富含亮氨酸重復序列蛋白 1 通過上調哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達促進乳腺癌細胞遷移和侵襲

王樂, 朱孝仁, 彭詩晴, 陳敏斌

(1. 江蘇大學醫(yī)學院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學附屬昆山第一人民醫(yī)院腫瘤科,江蘇 昆山 215300)

乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤[1-2]。乳腺癌轉移是長期以來腫瘤基礎和臨床研究的重要癌癥特征[3]。研究發(fā)現,在最初診斷和治療后的幾個月或幾年內,乳腺癌細胞可以轉移至其他部位[4-7],如肝臟[8]、大腦[9]、骨骼[10]或肺部[11]等。另有研究表明,伴有遠處轉移的乳腺癌患者預后差[12],復發(fā)率高[13],生存期短[14]。目前認為,多個促癌基因過度表達及活化是發(fā)生乳腺癌浸潤、轉移和進展的主要原因[15-16]。

富含亮氨酸重復序列蛋白1(leucine-rich repeat protein 1, LRR1) 基因所編碼的蛋白質含有一個富含亮氨酸的重復序列,對于腫瘤轉移的調控具有重要作用[17]。臨床研究表明,LRR1在侵襲性胃癌患者血清中呈高表達[18]。另有研究發(fā)現,LRR1長鏈非編碼 RNA 可以促進胃癌侵襲[19]。目前,關于LRR1和乳腺癌轉移間的相關性尚不清楚,本研究擬以乳腺癌 MDA-MB-231、HCC70 細胞株為研究對象,探討LRR1對乳腺癌細胞的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器

人乳腺上皮MCF-10A細胞系購于上海富衡細胞庫；人乳腺癌MDA-MB-231、HCC70細胞系購于上海生命科學研究院細胞資源中心。PBS、胎牛血清(美國Hyclone公司)；HitransG病毒感染試劑 (A/P) 購自上海吉凱基因科技有限公司；逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；四甲基乙二胺(碧云天生物技術有限公司)；MEM、1%青霉素/鏈霉素、胰酶、溴酚藍、二甲基亞砜、Triton X-100 (美國Sigma公司)；BCA蛋白定量試劑盒、離心機、CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺(山東博科生物產業(yè)有限公司)；凝膠成像儀(美國Analytikjena公司)；電泳上樣緩沖液、TEMED(碧云天生物技術有限公司)；脫脂奶粉(美國BD公司)；PVDF 膜(美國Millipore公司) ；兔抗人LRR1、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, m-TOR)、β-肌動蛋白一抗,羊抗兔二抗(英國Abcam 公司)。轉染序列均由吉凱基因公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及慢病毒轉染

1.2.1 細胞培養(yǎng) 在培養(yǎng)基中加入100 ng/mL霍亂毒素配制成完全培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人乳腺上皮MCF-10A 細胞；用含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的 DMEM,于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人乳腺癌 HCC70 和 MDA-MB-231 細胞。

1.2.2 細胞分組及轉染 取“1.2.1”乳腺癌MDA-MB-231和HCC70細胞,分為干擾對照組、LRR1干擾組、LRR1過表達組和空載體對照組,分別轉染LRR1干擾對照序列(TTCTCCGAACGTGTCACGT)、LRR1干擾序列(GTGGTCTTAGTAGATAATT)、LRR1過表達序列(AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAAGCTACACTGTGAGGTGGAG)和空載體序列(TCCTTGTAGTCCATACCCTTTAACATATCAGAGGAATT-AACATAAC)。每孔加入適量完全培養(yǎng)基,接種于6孔板,每孔細胞數5×105個,培養(yǎng)12 h左右；取1.5 mL無酶EP管,加入100 μL無血清培養(yǎng)基,再加入2 μL Lipofectamine 2000并輕輕混勻配置成a液；取無菌1.5 mL EP管,加入100 μL無血清培養(yǎng)基,加入LRR1干擾序列或者干擾對照序列,混勻配置成b液；再加入LRR1過表達序列或者空載體對照序列,混合配置成c液,將a、b液以及a、c液混合,室溫放置20 min形成轉染復合物；當細胞密度達30%～50%時,每孔加入200 μL轉染復合物,置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3 Transwell 實驗檢測乳腺癌細胞遷移能力

取“1.2.2”4組轉染細胞接種于24孔板,培養(yǎng)過夜；每孔加入0.6 mL含10%胎牛血清的 DMEM, 37 ℃孵育過夜；胰酶消化并離心；取0.2 mL細胞混懸液沿著Transwell 小室的側壁勻速注入標記好的相應24孔板中,靜置2 min；37 ℃培養(yǎng)24 h；10%甲醇固定15 min；0.1%結晶紫染色30 min；光鏡下觀察膜背面侵襲細胞數。

1.4 Transwell 實驗檢測乳腺癌細胞侵襲能力

取“1.2.2”轉染細胞接種于24孔板,培養(yǎng)過夜；每孔加入0.6 mL預熱的含有10%胎牛血清的DMEM, 37 ℃孵育過夜；每孔用預冷的槍頭吸取0.03 mL Matrigel 膠沿著小室側壁緩慢注入Transwell 小室；37 ℃孵育2 h；胰酶消化并離心；加入4 mL含有1%胎牛血清的DMEM進行重懸,取細胞混懸液加入Transwell小室底部,靜置2 min；于37 ℃孵育24 h ；PBS清洗2次；每孔加入1 mL細胞固定液常溫固定30 min；PBS清洗2次；每孔加入1 mL結晶紫常溫染色30 min；PBS清洗3次；小室自然風干；刮除小室上層未穿過小室孔膜的乳腺癌細胞；光鏡下觀察膜背面侵襲細胞數。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測乳腺癌細胞LRR1和m-TOR蛋白表達

1.5.1 LRR1蛋白表達檢測 取“1.2.1”乳腺癌MDA-MB-231和HCC70細胞和人乳腺上皮MCF-10A細胞,接種于6孔板,保證細胞數>1×106個,置于冰上,每孔按照細胞數加入0.09 ～ 0.15 mL細胞裂解液,裂解細胞15 min；12 000 r/min離心15 min,BCA法蛋白定量；行10% SDS-PAGE,80 V電泳,當蛋白條帶至分離膠時換成110 V,電泳2 h左右；110 V轉膜2 h至PVDF膜；10%脫脂牛奶4 ℃封閉120 min；分別加入兔抗人LRR1抗體、β-肌動蛋白抗體(內參),均 1 ∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜；1% PBST洗膜3次；4 ℃孵育二抗(1 ∶1 000稀釋)2 h；ECL液曝光和顯影,Image J軟件進行灰度掃描,計算目的條帶的相對灰度值。

1.5.2 m-TOR蛋白表達檢測 取“1.2.2”轉染細胞,檢測m-TOR蛋白表達,其中兔抗人m-TOR蛋白1 ∶1 000稀釋,其余方法同“1.5.1”。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 LRR1在人乳腺癌細胞中呈高表達

蛋白免疫印跡結果顯示,人乳腺癌MDA-MB-231、HCC70細胞中LRR1表達顯著高于人乳腺上皮MCF-10A細胞(t=-13.472,-12.270,P均<0.01)。見圖1。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測不同乳腺細胞中LRR1表達

2.2 LRR1對乳腺癌細胞遷移能力的影響

在乳腺癌MDA-MB-231、HCC70細胞中,與干擾對照組相比,LRR1干擾組細胞遷移數明顯減少(t=18.939,10.070,P均<0.01)；與空載體對照組相比,LRR1過表達組細胞遷移數明顯增加(t=-22.840,-33.954,P均<0.01)。見圖2。

圖2 各組乳腺癌細胞遷移能力比較(×100)

2.3 LRR1對乳腺癌細胞侵襲能力的影響

在乳腺癌MDA-MB-231、HCC70 細胞中,與干擾對照組相比,LRR1干擾組細胞侵襲數明顯減少(t=18.059,6.860,P均<0.01)； 與空載體對照組相比,LRR1過表達組細胞侵襲數明顯增加(t=-24.050,-12.072,P均<0.01)。見圖3。

圖3 Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力(×100)

2.4 LRR1對乳腺癌細胞m-TOR 表達的影響

在乳腺癌MDA-MB-231、HCC70細胞中,與干擾對照組相比,LRR1干擾組m-TOR表達水平顯著降低(t=7.804,7.496,P均<0.01)；與空載體對照組比較,LRR1過表達組m-TOR表達水平明顯增高(t=-10.405,-7.031,P均<0.01)。見圖4。

圖4 蛋白印跡實驗檢測各組細胞m-TOR蛋白表達

3 討論

以往研究發(fā)現,LRR1高表達與乳腺癌患者不良預后相關[20]。本研究結果發(fā)現,LRR1在乳腺癌細胞中呈高表達,與之前報道一致[21]。由此提示,LRR1可能作為乳腺癌新的診斷分子標志物,其高表達極有可能參與調控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。此外,本研究結果顯示, LRR1高表達可促進乳腺癌細胞遷移和侵襲,由此提示,在乳腺癌進展中,LRR1可能作為促癌因子發(fā)揮作用。然而,在腎細胞癌中LRR1高表達則抑制腫瘤進展[22],這可能與腫瘤的異質性以及不同的分子調控機制有關。

LRR1可通過參與蛋白質的泛素化過程和蛋白酶體降解[23-24],進而影響細胞的生物學功能。本研究發(fā)現,LRR1干擾后m-TOR表達顯著降低；而過表達則相反；由此提示LRR1可能通過調節(jié)m-TOR表達促進乳腺癌侵襲和轉移。既往研究發(fā)現,m-TOR異?；罨纱龠M前列腺癌細胞轉移[25]；另有研究表明激活細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)/m-TOR信號通路可以促進肝癌細胞轉移[26]。然而,LRR1是否直接靶向調節(jié)m-TOR表達促進乳腺癌的轉移尚未明確,具體機制有待后續(xù)深入研究。

綜上所述, LRR1可能作為促癌因子通過調節(jié)m-TOR表達進而調控乳腺癌細胞的遷移和侵襲。但是,本研究僅在體外乳腺癌細胞中進行,后續(xù)有待在臨床樣本中研究LRR1對乳腺癌的診斷價值。此外,LRR1與m-TOR在乳腺癌中的生物學功能以及相關信號轉導通路的激活有待后續(xù)進一步研究。