龍眼干制前后緩解小鼠疲勞作用的研究

高慧穎，姜 帆

（1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福州 350003；2福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，福州 350013）

0 引言

龍眼(Dimocarpus longan Lour.)又名桂圓，是中國南方的特色藥食同源果品，素有“南人參”的美稱，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載久服桂圓可以輕身不老通神明，是深受消費者喜愛的滋補佳品[1-2]。龍眼果肉含有豐富的化學(xué)成分，其中生物活性成分多樣，如多糖、黃酮、多酚等[3]。其藥理活性研究顯示，龍眼具有抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強免疫力、緩解焦慮等功能[4-5]。疲勞作為機體內(nèi)在保護機制，是一種復(fù)雜代謝活動。長期疲勞會讓人精神不振，內(nèi)分泌紊亂、免疫力低，身體處于亞健康狀態(tài)，嚴(yán)重時可引發(fā)器質(zhì)性疾病。緩解疲勞的活性成分是近年國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。已證實的具有緩解運動疲勞的活性成分有生物活性肽類和氨基酸、多糖、多酚、生物堿等，它們都具有較強的抗氧化能力[6-7]。研究推測運動疲勞時人體內(nèi)的氧化還原平衡被破壞，產(chǎn)生的自由基和活性氧不能及時清除，從而感到疲勞，通過補充外源性的抗氧化劑達(dá)到緩解疲勞的效果[8]。譚飔等[9]研究表明蜀冠龍眼熱風(fēng)干制后果肉多酚含量明顯降低，抗氧化活性顯著下降。王詩琪等[10]分析了新鮮和熱風(fēng)干制后儲良龍眼多糖的抗氧化和免疫活性，結(jié)果顯示干制后多糖的清除自由基能力明顯減弱，但免疫活性增強。聶英濤等[11-12]發(fā)現(xiàn)新鮮龍眼多糖在體外試驗中可增強抗氧化能力，動物試驗中明顯延長小鼠負(fù)重游泳時間，小鼠尿素氮、乳酸、丙二醛含量降低，明顯緩解小鼠運動疲勞。同時，周嘉華等[13]證實龍眼干多糖、郭超萍等[14]證實龍眼干果肉水提取物均具有明顯的抗疲勞作用。宮亞東等[15]制備的枸杞龍眼復(fù)合運動飲料也可顯著延長小鼠負(fù)重游泳時間。前期研究證實新鮮龍眼和干制龍眼中均含有豐富的緩解疲勞的活性成分，且具有緩解運動疲勞的效果。但未見對同一龍眼品種干制前后緩解疲勞差異的對比報道。本試驗擬通過給小鼠喂食同一品種的新鮮龍眼和龍眼干粉，對比小鼠負(fù)重游泳力竭時間和血清生化指標(biāo)的差異，評價龍眼干制前后緩解疲勞的效果，為今后提高龍眼生物活性的加工利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

2020年9月福建省莆田市華亭鎮(zhèn)宮利村國領(lǐng)農(nóng)場采集新鮮龍眼樣品，品種為傳統(tǒng)焙干良種‘烏龍嶺’，挑選成熟、無病蟲害、正常發(fā)育的果實用于樣品制備。

鮮龍眼凍干粉的制備：新鮮龍眼快速轉(zhuǎn)移到實驗室去皮去核，-40℃預(yù)凍24 h，冷阱溫度-45℃、真空度10 Pa升華24 h，溫度55℃真空度10 Pa解析干燥5 h[16]。凍干果肉立即破壁粉碎后備用。

龍眼干凍干粉的制備：新鮮龍眼放入80℃熱風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，去皮去核得到果肉，真空冷凍干燥方法同鮮龍眼凍干粉。

凍干粉按照1:10加蒸餾水充分混合后，7000 rpm離心10 min，取上清液45℃真空濃縮至3.3 mL/g保存待用。

1.2 試驗動物

SPF級雄性ICR小鼠，20～22 g，許可證號碼SCXK（滬）：2017-0005，合格證號：0036802，購自上海斯萊克試驗動物有限責(zé)任公司。

動物飼養(yǎng)條件：溫度(26±1)℃，濕度50%～60%，12 h交替照明/黑暗，自由攝食、飲水。試驗地點為福建省中醫(yī)藥研究院動物實驗室，于2020年11月完成。

1.3 試劑和儀器

洋參含片，廣東康富來藥業(yè)有限公司，批號：KJ003；ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：LOT20201211A。

FD-1D-50型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；HS0950全自動料理機，西屋廚房小家電有限公司；BSA電子分析天平，德國賽多利斯集團；UPW-20N型超純水機，北京歷元電子儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；HWS-24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CLARIO star多功能酶標(biāo)儀，德國BMG Labtech公司；BS400全自動生化儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 動物分組及給藥 ICR雄性小鼠試驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，按照體重隨機分成4組，每組10只，分別為空白對照組（蒸餾水）、陽性對照組（洋參含片，0.2 g/kg）、鮮龍眼組(6 g/kg)、龍眼干組(6 g/kg)。試驗過程中，按0.2 mL/10 g的體積灌胃，每天1次，連續(xù)給藥21天。

1.4.2 小鼠各生化指標(biāo)的測定

體重測定[17]：分別在第1、7、14、21天給藥1 h后稱量小鼠的質(zhì)量，計算凈體重增率，數(shù)據(jù)保留至0.1 g。

負(fù)重游泳試驗[17]：于末次給藥1 h后，將為小鼠質(zhì)量4%的鉛塊系于尾部，放入水深40 cm，水溫(25±1)℃的游泳池中負(fù)重游泳。記錄自開始至頭部沉入水中，10 s仍不能返回水面的時間，即小鼠的力竭游泳時間。

血尿素氮和血乳酸脫氫酶含量測定[17]：負(fù)重游泳休息60 min后立即眼眶采血，4℃3500 rpm離心10 min，收集血清，按照試劑盒要求檢測血尿素氮和血乳酸脫氫酶含量。

肝糖原含量測定[17]：眼眶采血完畢處死小鼠，取肝臟組織勻漿，按照試劑盒的要求檢測肝糖原含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析選用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件完成，獨立樣本的t檢驗差異顯著性，結(jié)果用x±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼干和鮮龍眼對試驗小鼠體重的影響

灌胃給藥后各組試驗小鼠體重增加呈相同的趨勢（表1）。給藥21天后龍眼干組的試驗小鼠體重從(22.7±0.9)g增加到(33.4±1.6)g，提高了47.1%，高于鮮龍眼組(44.9%)和陽性對照組(46.5%)。但與空白對照組相比，3個試驗處理組的小鼠體重均差異不顯著(P＞0.05)，說明龍眼干制前后對試驗小鼠體重增加無明顯的影響。

表1 龍眼對試驗小鼠體重的影響

2.2 龍眼干和鮮龍眼對試驗小鼠力竭游泳時間的影響

游泳時間延長是運動耐力加強的直接、客觀指標(biāo)，可以直觀反映受試藥品的抗疲勞試驗效果[17]。試驗小鼠灌胃給藥龍眼后力竭游泳時間出現(xiàn)不同程度延長（圖1）。龍眼干組小鼠的力竭游泳時間為(1322.5±309.3)s，比空白對照組相比延長59.3%，達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，接近陽性對照組；而鮮龍眼組小鼠的力竭游泳時間比空白對照組相比延長40.7%(P＜0.05)。表明龍眼可以顯著延長試驗小鼠的力竭游泳時間，其中龍眼干效果更好，表現(xiàn)出更好的緩解疲勞潛力。

圖1 龍眼對試驗小鼠力竭游泳時間的影響

2.3 試驗小鼠游泳后肝糖原含量的變化

糖原是運動能量的重要來源，其含量直接影響機體運動能力，被作為評價疲勞發(fā)生快慢或程度的生化指標(biāo)[18]。龍眼干和鮮龍眼均可以提高受試小鼠游泳后血清中肝糖原的含量（圖2）。分析表明，龍眼干組比空白對照組小鼠血清中肝糖原含量提高34.7%，方差分析達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，明顯高于鮮龍眼組(18.7%)。說明龍眼干比鮮龍眼能提供更多的肝糖原，以維持機體正常的運動功能。

圖2 試驗小鼠游泳后肝糖原含量的變化

2.4 試驗小鼠游泳后血尿素氮含量的影響

血尿素氮是運動后的代謝產(chǎn)物，可以反映機體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解、合成代謝狀況和肌肉細(xì)胞大強度運動后的損傷及恢復(fù)情況，被用來評價機體在運動情況下體力負(fù)荷的承受能力[18]。試驗結(jié)果顯示龍眼干和鮮龍眼均可以有效地降低小鼠血尿素氮的含量（圖3）。龍眼干組試驗小鼠的血尿素氮含量比空白對照組降低13.8%，高于鮮龍眼組(12.1%)，方差分析均達(dá)到顯著差異水平(P＜0.05)，與陽性對照組一致。

圖3 試驗小鼠游泳后血尿素含量的變化

2.5 試驗小鼠游泳后血乳酸脫氫酶(LDH)含量的影響

乳酸脫氫酶的功能是減少運動后乳酸在肌肉中的堆積。研究表明，陽性對照組、龍眼干組和鮮龍眼組給藥后均可以提高小鼠血清中LDH的含量（圖4）。分析表明，龍眼干組中LDH含量比空白對照組提高35.8%(P＜0.05)，而鮮龍眼組則提高35.9%(P＜0.01)。說明龍眼能顯著增加小鼠LDH總活力，有效地清除游泳后機體的代謝產(chǎn)物，延緩疲勞的發(fā)生，鮮龍眼組的效果更佳。

圖4 試驗小鼠游泳后LDH含量的變化

3 討論

3.1 龍眼的緩解疲勞功效

疲勞是機體不能持續(xù)其機能在一定水平上或不能維持預(yù)定運動強度的一種狀態(tài)，主要表現(xiàn)為倦怠、乏力、煩躁，工作效率下降，身體與精神狀態(tài)不佳，若長期積累不及時消除，可逐漸發(fā)展成為慢性疲勞綜合征，危害身心健康[19]。隨著全球化經(jīng)濟發(fā)展，快節(jié)奏的生活方式引發(fā)亞健康群體逐漸增大。據(jù)不完全統(tǒng)計，中國處于亞健康的人群超過半數(shù)，而且群體數(shù)量還在增加。亞健康人群的最典型特征就是容易產(chǎn)生疲勞感、免疫力低下等[20-21]。龍眼是中醫(yī)中常用于養(yǎng)心安神、強魄健體的一味主藥，近年在治未病方面應(yīng)用較多[22]。本試驗結(jié)果表明灌胃干制龍眼果肉小鼠的力竭游泳時間最長，與陽性對照洋參含片無差異，這一結(jié)論為中醫(yī)中用龍眼作為主藥治療亞健康疾病提供理論依據(jù)。

3.2 龍眼干制前后緩解疲勞的差異

研究發(fā)現(xiàn)灌胃新鮮龍眼小鼠的力竭游泳時間、血乳酸脫氫酶含量顯著高于對照組，血尿素氮含量顯著低于對照組，這與聶英濤等[11]試驗中新鮮龍眼多糖在低中高劑量組抗疲勞作用的研究結(jié)果一致，也與以龍眼汁為主要成分運動功能飲料延長小鼠負(fù)重游泳時間的結(jié)論[15]一致。推測多糖是新鮮龍眼緩解運動疲勞的主要活性成分之一，也可能和龍眼中豐富的哌啶、氨基酸、黃酮等代謝組分[23]有關(guān)。

課題組前期研究顯示龍眼果肉中的可溶性糖為葡萄糖、果糖、蔗糖，干制后糖組分不變，果糖、葡萄糖的占比提高，蔗糖占比降低[24]。本研究顯示小鼠灌胃龍眼干后，其肝糖原含量極顯著高于新鮮龍眼組，與陽性對照組無差異，推測可能與干制后龍眼果實中糖原合成底物之一的葡萄糖等含量增加有關(guān)。因為長時間緊張運動導(dǎo)致體力的衰竭總是和肌糖原的耗竭同時發(fā)生[25]，龍眼干可能增加肝糖原儲備或/和減少運動時肝糖原的消耗來提供更多能量，從而抵抗疲勞的產(chǎn)生。

本研究中龍眼干組的試驗劑量為6 g/kg，該劑量條件下可以極顯著促進肝糖原積累，延長負(fù)重游泳時間，與郭超萍等[14]高劑量組(9 g/kg)的結(jié)論一致。而在降低血尿素氮含量，提高乳酸脫氫酶含量的指標(biāo)上，與郭超萍等[14]中劑量組(4.5 g/kg)的結(jié)論一致，比高劑量組的效果差。體外試驗結(jié)果顯示龍眼干制后多糖、多酚的DPPH、ABTS、FRAP和清除羥自由基能力均有減弱的結(jié)論[9-10]不一致。但與韓苗苗等[26]的研究結(jié)果龍眼干燥處理后多糖的DPPH、羥自由基清除能力、FRAP能力增強的結(jié)論一致。推測干燥過程中高溫促進美拉德反應(yīng)的發(fā)生，果肉中的蛋白質(zhì)和多糖或美拉德產(chǎn)物進一步聚合，生成噻吩、噻唑、吡咯等雜環(huán)化合物增強清除自由基的效果，還可能生成吡咯酮、還原酮類、脫氧果糖嗪等來提高總抗氧化能力[27-28]。龍眼中已經(jīng)鑒定出9大類23個亞類共706種成分[23,29]，今后將對龍眼干制前后代謝成分進行分析和功能鑒定，也將探討干制過程中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的變化，以期明確龍眼的緩解疲勞機制并篩選出對應(yīng)的功能因子。

4 結(jié)論

本研究通過小鼠的負(fù)重游泳試驗說明龍眼果肉干制前后均對小鼠的體重?zé)o影響，均具有明顯的緩解運動疲勞效果。龍眼干制后緩解運動疲勞的效果顯著優(yōu)于新鮮龍眼，兩者緩解疲勞的機制存在差異。新鮮龍眼主要通過顯著降低血尿素氮的含量和血乳酸脫氫酶的積累來延長小鼠的力竭游泳時間達(dá)到緩解運動疲勞。龍眼干則主要通過顯著提高小鼠血清中的肝糖原含量，降低血尿素氮含量來延長力竭游泳時間達(dá)到緩解運動疲勞。該試驗結(jié)果也佐證了傳統(tǒng)藥典以龍眼干果肉入藥的合理性。