動(dòng)物源性腸球菌耐藥性和隨食物鏈傳播的研究進(jìn)展

楊鈺瑩 ， 王少林

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

腸球菌是革蘭陽性(G+)球菌，廣泛分布于自然環(huán)境及人和動(dòng)物消化道內(nèi)。腸球菌屬目前有50多 種，其中糞腸球菌和屎腸球菌占到分離菌株的80%以上，是人類臨床第三和第四大流行病原體[1]。研究表明，食品業(yè)和畜牧業(yè)是腸球菌某些致病譜系和多重耐藥菌株傳播的重要一環(huán)[2]?？咕幬镌陴B(yǎng)殖場(chǎng)的廣泛應(yīng)用，尤其是不合理使用和濫用，促進(jìn)了腸球菌耐藥性的發(fā)展。腸球菌，尤其是耐藥菌以及耐藥基因會(huì)隨動(dòng)物排出的糞便進(jìn)入環(huán)境，沿食物鏈傳播到人體[3]。在屠宰場(chǎng)屠宰過程中，糞便腸球菌會(huì)污染動(dòng)物源食品，如食用受污染的動(dòng)物性食品將對(duì)人類造成感染的風(fēng)險(xiǎn)[4]。本文綜述了動(dòng)物源性腸球菌的耐藥性和其通過食物鏈傳播的最新研究進(jìn)展。

1 腸球菌的耐藥性研究

1.1 β-內(nèi)酰胺類藥物 β-內(nèi)酰胺類藥物是人類和獸醫(yī)臨床上最重要的抗菌藥物之一。由于低親和力青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin-binding proteins,PBPs)的表達(dá)，腸球菌本身對(duì)氨芐青霉素的敏感性不高[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，臨床上超過85%的屎腸球菌對(duì)氨芐青霉素表現(xiàn)出高水平耐藥的特征，而糞腸球菌對(duì)于氨芐青霉素的高水平耐藥率則要低得多。動(dòng)物源氨芐青霉素耐藥腸球菌的報(bào)道迄今多集中在屎腸球菌，且耐藥率顯著低于人類[2]。目前關(guān)于產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶腸球菌的報(bào)道十分少見，大多來自人類的臨床分離株，且均對(duì)亞胺培南等藥物敏感，尚不構(gòu)成治療挑戰(zhàn)[6]。

1.2 糖肽類藥物 萬古霉素耐藥腸球菌(Vancomycin-resistantEnterococci,VRE)可導(dǎo)致嚴(yán)重的多重耐藥感染，是近年來的研究熱點(diǎn)。萬古霉素耐藥性由van操縱子介導(dǎo)。目前已在腸球菌中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)van操縱子(vanA、vanB、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM和vanN)及1個(gè)與萬古霉素固有耐藥有關(guān)的操縱子(vanC)。其中最常見的是vanA和vanB，在人和動(dòng)物中均表現(xiàn)出傳播和遷移能力[7]。我國(guó)暫未批準(zhǔn)糖肽類抗生素用于畜禽飼料添加，因此國(guó)內(nèi)對(duì)動(dòng)物源VRE的報(bào)道十分罕見。意大利一項(xiàng)研究顯示，自1997年歐盟禁止阿伏帕星作為飼用促生長(zhǎng)劑添加的3年間，禽類肉制品VRE的檢出率從18.8%降至9.6%[8]。丹麥的一項(xiàng)耐藥性檢測(cè)計(jì)劃顯示，禁令實(shí)施10年后養(yǎng)殖場(chǎng)豬和肉雞的VRE檢出率減少了90%[9]。另有研究表明，動(dòng)物的微生物區(qū)系在萬古霉素耐藥表型和基因型的形成和進(jìn)化中發(fā)揮著重要作用。與其他食用動(dòng)物相比，vanA-VRE更多在家禽中被發(fā)現(xiàn)。伴侶動(dòng)物以及供人類食用的肉制品中經(jīng)常檢測(cè)到vanC-VRE型和vanN-VRE型的腸球菌[10]。此外，分子分型顯示，VRE及其遺傳決定因素在動(dòng)物和人類中具有很強(qiáng)的相關(guān)性。食品動(dòng)物是一些具有重大臨床意義的van基因(如vanA、vanC)的儲(chǔ)存庫(kù)，動(dòng)物源VRE在人體腸道的瞬時(shí)定殖可導(dǎo)致van基因轉(zhuǎn)移到具有相關(guān)毒力因子的腸球菌株中[11]。

1.3 噁唑烷酮類藥物 在過去10年中耐利奈唑胺的腸球菌(Linezolid-resistantEnterococci,LRE)雖然在臨床腸球菌和葡萄球菌導(dǎo)致的感染中檢出率不到1%，但由于利奈唑胺是治療菌血癥和其他由VRE引起的嚴(yán)重感染的主要藥物，LRE受到了越來越多的關(guān)注。目前腸球菌對(duì)噁唑烷酮類抗菌藥物的耐藥機(jī)制包括23S rRNA區(qū)域的點(diǎn)突變，編碼甲基化酶的cfr基因所介導(dǎo)的耐藥和表達(dá)特異性外排泵的基因optrA介導(dǎo)的耐藥。其中optrA能夠同時(shí)介導(dǎo)腸球菌對(duì)氟苯尼考和利奈唑胺耐藥，也是第1個(gè)可介導(dǎo)對(duì)泰地唑利(新型噁唑烷酮類藥物)耐藥的基因[12]。2012年，泰國(guó)首次報(bào)道了1株臨床來源的cfr陽性的糞腸球菌，該型腸球菌(ST16)主要來源于畜禽，表示cfr可以從動(dòng)物傳播到人類[13]。2015年我國(guó)首次在臨床來源糞腸球菌中發(fā)現(xiàn)optrA，持續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物及食品來源腸球菌中optrA檢出率比臨床來源高[14]。最近一項(xiàng)研究在動(dòng)物源彎曲桿菌中檢測(cè)到了optrA基因，首次報(bào)道了optrA在革蘭陰性菌中的存在，同時(shí)研究還顯示該基因可能源于腸球菌[15]，表明動(dòng)物源腸球菌具有重要的儲(chǔ)存和傳播耐藥基因的作用。

1.4 四環(huán)素類藥物 體外試驗(yàn)表明替加環(huán)素對(duì)VRE引起的感染有治療效果。目前最常見的導(dǎo)致腸球菌對(duì)替加環(huán)素類耐藥的是與核糖體保護(hù)有關(guān)的基因[如tet(M)、tet(O)、tet(S)]、外排泵基因或酶失活基因[如tet(K)、tet(L)]?？稍谌诵箝g轉(zhuǎn)移的替加環(huán)素耐藥基因[如tet(X3)和tet(X4)]目前主要在腸桿菌和不動(dòng)桿菌中被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[16]。一項(xiàng)研究對(duì)美國(guó)2002—2014年幾種零售肉類商品中存在的腸球菌進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)大部分糞腸球菌(67.5%)和屎腸球菌(53.7%)對(duì)四環(huán)素具有耐藥性[4]。我國(guó)的流行病學(xué)調(diào)查也顯示，動(dòng)物源腸球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率超過了90%[17]。盡管這些研究中動(dòng)物源腸球菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥率不到1%，但此前四環(huán)素類藥物作為促生長(zhǎng)劑的廣泛添加和不合理使用及高度耐藥的情況，可能驅(qū)動(dòng)獲得性耐藥基因的出現(xiàn)和進(jìn)化。

1.5 其他抗菌藥物 腸球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性普遍存在，其獲得性耐藥可由各種遺傳決定因素編碼，最常見的是erm(B)，通常由Tn917攜帶，廣泛存在于人類和動(dòng)物的分離株中[18]。oqxAB基因編碼RND(Resistance-nodulation-division)型外排泵，是質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥的主要機(jī)制之一,介導(dǎo)對(duì)多種藥物的交叉耐藥。最近Yuan等[19]首次從豬糞糞腸球菌分離株中檢出oqxAB基因。oqxAB基因在腸球菌中的流行提示腸球菌可能成為oqxAB基因的儲(chǔ)存庫(kù)，并對(duì)公眾健康構(gòu)成潛在威脅。

腸球菌對(duì)不同抗菌藥物的耐藥機(jī)制總結(jié)見表1。

表1 腸球菌對(duì)不同抗菌藥物的耐藥機(jī)制

2 腸球菌在食物鏈中的分布與傳播

2.1 腸球菌的分布特征 腸球菌是一種腸道共生菌，在人類和各種動(dòng)物腸道內(nèi)廣泛分布。哺乳動(dòng)物胃腸道的定植腸球菌主要是糞腸球菌和屎腸球菌，其中糞腸球菌在腸道中的流行率及其在腸道內(nèi)的持留能力比屎腸球菌更高[20]。Zaheer等[18]在2年多時(shí)間里采集了8 430株不同生態(tài)位的腸球菌，其中糞腸球菌和屎腸球菌是城市污水(90%)和臨床人類分離株(99%)的主要菌種，而希拉腸球菌在牛(92%)和飼養(yǎng)場(chǎng)集水池(60%)中占主導(dǎo)地位。其他研究也表明希拉腸球菌是牛糞中最豐富的腸球菌種類[21]。盲腸球菌是成年雞胃腸微生物區(qū)系中腸球菌的主要組成菌屬。近年來，具有多重耐藥性的致病性盲腸球菌在全球肉雞生產(chǎn)系統(tǒng)中迅速傳播，成為骨骼病變和敗血癥病變導(dǎo)致死亡的重要原因[22]。犬、貓腸道腸球菌菌群以糞腸球菌和屎腸球菌為主，其次為平倉(cāng)腸球菌[23-24]。在豬腸道內(nèi)主要分布的腸球菌有糞腸球菌、屎腸球菌、堅(jiān)忍腸球菌和希拉腸球菌[21,25]。Medeiros等[26]在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn),海洋野生動(dòng)物腸道中糞腸球菌和蒙氏腸球菌含量最高。此外，腸球菌常常存在于環(huán)境和動(dòng)物食品中。Soares-Santos等[27]從89份動(dòng)物性食品中分離得到132株腸球菌，其中大多數(shù)是糞腸球菌。Manero等[25]在一項(xiàng)豬場(chǎng)環(huán)境腸球菌種群分布的研究中發(fā)現(xiàn)，豬飼料中腸球菌的流行率達(dá)到94%，在施用豬糞的相應(yīng)農(nóng)田作物的土壤中腸球菌的檢出率達(dá)50%，優(yōu)勢(shì)菌種都是屎腸球菌、糞腸球菌和希拉腸球菌。

2.2 腸球菌的食物鏈傳播 食物鏈中分布著攜帶多種耐藥基因和毒力基因的腸球菌，這些腸球菌可以通過食物鏈從動(dòng)物轉(zhuǎn)移到人體，對(duì)人類健康產(chǎn)生潛在的威脅。近年來利用分子流行病學(xué)手段，尤其是基于全基因組測(cè)序(Whole genome sequencing, WGS)技術(shù)的組學(xué)研究手段越來越多地被應(yīng)用到腸球菌在食物鏈上的分布特點(diǎn)和追蹤研究中。此前對(duì)于腸球菌的分子分型手段主要是脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)和多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)。從人類和畜禽中發(fā)現(xiàn)的糞腸球菌ST16譜系被認(rèn)為是人畜共患病譜系，參與了目前所有動(dòng)物用抗生素的耐藥性傳播[28]。由于腸球菌尤其是糞腸球菌的基因組存在高度重組的現(xiàn)象，研究人員開發(fā)了核心基因組MLST(Core genome MLST,cgMLST)的分型方法，將7個(gè)左右的管家基因擴(kuò)展到多達(dá)1 423個(gè)，提高了分型效果[29]?；赪GS的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)和貝葉斯聚類分析(Bayesian analysis of population structure,BAPS)等方法對(duì)腸球菌進(jìn)行了不同譜系的分類，并研究其宿主特異性和生態(tài)位差異，逐漸成為食物鏈傳播風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的重要研究手段。最近一項(xiàng)研究對(duì)來自人醫(yī)臨床、環(huán)境和動(dòng)物(包括豬、雞、寵物)的1 644株屎腸球菌進(jìn)行了泛質(zhì)粒組研究，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒含量是驅(qū)動(dòng)屎腸球菌生態(tài)位特異性的主要基因組成分[30]。Elghaieb等[31]在來自畜禽和零售肉類的不同糞腸球菌克隆株中鑒定出相同的Tn6674類似元件，揭示食物鏈在optrA耐藥基因傳播中的潛在作用。Zaheer等[18]對(duì)從人類、肉牛、屠宰場(chǎng)和環(huán)境中分離得到的8 430株腸球菌的系統(tǒng)基因組學(xué)研究顯示，牛源與人源分離到的糞腸球菌和希拉腸球菌的耐藥基因、毒力基因和質(zhì)粒的共享有限，表明來自肉牛的細(xì)菌可能不是人類相關(guān)腸球菌的重要來源或儲(chǔ)存庫(kù)。未來有必要進(jìn)行更多基于WGS的流行病學(xué)研究，以檢測(cè)和評(píng)估各種動(dòng)物源腸球菌在食物鏈中的傳播情況。

3 展望

腸球菌是人類和動(dòng)物腸道微生物的重要組成部分，并且廣泛分布于各種自然環(huán)境中。自20世紀(jì)80年代以來，腸球菌嚴(yán)重感染的發(fā)生率和病死率明顯升高，并且由于腸球菌的固有耐藥和獲得性耐藥使許多常用抗菌藥物在治療腸球菌感染時(shí)失敗。畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗菌藥物的濫用給腸球菌造成了選擇性壓力，使得耐藥腸球菌的數(shù)量逐年增加，新的耐藥機(jī)制不斷涌現(xiàn)。我國(guó)即將迎來全面禁止飼用抗菌藥物添加的時(shí)代，未來有必要對(duì)動(dòng)物源腸球菌的耐藥性進(jìn)行持續(xù)性監(jiān)測(cè)，以期對(duì)腸球菌耐藥性的發(fā)生、不同抗菌劑的使用對(duì)耐藥性的影響以及限制耐藥性發(fā)展的最合適方案有進(jìn)一步的了解。此外，雖然腸球菌在不同生態(tài)位的種群組成和結(jié)構(gòu)有所不同，但是大量研究表明，食品和畜牧業(yè)促成了腸球菌某些致病譜系和多重耐藥菌株從動(dòng)物源向人體的傳播，這將給臨床腸球菌感染的治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。在“One Health”的背景下，有必要進(jìn)行更多的研究，特別是利用基于WGS的基因組學(xué)手段來探究腸球菌耐藥基因的出現(xiàn)、進(jìn)化及從動(dòng)物源向人類傳播的風(fēng)險(xiǎn)。