湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方干預(yù)新型冠狀病毒肺炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

姚昆鵬　劉起立　張道平　劉佑暉　蔡虎志　陳新宇

〔摘要〕 目的 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)研究湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方干預(yù)新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019， COVID-19）的藥物成分、作用靶點(diǎn)及潛在通路。方法 利用TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方的活性成分及藥物作用靶點(diǎn)，應(yīng)用GeneCards等平臺(tái)檢索COVID-19的疾病靶點(diǎn)，采用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)行STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）分析，使用R語(yǔ)言數(shù)據(jù)包進(jìn)行基因本體功能富集（gene ontology， GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomics， KEGG）富集分析，預(yù)測(cè)其潛在機(jī)制，運(yùn)用AutoDock Vina 1.5.6和 PyMol 2.4.0軟件對(duì)湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方中的關(guān)鍵活性成分與PPI中的核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。結(jié)果 經(jīng)過(guò)篩選，得到湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方的有效成分198種，涉及靶標(biāo)175個(gè)，“藥物-成分-靶點(diǎn)”圖中篩選出94個(gè)交集基因。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方干預(yù)COVID-19主要涉及PTSG2、HSP90AA1、ESR1等核心蛋白，共有靶標(biāo)的GO及KEGG富集分析結(jié)果主要涉及炎癥-免疫調(diào)節(jié)、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、基因調(diào)控等多種生物學(xué)途徑以及IL-17、TNF、HIF-1、AGE-RAGE等相關(guān)通路。分子對(duì)接驗(yàn)證提示槲皮素與核心靶蛋白MAPK3結(jié)合情況最佳，MAPK3為與關(guān)鍵化學(xué)成分結(jié)合活性最優(yōu)的靶蛋白。結(jié)論 湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方中主要化學(xué)成分可能作用于MAPK3、MAPK1、TP53、AP-1、p38等多種核心靶蛋白，激活/抑制IL-17、TNF等信號(hào)通路，介導(dǎo)炎癥-免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程，從而發(fā)揮干預(yù)COVID-19的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 COVID-19;湖南省;新冠肺炎新版成人預(yù)防方;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接;核心靶蛋白;信號(hào)通路

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R289? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.05.016

Network pharmacology study on the intervention of the new version of adult

prevention prescription in Hunan Province on COVID-19

YAO Kunpeng LIU Qili ZHANG Daoping LIU Youhui CAI Huzhi CHEN Xinyu

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. The First Affiliated Hospital of

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To study the drug components， targets and potential pathways of the new version of adult prevention prescription in Hunan Province on COVID-19 based on network pharmacology and molecular docking technology. Methods The TCMSP and BATMAN-TCM databases were used to screen the active components and drug targets of the new version of adult preventive prescriptions in Hunan Province on COVID-19. The disease targets of COVID-19 were searched by GeneCards and other platforms. The Cytoscape 3.8.0 software was used to construct the "drug-component-target" network diagram. The STRING database was used for protein-protein interaction （PPI） analysis. The R language packet was used for gene ontology （GO） and Kyoto encyclopedia of genes and genomics （KEGG） enrichment analysis to predict its potential mechanism. AutoDockVina 1.5.6 and PyMol 2.4.0 software were used to verify the molecular docking between the key active components in the new version of adult preventive prescriptions in Hunan Province on COVID-19 and the core proteins in PPI. Results After screening， a total of 198 active ingredients， involving 175 targets， of the new version of adult preventive prescriptions in Hunan Province on COVID-19 were obtained. In the "drug-component-target" diagram， 94 intersection genes were screened. The PPI network of the new version of adult preventive prescriptions in Hunan Province on COVID-19 was mainly involved in PTSG2， HSP90AA1， ESR1 and other core proteins. GO and KEGG enrichment analysis results of common targets were mainly involved in inflammatory-immune regulation， intracellular signal transduction， apoptosis， gene regulation and other biological pathways， as well as IL-17， TNF， HIF-1， AGE-RAGE and other related pathways. Molecular docking showed that quercetin had the best binding activity with the core target protein MAPK3， and MAPK3 was the target protein with the best binding activity of the key chemical components. Conclusion The main chemical components in the new version of adult prevention prescription in Hunan Province on COVID-19 may act on a variety of core target proteins such as MAPK3， MAPK1， TP53， AP-1 and p38， activate/inhibit signaling pathways such as IL-17 and TNF， mediate biological processes such as inflammation and immune regulation， thus playing a role in the intervention of COVID-19.78AA3A73-5F25-4904-BEF0-C2A8ADCD54D3

〔Keywords〕 COVID-19; Hunan Province; the new version of adult prevention prescription on COVID-19; network pharmacology; molecular docking; core target protein; signaling pathway

自2019年12月以來(lái)，全球已有237個(gè)國(guó)家及地區(qū)受到新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019， COVID-19）疫情的影響。截至2021年5月31日，全球共累計(jì)有170 104 245例確診患者，累計(jì)死亡人數(shù)達(dá)3 657 083人[1]。由于新型冠狀病毒（severe

acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）的高度傳染性及高度變異性，疫情雖經(jīng)短暫控制，但在全球尚未完全建立大規(guī)模群體免疫的情況下，印度變種病毒德?tīng)査致又林袊?guó)及全球若干國(guó)家[2-3]。盡管?chē)?guó)內(nèi)措施相對(duì)完善，但仍未能避免COVID-19變種病毒的侵襲，目前的防疫形勢(shì)依然嚴(yán)峻。

COVID-19歸屬于中醫(yī)學(xué)“疫病”范疇[4]。中醫(yī)藥傳承至今，積累了許多防治疫病的經(jīng)驗(yàn)，中醫(yī)藥的使用貫穿抗擊疫情的全過(guò)程。根據(jù)COVID-19的臨床表現(xiàn)，將其分為輕型（包括寒濕郁肺證、濕熱蘊(yùn)肺證）、普通型（包括濕毒郁肺證、寒濕阻肺證）、重型（包括疫毒閉肺證、氣營(yíng)兩燔證）、危重型（包括內(nèi)閉外脫證）、恢復(fù)期（包括肺脾氣虛證、氣陰兩虛證）[5]?！叭幦健保催B花清瘟膠囊、金花清感顆粒、血必凈注射液、清肺排毒湯、宣肺敗毒方、化濕敗毒方）等中藥的使用在抗擊疫情方面發(fā)揮了重要作用[6-8]。

由于德?tīng)査兎N病毒的侵襲，使得國(guó)內(nèi)防疫形勢(shì)再度嚴(yán)峻。根據(jù)時(shí)令節(jié)氣，結(jié)合本次德?tīng)査兎N病毒的特點(diǎn)，從“三因制宜”抗擊COVID-19角度出發(fā)，湖南省中醫(yī)藥管理局制訂了《湖南省新冠肺炎疫情防控中醫(yī)藥診療方案（2021年第二版）》，對(duì)臨床治療方案及預(yù)防方案作了若干調(diào)整，根據(jù)本輪疫情起于夏季，暑熱之氣盛行，擬定了湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方。目前，對(duì)于湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方的研究處在起始階段，尚待進(jìn)一步研究?；诖耍疚倪\(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以《湖南省新冠肺炎疫情防控中醫(yī)藥診療方案（2021年第二版）》中發(fā)布的新冠肺炎新版成人預(yù)防方為切入點(diǎn)，從分子層面研究新版成人預(yù)防方干預(yù)COVID-19的潛在機(jī)制，為后續(xù)研究提供一定借鑒。

1 材料與方法

1.1? 有效成分及作用靶點(diǎn)獲取

湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方系湖南省中醫(yī)藥管理局于2021年7月31日發(fā)布的《湖南省新冠肺炎疫情防控中醫(yī)藥診療方案（2021年第二版）》中所發(fā)布的新版預(yù)防方，由8味中藥組成：黃芪、防風(fēng)、金銀花、藿香、薄荷、連翹、滑石、甘草。將湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方的中藥單體分別錄入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP），設(shè)定篩選條件以獲取有效成分：口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，類(lèi)藥性（drug-likeness， DL）≥0.18;使用中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(kù)（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional chinese medicine， BATMAN-TCM），設(shè)定預(yù)測(cè)候選目標(biāo)（包括已知目標(biāo)）得分不小于每個(gè)成分得分分界的20%，Adjust P-value設(shè)為0.05，獲取候選目標(biāo)的藥物成分和相應(yīng)靶點(diǎn)。將有效成分導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取有效成分的作用靶點(diǎn)，將上述靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/），獲取靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名。

1.2? 疾病靶點(diǎn)檢索

為獲得疾病對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息，使用“COVID-19” “2019-nCoV”“Novel coronavirus pneumonia”作為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank（https：//go.drugbank.com/）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得COVID-19的疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3? 藥物-成分-靶點(diǎn)圖構(gòu)建

將湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方中藥單體對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與COVID-19的疾病靶點(diǎn)取交集，獲取藥物-疾病交集基因，繪制韋恩圖。將交集基因匯總，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，運(yùn)用內(nèi)置Network Analyzer功能，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4? 靶蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治?/p>

將交集靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），物種設(shè)定為“Homo sapiens”，最低互動(dòng)得分（combined score）設(shè)置為0.9，并去除游離節(jié)點(diǎn)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行可視化。利用CytoNCA插件，進(jìn)一步根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中心度進(jìn)行拓?fù)浞治觯@得核心靶點(diǎn)。

1.5? GO/KEGG富集分析

利用R語(yǔ)言DOSE、clusterProfiler、enrichplot、pathview等相關(guān)程序包對(duì)交集基因進(jìn)行基因本體功能富集（gene ontology， GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomics， KEGG）富集分析，選擇顯著富集的生物學(xué)過(guò)程（biolog-ical process， BP）、細(xì)胞成分（cell component， CC）、分子功能（molecular function， MF）前10項(xiàng)繪制柱狀圖，選擇顯著富集的前30條通路繪制氣泡圖。78AA3A73-5F25-4904-BEF0-C2A8ADCD54D3

1.6? 分子對(duì)接驗(yàn)證

選擇“藥物-成分-靶點(diǎn)”圖中度值排名前3的活性化合物作為小分子配體：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、漢黃芩素（wogonin），與PPI拓?fù)浞治龊螳@取的13個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的前3個(gè)靶點(diǎn)蛋白，即MAPK3、MAPK1、TP53進(jìn)行分子對(duì)接。于PubChem CID平臺(tái)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性成分的2D結(jié)構(gòu)的SDF文件，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（protein data bank， PDB）下載核心基因相關(guān)蛋白的2D結(jié)構(gòu)，使用PyMOL 2.4.0軟件去除靶蛋白中的配體和非蛋白分子（如水分子），保存為pdb格式文件。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件對(duì)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫處理，并計(jì)算蛋白質(zhì)電荷，所有配體和受體文件均保存為pdb格式。使用AutoDock Vina 1.1.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算最低結(jié)合能，使用PyMol 2.4.0軟件進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1? 有效成分及作用靶點(diǎn)獲取

共檢索到藥物成分共198種：于TCMSP平臺(tái)檢索到黃芪20種、防風(fēng)18種、金銀花23種、藿香11種、薄荷10種、連翹23種、甘草92種;根據(jù)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索滑石化合物1種。獲取有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)有其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，選擇“Reviewed”“Human”下載標(biāo)準(zhǔn)靶點(diǎn)名。匹配后刪除重復(fù)值，最終獲得靶點(diǎn)175個(gè)。

2.2? 疾病靶點(diǎn)檢索

通過(guò)檢索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)，分別得到COVID-19疾病靶點(diǎn)為1660、229、15、91、28個(gè)，篩選并去重后得到靶點(diǎn)1474個(gè)。藥物與疾病的交集靶點(diǎn)為94個(gè)（見(jiàn)圖1）。

2.3? 藥物-成分-靶點(diǎn)圖構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.8.0軟件內(nèi)置的Network Analyzer功能，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖2）。共有238個(gè)節(jié)點(diǎn)，1230條邊。據(jù)圖可知，甘草、防風(fēng)的成分對(duì)應(yīng)的相關(guān)靶基因最多，有效成分槲皮素、木犀草素、漢黃芩素分別與67、31、25個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)。其中，PTSG2（132個(gè)）是有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)量最多的基因，HSP90AA1（96個(gè)）和ESR1（95個(gè)）次之。

2.4? PPI網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治?/p>

通過(guò)STRING平臺(tái)上傳94個(gè)共同靶點(diǎn)，物種先定位“Homo sapiens”最低互動(dòng)得分設(shè)置為0.9，并去除游離節(jié)點(diǎn)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape

3.8.0進(jìn)行可視化（見(jiàn)圖3）。PPI網(wǎng)絡(luò)中涉及節(jié)點(diǎn)89個(gè)、邊397條，靶基因用節(jié)點(diǎn)表示，靶基因間的相互作用關(guān)系用邊表示。利用Cytoscape 3.8.0插件CytoNCA行拓?fù)浞治?，選擇指標(biāo)：介度中心性（betweenness centrality， BC）、接近中心性（closenesscentrality， CC）、借助度中心性（degree centrality， DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality， EC）、局部邊連通性（localaverage

connectivity， LAC）和網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality， NC），對(duì)基因相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行篩選，選擇大于所有指標(biāo)中位數(shù)的基因進(jìn)行后續(xù)分析。兩次篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：第1次，BC 28.00、CC 0.23、DC 7.00、EC 0.06、LAC 2.67、NC 3.83;第2次：BC 9.78、CC 0.60、DC 10.5、EC 0.15、LAC 6.44、NC 7.40。經(jīng)過(guò)兩次篩選，最終獲得核心基因13個(gè)，依據(jù)DC排序，核心基因分別是MAPK3、MAPK1、TP53、STAT3、JUN、MAPK14、MAPK8、AKT1、RELA、ESR1、IL2、NR3C1、EGFR（見(jiàn)圖4）。

2.5? GO及KEGG富集分析

對(duì)湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方的94個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析。借助R語(yǔ)言DOSE、clusterProfiler、enrichplot、pathview、ggplot2等程序，獲得GO富集條目2304個(gè)，其中BP、CC、MF分別為2109、56、139個(gè)。各取BP、CC、MF排名前10的GO條目繪制柱狀圖，取KEGG前30的條目繪制氣泡圖（見(jiàn)圖5）。結(jié)合文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)GO富集中炎癥-免疫調(diào)節(jié)、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、基因調(diào)控等生物過(guò)程均在湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方干預(yù)COVID-19中發(fā)揮作用。KEGG富集分析表明，通路富集主要在炎癥-免疫相關(guān)通路，如IL-17、TNF、HIF-1、VEGF等。此外，其他如糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE、皰疹病毒感染、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒感染、甲型流感、mTOR等信號(hào)通路均參與對(duì)COVID-19的干預(yù)。上述結(jié)果表明，湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方可能通過(guò)介導(dǎo)炎癥-免疫反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞活性周期等方面發(fā)揮干預(yù)COVID-19的作用。結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)主要通路進(jìn)行分析，進(jìn)一步繪制通路圖（見(jiàn)圖6）。如圖所示，AP-1、p38、IL-1、IL-8、COX2、Fos、JUN、NF-κB等靶點(diǎn)參與IL-17、TNF、HIF-1、AGE-RAGE等通路，表明上述靶點(diǎn)、通路是本研究中的關(guān)鍵部分。

2.6? 分子對(duì)接驗(yàn)證

使用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接。選擇“藥物-成分-靶點(diǎn)”圖中度值排名前3的活性化合物作為小分子配體：槲皮素、木犀草素、漢黃芩素，與拓?fù)浞治龅玫蕉戎蹬琶叭陌械鞍走M(jìn)行分子對(duì)接：MAPK3、MAPK1、TP53。計(jì)算各個(gè)蛋白與小分子配體的最低結(jié)合能（見(jiàn)表1）。一般而言，結(jié)合能越小，受體與配體的親和力越強(qiáng)，空間構(gòu)象愈穩(wěn)定。78AA3A73-5F25-4904-BEF0-C2A8ADCD54D3

結(jié)果顯示，各化學(xué)成分與靶蛋白對(duì)接的結(jié)合能均小于-7.0 kcal·mol^-1，說(shuō)明活性成分與靶蛋白結(jié)合緊密。與MAPK3親和力最高的為槲皮素，與MAPK1親和力最高的為木犀草素，與TP53親和力最高的為槲皮素。借助PyMol軟件對(duì)將分子對(duì)接驗(yàn)證可視化（見(jiàn)圖7）。

3 討論

湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方由黃芪、防風(fēng)、金銀花、藿香、薄荷、連翹、滑石、甘草8味中藥組成，具有益氣固表、辛涼御邪、清暑祛濕之功效。《素問(wèn)·熱論》云：“先夏至日者為病溫，后夏至日者為病暑?！睔q在辛丑，暑濕流連，暑熱蒸騰[9]。而湖南地區(qū)又水系密布，地處潮濕之地，又感暑熱之氣，疫癘之邪多兼夾暑熱而發(fā)，故新版成人預(yù)防方結(jié)合湖南所特有的氣候及地域特點(diǎn)，圍繞“疫病”“暑濕”而組方。方中黃芪、防風(fēng)取“玉屏風(fēng)散”之意，奏益氣固表之功。黃芪擅補(bǔ)肺脾之氣，防風(fēng)擅祛衛(wèi)表之風(fēng)，兩藥合用，則衛(wèi)氣實(shí)而風(fēng)氣去[10]。黃芪的化學(xué)成分包括多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)等，其主要包含黃芪皂苷、芒柄花素、黃芪多糖等物質(zhì)[11-12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，在機(jī)體免疫水平低下的情況下，黃芪具有提高機(jī)體免疫水平的功效，其提高機(jī)體適應(yīng)性主要通過(guò)維持自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell， NK）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）水平，調(diào)節(jié)Treg/Tδγ平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)[13]。防風(fēng)主要包含色原酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、有機(jī)酸、多糖類(lèi)、聚炔類(lèi)、甾醇類(lèi)等，目前對(duì)于防風(fēng)的研究主要集中在免疫調(diào)節(jié)、抗微生物、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛等方面[14]。在對(duì)過(guò)敏性鼻炎大鼠模型進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)多糖能改善鼻癢、流涕、打噴嚏等過(guò)敏性鼻炎癥狀，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室分析表明，防風(fēng)多糖可以上調(diào)Th向Th1分化，抑制Th2的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2淋巴細(xì)胞亞群平衡，減輕嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，降低相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，從而提高機(jī)體免疫應(yīng)答水平[15]。金銀花、連翹為歷代醫(yī)家治療外感風(fēng)熱常用之品，二者清熱解毒、疏風(fēng)散熱為佳，而銀花兼解暑熱，連翹又有散結(jié)消腫之功，再與辛涼之薄荷合用，方可御暑熱之邪。Zhou等[16]研究發(fā)現(xiàn)，金銀花介導(dǎo)miR2911從而抑制SARS-CoV-2的復(fù)制，加速感染患者的轉(zhuǎn)陰;連翹的主要化學(xué)成分包括木素類(lèi)、樹(shù)脂醇類(lèi)、樹(shù)脂酸等，具有顯著的抗病毒、抗氧化、抗腫瘤作用[17]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，連翹可以降低TNF-α、IL-1β、IL-6，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化的功效[18]。藿香為暑濕季節(jié)常用之品，功擅發(fā)表解暑、化濕止嘔?；院陡?，清熱解暑之余，兼有利尿通淋之功，合甘草清熱解毒，三藥合用，有清暑祛濕之效。隨著提取與鑒定手段的愈趨豐富，有研究發(fā)現(xiàn)，藿香的成分主要分為揮發(fā)性成分（集中在揮發(fā)油，包括廣藿香醇、廣藿香酮等）及非揮發(fā)性成分（包括田薊苷、大豆腦苷、香草酸等）[19]。體外實(shí)驗(yàn)表明，廣藿香醇對(duì)于急性淋巴髓單核白血病、結(jié)直腸癌、肺癌、淋巴瘤等疾病的體外細(xì)胞株均有廣泛抗細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制與NF-κB、p-OKM2、Caspase-3的蛋白量改變有關(guān)[20]。滑石歸屬于礦物藥的范疇，由于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，目前僅已知其為含水鎂質(zhì)硅酸鹽礦物，國(guó)內(nèi)外尚缺乏對(duì)其成分的深入研究[21]。目前，對(duì)于甘草的研究頗多，已知甘草包括化學(xué)成分400余種，主要為黃酮類(lèi)及三萜類(lèi)化合物，學(xué)者目光主要聚焦在其抗腫瘤、抗炎等方面[22]。結(jié)合上述研究結(jié)果，湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方的組方圍繞益氣固表、辛涼御邪、清暑祛濕三方面而設(shè)，其各中藥單體分別具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)、介導(dǎo)炎癥應(yīng)激的功效。綜合本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方干預(yù)COVID-19的作用發(fā)揮主要依賴于介導(dǎo)炎癥-免疫反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞活性周期?；诖送茰y(cè)，湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方抗擊SARS-CoV-2極有可能通過(guò)減輕“炎癥風(fēng)暴”，提升機(jī)體免疫水平，從而起到大規(guī)模加強(qiáng)個(gè)體免疫功能的作用。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對(duì)接技術(shù)，從分子層面對(duì)湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方干預(yù)COVID-19的潛在機(jī)制進(jìn)行探討。前文已經(jīng)對(duì)湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方的組方特色及現(xiàn)代藥理學(xué)內(nèi)涵進(jìn)行論述，可以明確的是，從組方特色及中藥單體的現(xiàn)代藥理學(xué)研究方面而言，湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方切合本次COVID-19發(fā)病的特點(diǎn)，是較為理想的預(yù)防方。然而，對(duì)于本方尚缺乏細(xì)胞、動(dòng)物、臨床方面的實(shí)驗(yàn)研究。作為中藥復(fù)方，作用機(jī)制尚不明晰，無(wú)法明確其具體作用的通路及靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方中中藥單體的有效成分槲皮素、木犀草素、漢黃芩素對(duì)應(yīng)最多的靶基因，PTSG2、HSP90AA1、ESR1對(duì)應(yīng)最多的靶點(diǎn)數(shù)。經(jīng)過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及拓?fù)浞治龊?，共篩選出MAPK3、TP53、STAT3、IL2、EGFR、JUN、AKT1、ESR1、NR3C1等13個(gè)核心靶點(diǎn)。GO與KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，炎癥-免疫調(diào)節(jié)、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、基因調(diào)控等生物過(guò)程以及IL-17、TNF、HIF-1、VEGF、AGE-RAGE、mTOR等信號(hào)通路均參與對(duì)COVID-19的干預(yù)。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，IL-17與MAPK、NF-κB等通路交互，其下游的IL-6、IL-3、IL-1β、IFN-γ、COX2、TNF-α等與炎癥刺激、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[23]。近年來(lái)，隨著免疫學(xué)研究的深入發(fā)現(xiàn)，IL-17促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞分泌集落刺激因子和前列腺素E2等的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞增殖、成熟與趨化，并調(diào)節(jié)T細(xì)胞的組織浸潤(rùn)，IL-17通路的激活與免疫反應(yīng)密切相關(guān)[24]。隨著TNF通路的激活，其下游的TNF-α、IL-5、IL-6、IL-10等靶點(diǎn)也受到不同程度的影響，在COVID-19患者中，上述炎癥因子表達(dá)增高，其預(yù)后愈差[25]。在COVID-19的發(fā)病中，“炎癥風(fēng)暴”是一個(gè)重要特點(diǎn)，機(jī)體在遭遇病原體侵襲后，免疫細(xì)胞因子與免疫細(xì)胞之間的反饋機(jī)制受到破壞，體液中產(chǎn)生大量的免疫細(xì)胞因子，導(dǎo)致持續(xù)而強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，從而加劇組織器官的損傷[26]。高通量測(cè)序表明，IL-1、IL-6、IL-10、IL-19、MCP-2、MCP-3、CXCL9等炎癥指標(biāo)在COVID-19患者血清均有不同程度的上升[27]。對(duì)持續(xù)感染的COVID-19患者進(jìn)行血清檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其N(xiāo)K細(xì)胞、CD14單核減少，而調(diào)節(jié)T細(xì)胞增加，炎癥因子如IL-2、TNF、LT-α含量下降，表明在COVID-19的持續(xù)感染下，機(jī)體的免疫功能受到抑制，存在持續(xù)的病毒脫落[28]。通過(guò)運(yùn)用中藥復(fù)方“清肺排毒湯”對(duì)COVID-19患者進(jìn)行干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)重癥患者血清中高表達(dá)的CXCR4、ICAM1、CXCL8、CXCL10、IL6、IL2、CCL2、IL1B、IL4、IFNG等基因表達(dá)受到抑制，進(jìn)一步利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行KEGG富集發(fā)現(xiàn)，TNF、IL-17、NF-κB、HIF-1、JAK-STAT、Th17細(xì)胞分化、Toll樣受體此7條通路受到不同程度的激活/抑制[29]。此外，干預(yù)AGE-RAGE等信號(hào)通路也可能起間接干預(yù)COVID-19的作用。目前，已知AGE-RAGE信號(hào)通路的激活與糖尿病的發(fā)生密不可分，其原因可能是高血糖所致非酶性糖基化反應(yīng)明顯加速AGE的生成，而前者的蓄積導(dǎo)致RAGE表達(dá)增加，加劇機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，加速細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程，導(dǎo)致異常的細(xì)胞增殖與凋亡[30]。國(guó)外一項(xiàng)對(duì)于SARS-CoV-2的轉(zhuǎn)錄組分析表明，COVID-19的感染伴隨著COX-2、IL-6、CXCL1等蛋白表達(dá)的升高，且與AGE-RAGE通路的激活呈正相關(guān)[31]。課題組綜合本研究“藥物-成分-靶點(diǎn)”分析、PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、GO/KEGG富集分析及分子對(duì)接，結(jié)合查閱文獻(xiàn)，初步提出假設(shè)：湖南省新冠肺炎新版成人預(yù)防方干預(yù)COVID-19可能與激活/抑制IL-17、TNF、HIF-1、AGE-RAGE等通路，調(diào)節(jié)下游AP-1、p38、IL-1、IL-8、COX2、Fos、JUN、NF-κB等靶點(diǎn)相關(guān)。78AA3A73-5F25-4904-BEF0-C2A8ADCD54D3

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，新版成人預(yù)防方從組方角度及物質(zhì)基礎(chǔ)上都具有針對(duì)性，對(duì)于夏季時(shí)令爆發(fā)的德?tīng)査兎N病毒應(yīng)具有較好的預(yù)防作用，從理論上為《湖南省新冠肺炎疫情防控中醫(yī)藥診療方案（2021年第二版）》中推薦的新版成人預(yù)防方的合理性提供了一定依據(jù)。然而，由于當(dāng)前人類(lèi)對(duì)COVID-19的認(rèn)識(shí)有限，且受數(shù)據(jù)庫(kù)收錄、更新?tīng)顟B(tài)限制，對(duì)藥物與疾病信息的收集尚不全面，未來(lái)尚需進(jìn)一步完善數(shù)據(jù)分析并開(kāi)展體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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（本文編輯? 匡靜之）78AA3A73-5F25-4904-BEF0-C2A8ADCD54D3