黃芩總黃酮對(duì)大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織Camk2d、Ppp3r2表達(dá)的影響

劉大凱, 鄭希福, 李安石

(1. 大連市第二人民醫(yī)院關(guān)節(jié)外科,遼寧 大連 116011； 2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外科,遼寧 大連 116011)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是一種臨床常見(jiàn)的慢性、進(jìn)行性膝關(guān)節(jié)軟骨疾病[1]。研究認(rèn)為在膝關(guān)節(jié)損傷過(guò)程中,炎癥因子如白細(xì)胞介素1β (IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)在軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的分解代謝中發(fā)揮重要作用,從而導(dǎo)致KOA的發(fā)展[2]。然而,炎癥因子如何將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到軟骨細(xì)胞并調(diào)節(jié)炎癥基因仍不清楚。鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱδ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡdelta,Camk2d)與ECM分解和軟骨降解密切相關(guān)[3]。蛋白磷酸酶3調(diào)節(jié)亞基2(protein phosphatase 3 regulates subunit 2,Ppp3r2)可以特異性地抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase, MMP)的活性,維持健康軟骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[4]。軟骨細(xì)胞在受促炎因子刺激后,合成并分泌大量的Camk2d,同時(shí)抑制Ppp3r2的表達(dá)[5]。非甾體抗炎藥可減輕KOA的相關(guān)癥狀,但長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致某些不良反應(yīng),替代藥物仍需進(jìn)一步研究[6]。目前,植物源藥物作為一種可靠、有效的KOA替代藥物已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。黃芩總黃酮是從中藥黃芩中提取的主要有效成分,可以減輕炎癥反應(yīng)來(lái)改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[7],但其對(duì)KOA的作用研究較少。因此,本研究觀察黃芩總黃酮對(duì)大鼠KOA軟骨組織中Camk2d和Ppp3r2表達(dá)的影響,探討黃芩總黃酮治療KOA的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(遼)2021-0010,體重(220±20)g,在環(huán)境溫度(23±2)℃、相對(duì)濕度60%～70%、光照12 h明暗交替的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器

黃芩總黃酮(南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司)；塞來(lái)昔布(美國(guó)輝瑞制藥公司)；注射用戊巴比妥(上海上藥新亞藥業(yè)有限公司)；木瓜蛋白酶(上海藍(lán)季生物有限公司)；蘇木素染色液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；RIPA裂解液(上海生工生物工程有限公司)；Camk2d、Ppp3r2和β-肌動(dòng)蛋白抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；HRP標(biāo)記親和純化山羊抗鼠IgG二抗(武漢艾美捷科技有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(美國(guó)GE公司)；EG1150型包埋機(jī)、ASP300S型組織脫水機(jī)和RM2255型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理配套設(shè)備(德國(guó)Leica公司)；奧林巴斯CX43顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；HBS-1096B型酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Bio-Rad垂直電泳儀(美國(guó)BD公司)；電泳儀(北京市六一儀器廠)；MicroPublisher 成像系統(tǒng)(美國(guó)Q-IMAGING 公司)。

1.3 分組及造模

將大鼠均分為陰性對(duì)照組、模型組、黃芩總黃酮低劑量組、黃芩總黃酮中劑量組、黃芩總黃酮高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組,每組10只。陰性對(duì)照組大鼠在第1天、第4天和第7天向膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水(0.3 mL/只),其他組大鼠分別在相同時(shí)點(diǎn)向膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%木瓜蛋白酶(0.3 mL/只)制備KOA模型。造模2周后,陰性對(duì)照組和模型組大鼠灌胃給予生理鹽水(1 mL/100 g),黃芩總黃酮低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠灌胃給予黃芩總黃酮,劑量分別為12.5、25和50 mg/kg[8],陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃給予塞來(lái)昔布(10 mg/kg)[9],1次/d,連續(xù)14 d后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.4 病理學(xué)觀察

麻醉處死大鼠,切開(kāi)左側(cè)膝關(guān)節(jié)皮膚及皮下組織,不打開(kāi)關(guān)節(jié)囊,剔除周?chē)募∪饨M織,通過(guò)保留脛骨端近端和股骨遠(yuǎn)端以截取整個(gè)膝關(guān)節(jié),進(jìn)行甲醛固定24 h,用乙二胺四乙酸脫鈣4周,經(jīng)脫水、包埋、切片(3 μm),進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色,用顯微鏡觀察組織病理改變。按 Makin′s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)膝關(guān)節(jié)病理變化進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分得分越高,病變?cè)絿?yán)重。

1.5 ELISA法檢測(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量

分離右側(cè)膝關(guān)節(jié),剪取部分關(guān)節(jié)軟骨組織,用預(yù)冷生理鹽水沖洗3次,制成勻漿,超低溫冷凍后,高壓成粉末,按1 mL/100 mg的比例加入生理鹽水,離心取上清液,然后將相應(yīng)一抗稀釋至10 μg/mL,加入到96孔板中(0.1 mL/孔),4 ℃孵育過(guò)夜,洗滌3次,加上清液0.1 mL于上述反應(yīng)孔中,37 ℃孵育1 h；加入新配置相對(duì)應(yīng)的二抗(0.1 mL/孔),孵育1 h；加入新配置的3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺底物溶液(0.1 mL/孔)進(jìn)行顯色20 min；加入0.05 mL硫酸終止反應(yīng),于450 nm處測(cè)各孔光密度(D)值,計(jì)算軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織中Camk2d和Ppp3r2的蛋白表達(dá)

剪取部分關(guān)節(jié)軟骨組織,用預(yù)冷生理鹽水沖洗3次,制成勻漿,按1 mL/100 mg的比例加入RIPA裂解液,離心后取上清液,調(diào)整蛋白濃度,加入1/5體積的5×緩沖液,沸水變性,進(jìn)行電泳(20 μg/孔),蛋白質(zhì)經(jīng)8% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,然后用5%脫脂牛奶封閉,將膜與Camk2d和Ppp3r2抗體4°C孵育過(guò)夜,洗膜后與HRP標(biāo)記親和純化山羊抗鼠IgG二抗孵育30 min,顯色后用MicroPublisher 成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度強(qiáng)度(以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參對(duì)照)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色結(jié)果

陰性對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整, 軟骨表面光滑；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨纖維結(jié)締組織增生,結(jié)構(gòu)不清,伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；黃芩總黃酮低劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨纖維結(jié)締組織增生,細(xì)胞排列無(wú)規(guī)則,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),但較模型組明顯改善,隨著黃芩總黃酮?jiǎng)┝康脑黾?病變改善越明顯；其中黃芩總黃酮高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)、層次明顯改善,炎癥細(xì)胞顯著減少。見(jiàn)圖1。

A:陰性對(duì)照組；B:模型組；C:黃芩總黃酮低劑量組；D:黃芩總黃酮中劑量組；E:黃芩總黃酮高劑量組；F:陽(yáng)性對(duì)照組

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)Makin′s評(píng)分比較

與陰性對(duì)照組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織Makin′s評(píng)分明顯升高(P<0.05)；與模型組相比,黃芩總黃酮各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠軟骨組織Makin′s評(píng)分明顯降低,且黃芩總黃酮各劑量組效應(yīng)呈劑量依賴性(P<0.05)；黃芩總黃酮高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組Makin′s評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較

與陰性對(duì)照組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯升高(P均<0.05)；與模型組相比,黃芩總黃酮各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯降低,且黃芩總黃酮各劑量組效應(yīng)呈劑量依賴性(P<0.05)；黃芩總黃酮高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組間各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

a: P<0.05,與陰性對(duì)照組比較；b: P<0.05,與模型組比較；c: P<0.05,與黃芩總黃酮低劑量組比較；d: P<0.05,與黃芩總黃酮中劑量組比較

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量

2.4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中Camk2d和Ppp3r2蛋白表達(dá)比較

與陰性對(duì)照組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中Camk2d表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),Ppp3r2表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比,黃芩總黃酮各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中Camk2d表達(dá)水平明顯降低,Ppp3r2表達(dá)水平明顯升高,且黃芩總黃酮各劑量組效應(yīng)呈劑量依賴性(P<0.05)；黃芩總黃酮高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組間Camk2d和Ppp3r2表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3和表2。

①:陰性對(duì)照組；②:模型組；③:黃芩總黃酮低劑量組；④:黃芩總黃酮中劑量組；⑤:黃芩總黃酮高劑量組；⑥:陽(yáng)性對(duì)照組

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中Camk2d和Ppp3r2蛋白相對(duì)表達(dá)

3 討論

KOA是一種慢性關(guān)節(jié)炎,其特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨退行性變和缺乏,軟骨下骨和關(guān)節(jié)邊緣骨質(zhì)增生,表現(xiàn)為生化代謝紊亂和關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)的損傷,局部結(jié)構(gòu)軟骨損傷合并滑膜炎癥和關(guān)節(jié)囊纖維增生,最終導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和功能障礙,可能導(dǎo)致殘疾[10-11]。本研究中病理結(jié)果和Makin′s評(píng)分結(jié)果均顯示,黃芩總黃酮對(duì)大鼠KOA具有治療作用,且黃芩總黃酮治療效果與塞來(lái)昔布相當(dāng),表明黃芩總黃酮對(duì)臨床治療KOA具有一定的潛力。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,在靜止?fàn)顟B(tài)下,NF-κB與NF-κB抑制蛋白(nuclear factor-kappa B inhibitor,IκB)結(jié)合后以非激活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到各種因素如IL-1β和TNF-α的刺激時(shí),所產(chǎn)生的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)迅速激活了細(xì)胞質(zhì)中IκB激酶的磷酸化,最終導(dǎo)致IκB的泛素化和隨后的降解。抑制因子IκB的降解可導(dǎo)致NF-κB的活化,NF-κB易位至細(xì)胞核。這一過(guò)程最終導(dǎo)致MMP-13的激活,這被認(rèn)為是KOA治療的潛在靶點(diǎn)[12]。IL-1β在軟骨細(xì)胞中誘導(dǎo)miR-146a表達(dá)[13],同時(shí),機(jī)械壓力損傷和滑膜或半月板分泌的促炎細(xì)胞因子可能參與了miR-146a在KOA軟骨中的誘導(dǎo)。 miR-146a被認(rèn)為是炎癥的負(fù)調(diào)控因子,通過(guò)促進(jìn)miR-146a的表達(dá)可抑制小鼠的關(guān)節(jié)破壞,而Camk2d和Ppp3r2是miR-146a的調(diào)控靶點(diǎn)[14]。ECM降解是導(dǎo)致KOA發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵過(guò)程。Camk2d對(duì)軟骨ECM降解作用巨大,Camk2d與軟骨膠原溶解密切相關(guān),軟骨膠原溶解是關(guān)節(jié)疾病中關(guān)鍵的蛋白水解事件,本質(zhì)上是不可逆的[15]。Camk2d可以通過(guò)細(xì)胞外間隙的蛋白水解來(lái)激活MMP-13。MMP-13是最有效的膠原Ⅱ降解酶,其過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明,骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中Camk2d水平升高[16]。體外實(shí)驗(yàn)表明,IL-1β可顯著提高人軟骨肉瘤SW1353細(xì)胞中MMP-13的mRNA和蛋白水平[17]。Ppp3r2是Camk2d的抑制劑,在正常軟骨中,Camk2d和Ppp3r2之間的平衡至關(guān)重要。Ppp3r2的降低可以增加Camk2d的活性,加速ECM的降解。Ppp3r2/Camk2d平衡可被軟骨組織中的炎癥因子破壞,最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎[18]。Ppp3r2在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中表達(dá)降低,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的Ppp3r2/Camk2d平衡失調(diào),Ppp3r2表達(dá)增加可緩解骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的病理變化[19]。本研究結(jié)果顯示,黃芩總黃酮增加KOA模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中Ppp3r2的蛋白表達(dá),降低Camk2d的蛋白表達(dá),對(duì)KOA發(fā)揮治療作用。

綜上所述,黃芩總黃酮對(duì)KOA大鼠具有治療作用,其機(jī)制可能是黃芩總黃酮增加軟骨組織中Ppp3r2表達(dá),降低Camk2d表達(dá),抑制了軟骨組織的炎癥反應(yīng)。研究結(jié)果為黃芩總黃酮治療KOA提供了理論基礎(chǔ)。