孔[9]等3種方式運(yùn)載藥物。關(guān)于外泌體如何調(diào)控基因表達(dá)及如何應(yīng)用于腫瘤的早期診治等已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

2 外泌體源miRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控

腫瘤的發(fā)生源于細(xì)胞癌變，發(fā)展則是癌細(xì)胞惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的過程?？焖僭鲋车陌┘?xì)胞聚集后為實(shí)質(zhì)腫瘤的形成提供有利的生長微環(huán)境，而exo-miRNA在其中起調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化的作用，通過轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)胞的作用促進(jìn)腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)形成，不僅能加速正常細(xì)胞的癌變?cè)鲋?，還能改變鄰近及遠(yuǎn)處非腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性以利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。當(dāng)前已證實(shí)exo-miRNA是腫瘤細(xì)胞用于實(shí)現(xiàn)自身功能機(jī)制的重要衍生物，可調(diào)控受體細(xì)胞的信號(hào)通路及蛋白質(zhì)表達(dá)，因而其對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制引起了學(xué)者的注意。

有研究表明外泌體及其攜帶的miRNA可釋放于TME被各種鄰近細(xì)胞吸收，進(jìn)而調(diào)控腫瘤進(jìn)展[10]。exo-miRNA對(duì)腫瘤的增殖及侵襲的影響主要通過調(diào)控血管生成、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及免疫調(diào)節(jié)等來影響。Webber JP等[11]發(fā)現(xiàn)外泌體主要通過誘導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤血管形成，從而增強(qiáng)腫瘤的侵襲力。Zhang ZC等[12]發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs)介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展與exo-miRNA相關(guān)。Zhou Y等[13]研究結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞來源的外泌體miR-21可直接靶向磷酸酶基因PTEN，激活肝星狀細(xì)胞中的PDK1/AKT信號(hào)通路，將肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAFs，通過血管生成影響炎癥微環(huán)境、促進(jìn)腫瘤侵襲。在TME中，多種細(xì)胞來源的exo-miRNA被遞送至內(nèi)皮細(xì)胞，通過調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)，刺激誘導(dǎo)腫瘤血管生成，從而驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Sun X等[14]研究表明，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞來源的外泌體miR-21通過刺激miR-21/血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)/VEGF受體2這一信號(hào)通路來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力。Bao L等[15]研究顯示鼻咽癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-23a可直接靶向睪丸特異性抗原(TSGA10)，抑制靶基因表達(dá)，加速腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。

外泌體在免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間的通訊中起雙重調(diào)節(jié)腫瘤免疫的介質(zhì)作用，其將原始細(xì)胞內(nèi)的miRNA傳遞到靶器官、靶細(xì)胞中，通過調(diào)控腫瘤及其微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞的生物信息網(wǎng)絡(luò)來影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)展方向。不同腫瘤細(xì)胞來源的exo-miRNA的結(jié)構(gòu)與功能也不同，因其與腫瘤的形態(tài)、分級(jí)分期、遷移侵襲及化療耐藥等密切相關(guān)，可作為提示腫瘤進(jìn)展及治療效果的標(biāo)志物[16]。腫瘤來源的外泌體涉及腫瘤的免疫逃逸過程，主要通過影響免疫抑制細(xì)胞的激活與分化，調(diào)節(jié)抗原呈遞，從而抑制免疫細(xì)胞的活性并誘導(dǎo)相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞凋亡。Ye SB等[17]研究顯示，鼻咽癌來源的血清外泌體可將miR-24-3p轉(zhuǎn)運(yùn)至T細(xì)胞，靶向抑制成纖維細(xì)胞生長因子11介導(dǎo)的T細(xì)胞抑制，從而促進(jìn)腫瘤增殖、分化，發(fā)生免疫逃逸。此外，腫瘤細(xì)胞在快速生長過程中導(dǎo)致組織內(nèi)部缺氧，促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor，HIF-1α)表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而刺激腫瘤細(xì)胞分泌具有增強(qiáng)血管生成和轉(zhuǎn)移潛能的外泌體，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。Chen X等[18]發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p、miR-21-3p與miR-181d-5p這3種exo-miRNA在上皮性卵巢癌中因HIF-1α作用導(dǎo)致高表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)抑制蛋白4(suppressor of cytokine signaling 4，SOCS4)/SOCS5/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化，從而促進(jìn)腫瘤增殖、遷移。

3 外泌體源miRNA在子宮內(nèi)膜癌中的作用

3.1 外泌體源miRNA對(duì)子宮內(nèi)膜癌的調(diào)控

不同來源的exo-miRNA具有不同作用，同種exo-miRNA在不同的TME中作用也不同。exo-miRNA可起促癌基因的作用，也可扮演抑癌基因的角色，這可能與TME的組成成分有關(guān)，尤其是CAFs[12]。Maida Y等[19]研究發(fā)現(xiàn)Ishikawa細(xì)胞來源的外泌體攜帶的功能性miRNA會(huì)被鄰近的子宮內(nèi)膜成纖維細(xì)胞內(nèi)吞，從而改變?cè)訉m內(nèi)膜成纖維細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜。該研究結(jié)果提示EC細(xì)胞來源的外泌體和子宮內(nèi)膜成纖維細(xì)胞之間存在相互作用，exo-miRNA可作為腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié)TME的通訊介質(zhì)。Liu XJ等[20]研究表明exo-miRNA可以調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞的黏附、侵襲及血管生成能力，并能調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖與凋亡。Yan GJ等[21]研究首次發(fā)現(xiàn)miR-302簇可直接靶向Cyclin D1，間接調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1基因表達(dá)，從而抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞株Ishikawa和HEC-1B的增殖和遷移，并將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，抑制癌細(xì)胞的增殖分化以及降低致瘤性。Li YB等[22]經(jīng)過一系列檢測發(fā)現(xiàn)miR-302b-3p/302c-3p/302d-3p在EC中表達(dá)下調(diào)并改變了EC細(xì)胞系Ishikawa和HEC-1A的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，該基因簇可促進(jìn)Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞凋亡的能力，顯著抑制鋅指轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因的表達(dá)，促進(jìn)了凋亡前體蛋白Bax的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制了Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞的增殖和遷移。章燕等[23]利用miR-107抑制劑下調(diào)miR-107表達(dá)，發(fā)現(xiàn)雌激素受體α的蛋白表達(dá)增加，Ishikawa細(xì)胞的增殖遷移及侵襲能力下降，提示miR-107可能在EC的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

隨著相關(guān)研究的不斷深入，exo-miRNA對(duì)EC侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響機(jī)制會(huì)越來越清晰，這對(duì)于深化EC的臨床治療研究大有裨益。

3.2 外泌體源miRNA在子宮內(nèi)膜癌診治中的應(yīng)用

3.2.1 外泌體源miRNA可考慮作為子宮內(nèi)膜癌的生物標(biāo)記物 隨著越來越多與腫瘤相關(guān)的miRNA譜被發(fā)現(xiàn)，miRNA逐漸作為疾病診斷的生物標(biāo)志物引起了學(xué)者關(guān)注。研究表明，外泌體在體液中具有良好的穩(wěn)定性，其成分和功能與細(xì)胞來源有關(guān)，不同疾病會(huì)引起特定細(xì)胞釋放的exo-miRNA出現(xiàn)特異性表達(dá)，且囊泡形式可減少遺傳物質(zhì)受RNA酶的作用，提示exo-miRNA可作為潛在的疾病診斷生物標(biāo)志物，在疾病的早期診斷中具有重要價(jià)值。Srivastava A等[24]利用EC患者的尿液分析exo-miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)所研究的84個(gè)miRNA中有54個(gè)在qPCR中被擴(kuò)增，其中hsa-miR-200c-3p富集程度最高，提示存在差異表達(dá)的exo-miRNA可考慮作為診斷EC的生物標(biāo)志物。Tsukamoto O等[25]采用二代測序法鑒定組織及血漿中與EC相關(guān)的miRNA，在血漿中鑒定出4個(gè)與之相關(guān)的miRNAs(miR-135b和miR-205表達(dá)上調(diào)，miR-30a-3p和miR-21表達(dá)下調(diào))，而子宮切除術(shù)后血漿中與之相關(guān)的miRNAs(miR-135b、miR-205和miR-30a-3p)的循環(huán)水平明顯降低，經(jīng)受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，ROC曲線)分析顯示，血漿miR-135b和miR-205水平的曲線下面積分別為0.9722(95%CI：0.913-1.0)和1.0(95%CI：1.0-1.0)，說明以血漿中miR-135b與miR-205作為診斷EC的生物標(biāo)記物具有較高的準(zhǔn)確性，對(duì)其早期診斷以及監(jiān)測復(fù)發(fā)有較高價(jià)值。陳佳等[26]通過對(duì)比230例EC患者與250例健康女性的血清中l(wèi)ncRNA ROR及miR-29表達(dá)水平，采用ROC曲線分析兩者對(duì)EC的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)EC患者的血清lncRNA ROR與miR-29水平顯著高于健康女性，且二者表達(dá)水平在TNM Ⅰ～Ⅱ期患者中增高最為顯著，說明聯(lián)合血清lncRNA ROR與miR-29測定對(duì)于EC的早期診斷及發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測具有較高價(jià)值。

無創(chuàng)液體活檢技術(shù)是目前獲取外泌體的主要方式，不僅可以反映原發(fā)性腫瘤與繼發(fā)性腫瘤的分子特性，還能重復(fù)操作、實(shí)時(shí)活檢，獲取信息比組織活檢更快捷、全面、客觀。利用液體活檢技術(shù)、宮腔灌洗液等尋找外泌體作為EC的標(biāo)志物是診斷早期EC的發(fā)展方向。然而，由于目前缺少快速檢測外泌體表征的技術(shù)方法，用傳統(tǒng)方法獲取外泌體的純度和得率較低，難以實(shí)現(xiàn)高通量檢測，這是要以外泌體作為疾病診斷的分子標(biāo)記物亟待解決的問題[27]。

3.2.2 外泌體源miRNA應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌的治療 目前EC的治療方式仍以手術(shù)為主，化療適用于晚期、復(fù)發(fā)或具備高危因素的術(shù)后患者。腫瘤藥物治療的主要問題在于腫瘤耐藥，尤其是復(fù)發(fā)性腫瘤，因獲得性耐藥使得治療效果不理想，有研究顯示exo-miRNA在TME中的通訊作用可能是耐藥性增強(qiáng)的原因之一。Kanlikilicer P等[28]通過共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究卵巢癌中外泌體miR-1246對(duì)巨噬細(xì)胞攝取的影響，發(fā)現(xiàn)miR-1246在卵巢癌外泌體中存在過表達(dá)，并通過調(diào)控窖蛋白-1/糖蛋白/M2型巨噬細(xì)胞軸增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性，而紫杉醇聯(lián)合miR-1246抑制劑時(shí)，腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性顯著增加，說明腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的exo-miRNA可能通過調(diào)控腫瘤周圍浸潤的免疫細(xì)胞來促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，該研究也為提高腫瘤患者對(duì)化療藥物的敏感度提供了新思路。

靶向exo-miRNA治療腫瘤也是一種新型有效的治療方式。有研究表明一個(gè)miRNA可以同時(shí)靶向數(shù)百個(gè)mRNA，通過調(diào)節(jié)多個(gè)靶mRNA的轉(zhuǎn)錄后活性來影響細(xì)胞的生物學(xué)功能，提示靶向miRNA作為治療手段具有可行性[29]?；谕饷隗w可運(yùn)載與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成及耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)這一特點(diǎn)，抑制攜帶“癌基因”的外泌體生成或者攝取，促進(jìn)攜帶“抑癌基因”的外泌體的生成或攝取，也為未來外泌體應(yīng)用于腫瘤治療提供了新方向。已有相關(guān)研究表明miR-302簇可抑制EC細(xì)胞的增殖分化，顯著影響腫瘤進(jìn)展[21-22]，提示miR-302簇可作為腫瘤抑制因子用于EC的治療，構(gòu)建外泌體miR-302簇有望成為靶向治療EC的選擇之一。

此外，外泌體可作為藥物載體參與腫瘤治療。外泌體通常以3種途徑參與疾病治療，一是直接攜帶其來源母細(xì)胞中的物質(zhì)進(jìn)入對(duì)應(yīng)的受體細(xì)胞，進(jìn)而影響靶細(xì)胞功能;二是作為藥物載體將靶向藥物直接運(yùn)輸?shù)桨衅鞴倩虬屑?xì)胞，從而達(dá)到治療目的;三是對(duì)外泌體進(jìn)行一定程度的改造，增強(qiáng)其靶向性，延長其半衰期，從而持續(xù)有效地治療特定疾病。前兩種方法的缺點(diǎn)在于天然外泌體囊泡表面可能含有多種不同配體或受體分子，意味著其可能同時(shí)作用于多種受體細(xì)胞，靶向性不夠精準(zhǔn)，可控性較低；而對(duì)外泌體進(jìn)行改造雖然增強(qiáng)了靶向精準(zhǔn)性，但可能會(huì)喪失其作為內(nèi)源性物質(zhì)低免疫原性的先天優(yōu)勢(shì)，改造后的外泌體能否避免機(jī)體的免疫應(yīng)答有待進(jìn)一步研究。隨著改造技術(shù)的發(fā)展，工程化外泌體取得了一定進(jìn)展。Kemarker S等[30]研究表明，工程化的外泌體比原始外泌體的靶向治療效果更強(qiáng)，還能最小化細(xì)胞毒性，抑制腫瘤生長效果顯著。

總的來說，如何改進(jìn)藥物載體、利用exo-miRNA找準(zhǔn)治療EC的靶點(diǎn)，減少不良反應(yīng)，提高治療的有效性和特異性，是將exo-miRNA應(yīng)用于EC治療中亟待解決的問題。

4 結(jié)語

EC作為女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升，對(duì)女性健康造成了嚴(yán)重威脅。隨著人們對(duì)EC的分子機(jī)制研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)exo-miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，其在EC中的作用機(jī)制和診斷治療方面也取得了一定程度的進(jìn)展，為EC早期診斷及治療提供了新的展望，將來有可能為成為監(jiān)測疾病發(fā)生與預(yù)后的重要手段。